液體活檢在胃癌診療中的研究進(jìn)展

蔣 婷 王 平 黃新恩

2020年全球有超過108萬新發(fā)胃癌病例，約77萬死亡病例，且胃癌發(fā)生率還在不斷上升[1]。由于胃癌癥狀的非特異性和篩查條件限制等原因，多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。因此，選擇并開發(fā)合適的早期胃癌的篩查方法成為當(dāng)前刻不容緩的問題。目前胃癌應(yīng)用于臨床的篩查方法包括幽門螺桿菌血清學(xué)、血清胃蛋白酶原檢測(cè)、間接上消化道系列和內(nèi)鏡檢查，但這些方法都有其局限性[2]。例如，作為診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，上消化道內(nèi)鏡結(jié)合病理活組織檢查較易發(fā)生穿孔、出血等風(fēng)險(xiǎn)。現(xiàn)在臨床上胃癌早期檢測(cè)最常用的腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)199、CA724、CA125、CA242、CA50，以及胃蛋白酶原和甲胎蛋白(AFP)。然而，這些傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物的特異性和敏感度欠佳，到目前為止，沒有一種是胃癌診斷所特有的。

近年來，由于液體活檢較傳統(tǒng)組織活檢具有操作簡(jiǎn)便、非侵入性、可以動(dòng)態(tài)觀察等優(yōu)勢(shì)而日益受到關(guān)注。液體活檢的對(duì)象原則上是任何可能含有腫瘤遺傳物質(zhì)的體液樣本，例如血液、尿液、唾液或腦脊液等，其中以血液樣本的研究最為廣泛。液體活檢主要檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、外泌體、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)及微囊泡等。本文概述了液體活檢在胃癌早期診斷、治療、預(yù)后中的潛在臨床應(yīng)用，以及臨床常規(guī)實(shí)施液體活檢前仍需克服的障礙。

一、液體活檢技術(shù)

液體活檢是指對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外囊泡、核酸等生物液體進(jìn)行取樣，并對(duì)其基因組或蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行評(píng)估。隨著微流控芯片的細(xì)胞分離技術(shù)及分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新，如下一代測(cè)序(next generaton sequencing，NGS)和液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(droplet digital PCR，ddPCR)，基于液體活檢的個(gè)性化醫(yī)療有望逐步成為現(xiàn)實(shí)。對(duì)于臨床醫(yī)生來說，液體活檢可用于篩查并診斷癌癥、評(píng)估預(yù)后、確定治療靶點(diǎn)、預(yù)測(cè)治療的有效性、監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷和治療耐藥性等多個(gè)方面[3]。通過非侵入性技術(shù)在不同的生物體液中測(cè)定和鑒定生物學(xué)標(biāo)志物，液體活檢已被證明可有效應(yīng)用于不同類型的腫瘤，包括肝癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤和胰腺癌等，但是在胃癌中的研究較少[4]。

二、液體活檢常用生物學(xué)標(biāo)志物

1.CTCs：CTCs起源于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移的癌性病變，和形成新的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),因此在疾病進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。CTCs最常用的細(xì)胞病理學(xué)定義是: 這是一種具有圓形或卵形形態(tài)的細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)可見圓形或卵形核，與其他血細(xì)胞的區(qū)別在于其上皮標(biāo)志物包括上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecules, EpCAM)和細(xì)胞角蛋白(cytokeratin, CK)的陽性表達(dá)以及白細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD45的陰性表達(dá)[5]。CTCs在形態(tài)學(xué)上分為兩類，即單一CTCs和簇狀CTCs。癌癥轉(zhuǎn)移通常是通過簇類CTCs發(fā)生的，因此臨床生物學(xué)標(biāo)志物如腫瘤標(biāo)志物和放射診斷特征是為檢測(cè)簇類CTCs的替代標(biāo)志物[6]。CTCs通常在每毫升外周血中少于一個(gè)單位，因此血液中CTCs的檢測(cè)需要敏感度、特異性和可重復(fù)性高的方法。免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)和半自動(dòng)化免疫磁分離系統(tǒng)(CellSearch)均已用于檢測(cè)CTCs。CellSearch是目前唯一獲得美國FDA批準(zhǔn)的CTCs分離設(shè)備。CTCs檢測(cè)對(duì)癌癥患者預(yù)后的試驗(yàn)表明，大量的CTCs與治療反應(yīng)差、總體生存期縮短、疾病侵襲性、轉(zhuǎn)移增加、復(fù)發(fā)時(shí)間減少相關(guān)[7]。

2.ctDNA：在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中，細(xì)胞凋亡或壞死以及外泌體可能會(huì)釋放細(xì)胞游離DNA (cfDNA)到血液中，而來源于腫瘤的cfDNA，又稱循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA)。ctDNA是存在于血漿或血清中的單鏈或雙鏈DNA。早期研究表明，ctDNA具有許多與腫瘤相關(guān)的分子特征，如單核苷酸突變、甲基化變化和腫瘤衍生序列等[8]。推測(cè)ctDNA是通過易感細(xì)胞的致瘤轉(zhuǎn)化而分泌的信號(hào)分子，驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移。已有研究發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)合ctDNA與蛋白質(zhì)生物標(biāo)記，單一檢測(cè)可以篩查多種癌癥類型。一般來說，ctDNA的使用提供了一種成本效益高、敏感度高的工具，是一種具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的微創(chuàng)方法，包括以下幾種：①早期癌癥篩查;②檢測(cè)治療效果;③識(shí)別治療靶點(diǎn);④評(píng)估預(yù)后和腫瘤復(fù)發(fā)情況;⑤實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)耐藥[9]。

3.miRNA：microRNAs是一類長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA (ncRNA)，通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-utr)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，導(dǎo)致其翻譯抑制或降解。miRNAs是信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子，因此參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和遷移等多種過程。目前，有許多與胃癌發(fā)展相關(guān)的microRNA已被鑒定，其中一些與Wnt/β-catenin、PI3K/Akt/mTOR、RAS/RAF/EKK/MAPK、NF-κB、TGF-β和JAK/STAT信號(hào)通路的關(guān)系被追蹤。一些miRNA在細(xì)胞過程中具有多向作用。根據(jù)已發(fā)表的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA最常與Wnt/β-catenin通路相互作用，或在與其他通路相互作用時(shí)影響激活EMT的基因。在大多數(shù)情況下，與化療耐藥性相關(guān)的miRNA作用于凋亡調(diào)節(jié)因子，并與PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)[10]。與蛋白質(zhì)或lncRNA比較，miRNA具有耐核糖核酸酶降解和在生物樣品中穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，是生物學(xué)標(biāo)志物研究領(lǐng)域中具有吸引力的靶點(diǎn)。

4.外泌體：外泌體是一種直徑為30～140nm的膜結(jié)合顆粒，起源于大型多泡體(MVBs)。外泌體可通過MVBs與質(zhì)膜融合釋放到細(xì)胞外環(huán)境中,也可以大量釋放在各種生物液體中，如血漿、尿液、唾液、腹腔積液和支氣管肺泡灌洗液。目前外泌體的提取方法分為微分超離心法、密度梯度/緩沖離心法、尺寸排斥層析法、沉淀法、免疫親和捕獲法、微流控法等，其中微分超離心法因其提取純度較高為研究者最常用的方法[11]。與其他液體活檢來源比較，外泌體具有顯著的優(yōu)勢(shì)，如穩(wěn)定性高、易于鑒別、獲取方便、診斷準(zhǔn)確性高等。最初人們認(rèn)為外泌體只參與去除不必要的分子，但此后許多研究闡明了外泌體在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的復(fù)雜功能。外泌體可以呈現(xiàn)親本細(xì)胞甚至靶細(xì)胞的特異性表面蛋白，從而實(shí)現(xiàn)起源特異性外泌體的分離，并預(yù)測(cè)器官特異性轉(zhuǎn)移[12]。與CTCs和ctDNA比較，腫瘤外泌體作為預(yù)后和治療指導(dǎo)生物學(xué)標(biāo)志物主要取決于其蛋白和miRNA表達(dá)譜。因此，鑒于外泌體在細(xì)胞-細(xì)胞通信和腫瘤特異性內(nèi)容方面的關(guān)鍵作用，外泌體是一種很有前途的生物學(xué)標(biāo)志物，可用于早期腫瘤檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和藥物治療計(jì)劃。

三、液體活檢在胃癌診療中的臨床應(yīng)用

1.早期篩查及診斷：Kang等[13]納入了116例接受胃切除術(shù)的胃癌患者和31例健康志愿者，在胃切除術(shù)前采集外周血，采用離心微流控系統(tǒng)檢測(cè)CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)CTCs水平為2個(gè)單位/7.5ml時(shí)，區(qū)分胃癌與健康對(duì)照組的敏感度和特異性分別為85.3%和90.3%，且超過80%的早期(T1或N0)胃癌患者可檢測(cè)到CTCs。在另一項(xiàng)研究中，使用一種新型楔形微流控芯片檢測(cè)到胃癌患者2ml外周血中CTCs的陽性率為75%。在此項(xiàng)研究中，CTCs被證實(shí)與腫瘤分化、淋巴血管浸潤(rùn)和分期有關(guān)[14]。因此，CTCs檢測(cè)作為胃癌早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物具有潛在的價(jià)值。有研究確定了3種特異性的miRNAs: hsa-miR-320a、hsa-miR-1260b和hsa-miR-6515-5p，它們?cè)谖赴┗颊叩难鍢颖局酗@著高表達(dá)，具有高敏感度，為胃癌的診斷提供了一種新的簡(jiǎn)單而有效的方法[15]。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNA-196a可以區(qū)分癌前病變、低級(jí)別瘤變、高級(jí)別瘤變和早期胃癌患者與健康對(duì)照組，特別是健康參與者與胃發(fā)育不良和早期癌癥患者。目前還沒有針對(duì)胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastric neuroendocrine neoplasms,g-NENS)的循環(huán)診斷生物學(xué)標(biāo)志物，Dou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-202-3p在1型g-NENS腫瘤組織中過表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)受試者血清中的miRNA-202-3p水平，發(fā)現(xiàn)患者組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，敏感度和特異性分別為88.9%和77.8%，提示miRNA-202-3p對(duì)診斷 1型g-NENS具有潛在價(jià)值。但是miRNA-202-3p是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞增生的生物學(xué)標(biāo)志物還是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的特異性生物學(xué)標(biāo)志物還需要進(jìn)一步的研究[17]。此外，血漿外泌體lncUEGC1在區(qū)分Ⅰ期胃癌患者與健康人群或癌前病變方面的診斷價(jià)值高于血清CEA，提示外泌體可能是一種高敏感、無侵襲性的胃癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物[18]。

2.指導(dǎo)治療：Wang等[19]研究證明了縱向ctDNA測(cè)序有望預(yù)測(cè)曲妥珠單抗治療下HER-2陽性轉(zhuǎn)移性胃癌患者的腫瘤收縮和進(jìn)展，從而為耐藥的基因改變提供新的思路。Zhang等[20]報(bào)道了胃癌患者中miR-939水平與局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療耐藥呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)進(jìn)一步的功能研究表明，miR-939的過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來增強(qiáng)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的化療敏感度。Fan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Cbl原癌基因B (Cbl-b)作為miR-940相互作用的泛素化信號(hào)轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子5a (STAT5a)的靶基因，下調(diào)STAT5a和抗程序性死亡配體-1 (PD-L1)的表達(dá)，而miR-940/Cbl-b/STAT5a/PD-L1軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，所以類似的研究可能為胃癌基于miRNA的免疫治療提供一些新思路。外泌體被認(rèn)為是基于RNA的治療策略的高效運(yùn)載工具，因此外泌體已被用于運(yùn)送生物分子和用于癌癥治療。體外實(shí)驗(yàn)表明，外泌體中裝載的anti-miR-214能與細(xì)胞融合，調(diào)控潛在靶點(diǎn)，降低細(xì)胞活力，抑制遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由于腫瘤中miR-214的下調(diào)和對(duì)靶蛋白的過表達(dá)，尾注射anti-miR-214可在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)胃癌對(duì)DDP的化療耐藥并抑制腫瘤生長(zhǎng)，提示這可能是治療順鉑難治性GC的一種替代方法[22]。抗癌蛋白也可以通過外泌體傳遞并發(fā)揮腫瘤抑制作用。有研究證實(shí)，胃上皮分泌并內(nèi)化了攜帶抑癌GKN1蛋白的外泌體，可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制胃腫瘤的發(fā)生，這表明其在胃癌治療中的臨床應(yīng)用[23]。

3.評(píng)價(jià)治療效果:研究表明，ctDNA可能是一個(gè)有用的術(shù)后標(biāo)志物，并可以指導(dǎo)輔助治療，且化療后的ctDNA狀態(tài)與手術(shù)后的疾病狀態(tài)有更強(qiáng)的相關(guān)性，并有可能為進(jìn)一步的治療提供信息[24]。在Liu等[25]開展的研究中，基線CTC數(shù)量少或化療第1個(gè)周期后CTC計(jì)數(shù)下降的晚期胃癌患者可能從姑息性化療中獲益顯著，同時(shí)低CTC計(jì)數(shù)(≤2個(gè)單位/5ml外周血)的患者與高CTC計(jì)數(shù)(>2個(gè)單位/5ml外周血)的患者比較，中位無進(jìn)展生存期和中位總生存期(median overall survival，mOS)明顯更長(zhǎng)[25]。因此，CTCs計(jì)數(shù)可作為一個(gè)良好的化療監(jiān)測(cè)指標(biāo)和理想的預(yù)后指標(biāo)。一項(xiàng)回顧性研究納入了116例新確診的胃腺癌患者，發(fā)現(xiàn)CTCs陽性組與CTCs陰性組治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12.6個(gè)月 vs 31.6個(gè)月，P<0.01;12.4個(gè)月 vs 24.2個(gè)月，P=0.002)。兩個(gè)化療療程后，病情進(jìn)展組CTCs數(shù)量明顯增加(P=0.002)，而非病情進(jìn)展組CTCs數(shù)量減少(P=0.02)。因此，CTCs的變化與治療反應(yīng)密切相關(guān)(P=0.004)，可作為評(píng)估化療效果的輔助手段，引導(dǎo)后續(xù)方案的早期調(diào)整[26]。

4.預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后：液體活檢在預(yù)測(cè)胃癌患者不良預(yù)后方面具有重要作用。一項(xiàng)前瞻性研究通過檢測(cè)分子殘留疾病(MRD)，發(fā)現(xiàn)所有在術(shù)后立即檢測(cè)到ctDNA的患者最終都經(jīng)歷了復(fù)發(fā)且術(shù)后縱向隨訪中任何時(shí)間的ctDNA陽性均與較差的術(shù)后無病期和總生存期相關(guān)。在以治療為目的的局部胃癌患者中，這些結(jié)果表明，ctDNA檢測(cè)的MRD可以識(shí)別患者的復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)，并有助于在輔助治療環(huán)境中加強(qiáng)治療以提高生存率[27]。近期一項(xiàng)研究采用ddPCR定量68例胃癌和食管癌患者血漿中的miRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21-5p、miR-148a-3p、miR-146a-5p、miR-141-3p和miR-218-5p在接受一線治療藥物順鉑和吉西他濱的晚期胃癌患者中沒有預(yù)后和(或)預(yù)測(cè)價(jià)值，但高水平的miR-200c-3p顯示出OS惡化的趨勢(shì)，提示循環(huán)miRNAs可能對(duì)改善患者姑息治療選擇有預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值[28]。Zhao等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，GC組的外泌體HOTTIP表達(dá)水平通常上調(diào)，其表達(dá)水平與侵襲深度、TNM分期顯著相關(guān)。另外，外泌體HOTTIP水平升高與總生存期較差顯著相關(guān)(P<0.001)，使外泌體HOTTIP成為胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.027)。

綜上所述，液體活檢作為組織活檢的一種替代方法，是一種微創(chuàng)、廉價(jià)、可重復(fù)的技術(shù)，可以促進(jìn)胃癌的篩查和早期診斷，為胃癌患者的臨床分期提供更多信息。此外，基于血液的液體活檢有助于監(jiān)測(cè)胃癌的疾病進(jìn)展、治療療效、預(yù)后和獲得性化療耐藥。在未來，醫(yī)生可以通過液體活檢，根據(jù)實(shí)時(shí)的基因信息，以個(gè)性化醫(yī)療的方式為患者選擇最合適的治療方案。然而，液體活檢在臨床廣泛應(yīng)用前仍有一些實(shí)際問題需要解決。潛在的挑戰(zhàn)可能包括樣本中生物學(xué)標(biāo)志物數(shù)量少、缺乏分析共識(shí)、臨床驗(yàn)證和監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)可等。在此背景下，進(jìn)行大量的前瞻性臨床試驗(yàn)是至關(guān)重要的。然而，液體活檢從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到床邊需要更大規(guī)模和多中心的試驗(yàn)來證實(shí)它的優(yōu)勢(shì)。此外，液體活檢的方法很難統(tǒng)一，每種方法都有其特定的檢測(cè)限制、敏感度和特異性。不同液體活檢平臺(tái)的結(jié)果很難進(jìn)行比較，在應(yīng)用于常規(guī)診斷之前，需要進(jìn)行室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(external quality asseeement,EQA)研究。目前液體活檢在臨床中應(yīng)用有限，但隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和新型生物學(xué)標(biāo)志物的出現(xiàn)，液體活檢將擁有更廣闊的應(yīng)用前景。