外泌體攜帶的microRNAs在乳腺癌中的作用

廖若蕙，沈國(guó)雙

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺疾病診療中心，青海 西寧 810000）

乳腺癌（breast cancer）是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的首要原因，自1989 年到2017 年全球女性乳腺癌發(fā)病率上升了40%。2020 年由美國(guó)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計(jì)乳腺癌發(fā)病率約占女性惡性腫瘤的30%，死亡率約占女性惡性腫瘤的15%[1]。外泌體最初被認(rèn)為是從腫瘤細(xì)胞系釋放的含有5-核苷酸酶活性的微囊泡[2]，隨著研究不斷深入，近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外泌體是一種細(xì)胞外囊泡（EVs），膜直徑為30～100 nm，呈杯狀外觀[3]，幾乎所有的真核細(xì)胞都能分泌外泌體，且在癌細(xì)胞中的表達(dá)量相比于正常體細(xì)胞更高[4，5]。外泌體包裹了許多生物大分子，包括非編碼基因家族（microRNA，lncRNA）、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等[6]。miRNA 是在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)結(jié)合其靶信使RNA 的3'-UTR 來(lái)抑制表達(dá)，其功能障礙會(huì)干擾致癌或抑癌靶基因的表達(dá)，這與癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[7]?，F(xiàn)有研究表明，miRNAs 可以封裝在外泌體中由腫瘤細(xì)胞分泌到腫瘤微環(huán)境中，促進(jìn)腫瘤與基質(zhì)的相互作用；或釋放到主要的遠(yuǎn)處器官進(jìn)行循環(huán)，以進(jìn)行隨后的轉(zhuǎn)移[8]。本文主要概述乳腺癌中外泌體miRNAs 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲、治療等方面的重要作用，以期今后為臨床應(yīng)用這些潛在的生物標(biāo)志物提供參考。

1 外泌體miRNA 在乳腺癌生長(zhǎng)增殖中的作用

1.1 營(yíng)養(yǎng)代謝是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要條件 腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中需要大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)支持其能量需求和生物合成。Yan W 等[9]研究發(fā)現(xiàn)將含有高或低水平miR-105 的外泌體（Exosome，Ev）注射到小鼠乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)部位后，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）模型中乳酸、乙酸和谷氨酸的細(xì)胞內(nèi)水平都升高；將高水平組miR-105 外泌體與其他對(duì)照組相比，該組小鼠乳腺癌生長(zhǎng)速度和乳腺癌細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)。體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，外泌體miR-105 重編程的CAFs 可產(chǎn)生更多代謝產(chǎn)物滋養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)其生長(zhǎng)。

1.2 向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)移促進(jìn)癌癥進(jìn)展 Wang B 等[10]發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶的miR-1910-3p 能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞向乳腺正常上皮細(xì)胞的增殖和遷移。在體外，富含miR-1910-3p 的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)移到正常乳腺上皮細(xì)胞中，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)，其通過(guò)下調(diào)肌小管相關(guān)蛋白3，激活NF-κB 和Wnt/βcatenin 信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。該研究表明，高水平的miR-1910-3p 可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡；而低水平的miR-1910-3p 表達(dá)可降低自噬，增加細(xì)胞凋亡，抑制其增殖和遷移能力。

1.3 抑制局部免疫促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng) Xing F 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者體內(nèi)X-滅活特異性轉(zhuǎn)錄本（X inactivate-specific transcript，XIST）顯著下調(diào)，XIST 的缺失增加了外泌體miR-503 的分泌，同時(shí)外泌體miR-503 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB 通路，將小膠質(zhì)細(xì)胞從M1 型轉(zhuǎn)化為M2 型。M2 巨噬細(xì)胞可以通過(guò)表達(dá)細(xì)胞程式死亡-配體1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）來(lái)抑制T 細(xì)胞免疫[12，13]，進(jìn)而增強(qiáng)其PD-L1 的表達(dá)，抑制局部免疫，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

2 外泌體miRNA 在乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲中的作用

2.1 外泌體miRNA 是腫瘤轉(zhuǎn)移的介質(zhì) 許多研究表明，外泌體miRNA 在癌癥轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用。Singh R 等[14]比較了轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231 細(xì)胞和非惡性人正常乳腺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在144 個(gè)與癌癥相關(guān)的miRNA 中，內(nèi)源性的miR-10b 在MDA-MB-231 細(xì)胞中顯著表達(dá)，而在非惡性人正常乳腺細(xì)胞中表達(dá)極低。同樣，miR-10b 在細(xì)胞外（即外泌體）也有類(lèi)似的表達(dá)模式，這表明miR-10b 可以被MDAMB-231 細(xì)胞活躍分泌。該研究還發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-10b 可以從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，表明miRNAs 可以通過(guò)外泌體在各種類(lèi)型細(xì)胞間水平轉(zhuǎn)移，證明其在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。

2.2 外泌體miRNA 介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸 誘導(dǎo)免疫抑制可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲，骨髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）在腫瘤逃離宿主免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用[15]。Jiang M 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以分泌大量miR-181a 和miR-9，阻斷這些外泌體的釋放可完全減弱miRNAs 介導(dǎo)的對(duì)MDSCs 發(fā)育的調(diào)控。這兩種miRNAs 通過(guò)增強(qiáng)MDSCs 原位浸潤(rùn)使未成熟MDSCs 擴(kuò)增，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫逃逸，其對(duì)T 細(xì)胞免疫有強(qiáng)烈的抑制作用，最終可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲。

2.3 通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)型促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移 Xing F 等[11]分析了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，發(fā)現(xiàn)XIST 在這些組織中表達(dá)下降，其表達(dá)水平與腦轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。在異種移植模型中發(fā)現(xiàn)，小鼠乳腺中XIST 的缺失會(huì)加速原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)，并促進(jìn)腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。XIST 的缺失同時(shí)會(huì)促進(jìn)外泌體miR-503的分泌，外泌體miR-503 也由X 染色體編碼且通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3 和NF-κB 通路，將小膠質(zhì)細(xì)胞從M1 型重編程為M2 型，M2 小膠質(zhì)細(xì)胞已被報(bào)道通過(guò)釋放細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子促進(jìn)腦腫瘤的進(jìn)展[17，18]。這些研究證明了外泌體miR-503 水平與腦轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈正相關(guān)。

3 外泌體miRNA 在腫瘤微環(huán)境中的調(diào)控作用

3.1 外泌體miRNA 可形成特有的腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境通常指與實(shí)性腫瘤存在距離較近的區(qū)域。1989 年佩吉特首次提出著名的“種子和土壤”假說(shuō)，使微環(huán)境與腫瘤之間的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注，該假說(shuō)認(rèn)為，只有當(dāng)癌細(xì)胞與潛在轉(zhuǎn)移（種子）所兼容的器官微環(huán)境（土壤）共同存在時(shí)發(fā)才會(huì)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[19，20]。Melo S 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺腫瘤細(xì)胞的外泌體可以形成特有的腫瘤環(huán)境，然后在其內(nèi)部生成成熟的miRNAs。當(dāng)非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）和這些外泌體（MDA-MB-231）共培養(yǎng)時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)發(fā)生癌變。Baroni S 等[22]研究表明，外泌體可以將腫瘤分泌的miR-9 轉(zhuǎn)移到受體正常的成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs），miR-9 在乳腺癌細(xì)胞中顯著上調(diào)且直接靶向于鈣黏蛋白（CDH1），miR-9可參與微環(huán)境重編程，激活正常成纖維細(xì)胞的腫瘤促進(jìn)能力，進(jìn)而增加癌細(xì)胞的活力和侵襲性。

3.2 外泌體miRNA 誘導(dǎo)微環(huán)境代謝 乳腺癌細(xì)胞可作為代謝寄生蟲(chóng)，從局部脂肪細(xì)胞中獲取能量和生物量。有研究表明[23]，來(lái)自脂肪細(xì)胞的外泌體攜帶的蛋白質(zhì)通過(guò)增加脂肪酸氧化（FAO）促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Wu Q 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，含有miR-144 和miR-126 的外泌體在與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞中高度分泌，外泌體miR-144 通過(guò)下調(diào)MAP3K8/ERK1/2/PPARγ 軸來(lái)促進(jìn)米色/棕色脂肪細(xì)胞分化；外泌體miR-126 通過(guò)干擾IRS/Glut-4 信號(hào)通路，激活A(yù)MPK/自噬通路、控制脂肪細(xì)胞中HIF-1α 的表達(dá)來(lái)重塑代謝。此外，在氧化應(yīng)激和缺氧條件下，外泌體分泌miR-126 增多，表明癌細(xì)胞的外泌miR-126 可能參與了腫瘤血管生成和惡性轉(zhuǎn)化[25，26]。

4 外泌體miRNA 對(duì)乳腺癌血管的影響

Pakravan K 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）來(lái)源的外泌體以劑量依賴(lài)的方式誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；該研究發(fā)現(xiàn)，miR-100 由MSC 分泌的外泌體攜帶并運(yùn)輸，可顯著抑制mTOR 和HIF-1α 在mRNA和蛋白上的表達(dá)，且乳腺癌細(xì)胞中miR-100 和VEGF 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[28]。這些結(jié)果表明，VEGF 的下調(diào)是特異性的，很大程度上依賴(lài)于外泌體攜帶的miRNA 的轉(zhuǎn)移。此外，miR-100 的誘導(dǎo)作用可以抵消上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的促瘤作用，從而調(diào)控不同的基因參與腫瘤的發(fā)生[29]。該研究發(fā)現(xiàn)，使用anti-miR-100 可以挽救MSC 來(lái)源的外泌體對(duì)VEGF 表達(dá)的抑制作用，證實(shí)了外泌體攜帶miR-100 在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控VEGF 表達(dá)中的抑制作用。不僅如此，Pan S 等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，外泌體miR-145 明顯增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）形成，故MDA-MB-231 細(xì)胞衍生的自身外泌體對(duì)其內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有顯著作用，可促進(jìn)腫瘤血管生成。

5 外泌體miRNA 有望成為診斷乳腺癌及預(yù)后的指標(biāo)

目前，臨床上關(guān)于乳腺癌的診斷主要依靠于病理及影像學(xué)指標(biāo)，但因其有創(chuàng)性、對(duì)開(kāi)展技術(shù)所需的人員水平和設(shè)備要求高以及費(fèi)用問(wèn)題等，導(dǎo)致乳腺癌的早期診斷率仍然不理想，因此需要引入新的生物標(biāo)志物來(lái)克服相關(guān)限制。因外泌體包裹的分子在非生理環(huán)境中也能表現(xiàn)出與眾不同的穩(wěn)定性和耐藥性[31]，使其可以成為監(jiān)測(cè)疾病有前途的生物標(biāo)志物[32]。有研究證實(shí)[14]，乳腺癌患者血清中外泌體miR-1910-3p 的表達(dá)明顯高于健康志愿者，且患者體內(nèi)血清CA153 的診斷靈敏度為68%，特異性為60%；血清外泌體中miR-1910-3p 的診斷敏感度為88%，特異性為76%。這些數(shù)據(jù)表明，血清外泌體miR-1910-3p 的診斷效果明顯高于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CA153，可作為乳腺癌的新分子檢測(cè)方法。

6 外泌體miRNA 在乳腺癌治療及耐藥中的作用

由于外泌體具有穩(wěn)定、通透性強(qiáng)、免疫原性差、毒性小、生物相容性差等特性，目前可被模擬作藥物傳遞系統(tǒng)的納米顆粒載體[31]。有研究證實(shí)[33]，化療藥物和小干擾RNA 已成功封裝在外泌體中且成功用于靶向乳腺癌、胰腺癌、肺癌和前列腺癌的治療。有研究將MDA-MB-231 細(xì)胞與表達(dá)miR-148b-3p 的人類(lèi)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)攜帶miR-148b-3p 的外泌體在體外對(duì)MDA-MB-231 的進(jìn)展有抑制作用[34]，這凸顯了含有miR-148b-3p 的外泌體對(duì)乳腺癌的治療潛力。另外，外泌體miR-423-5p 在三陰性乳腺癌細(xì)胞中對(duì)順鉑具有耐藥性[35]；外泌體miR-222 可使阿霉素敏感的乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性，但外泌體miR-770 過(guò)表達(dá)可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)三陰性乳腺癌細(xì)胞系對(duì)阿霉素的敏感性[36]；外泌體miR-222 和miR-221也可使他莫西芬敏感的乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫西芬產(chǎn)生耐藥性[37]。這些研究證實(shí)了外泌體miRNAs 在乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥中的重要性，也為開(kāi)展基于外泌體miRNA 的癌癥治療方法的研究提供了理論基礎(chǔ)。

7 展望

外泌體miRNAs 受膜泡的保護(hù)作用，其在血液和其他體液中的含量較穩(wěn)定，因此有望成為早期診斷乳腺癌的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物[38]。此外，外泌體miRNAs 可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和促進(jìn)腫瘤微環(huán)境改變等途徑提高腫瘤細(xì)胞的侵襲性。但目前外泌體miRNAs 提取并不能完全適用于臨床，有學(xué)者從RQ-PCR 的廣泛周期閾值中發(fā)現(xiàn)，不同人群的外泌體miRNAs 表達(dá)水平有顯著差異[39]，這種變異會(huì)影響外泌體miRNAs 作為乳腺癌生物標(biāo)記物的臨床適用性，且患者的基礎(chǔ)疾病等也可能影響miRNAs 的水平，從而該項(xiàng)檢測(cè)缺乏特異性[40]。此外，現(xiàn)階段獲取外泌體miRNA 方式主要以超離心分離技術(shù)為主，其設(shè)備成本高、運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)、可移植性低，這在一定程度上也限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。

8 總結(jié)

外泌體miRNAs 直接參與了乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥，其可作為一種可被定量檢測(cè)的，新的乳腺癌生物標(biāo)志物。但由于人群特異性和檢測(cè)技術(shù)等限制，該技術(shù)目前尚未在臨床廣泛應(yīng)用。因此，如何快速便捷的獲取外泌體miRNA，并提高外泌體miRNAs 作為乳腺癌診斷生物標(biāo)志物的靈敏度和特異性是未來(lái)的研究方向。