蘆筍主要病毒病的研究進(jìn)展

葉艷英，尹玉玲，張冰冰，湯泳萍，周勁松，羅紹春

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，江西南昌 330200）

蘆筍（Asparagus officinalisL.）又名石刁柏，為天門冬科天門冬屬多年生宿根性草本植物，其嫩莖質(zhì)嫩味美，風(fēng)味獨(dú)特，是一種深受消費(fèi)者喜愛的營養(yǎng)保健型高檔蔬菜，被譽(yù)為“蔬菜之王”[1]。蘆筍富含甾體皂苷、黃酮類、維生素、膳食纖維及植物多糖等多種活性成分，具有很好的藥用價(jià)值和保健功能[2-3]。2020 年蘆筍已正式列入新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)診療方案及預(yù)防方案藥食同源目錄[4]。我國蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2016 年栽培面積已達(dá)12 萬hm2，蘆筍的播種面積和出口量均超過世界總量的50%，年產(chǎn)值達(dá)數(shù)百億元[5]。

目前，在多國發(fā)現(xiàn)蘆筍受到衰退綜合癥的影響，這種綜合癥縮短了蘆筍的生產(chǎn)年限，也降低了蘆筍的產(chǎn)量和質(zhì)量，病毒病是引起衰退綜合癥的一個(gè)重要原因，并可使蘆筍植株更易受到生物和非生物脅迫[6]。至今在蘆筍上發(fā)現(xiàn)了10 種病毒：擬南芥花葉病毒(ArMV)、草莓潛伏黃斑病毒(SLRSV)、番茄黑環(huán)病毒(TBRV)、煙草條紋病毒（TSV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒(TMV)、苜?；ㄈ~病毒(AMV)、天 門 冬1 號(hào) 病 毒(AV-1)、天 門 冬2 號(hào) 病毒(AV-2)和 天 門 冬3 號(hào) 病 毒（AV-3）[7-9]。其 中，AV-1、AV-2 和AV-3 這3 種 病 毒，蘆 筍 是 天 然 的宿主。AV-1 和AV-2 在北美與歐洲的商業(yè)蘆筍田很常見，這2 種病毒也是大陸蘆筍的最主要病毒，而AV-3 只在日本發(fā)現(xiàn)[10]。TSV 和CMV 最早分別于丹麥和德國被發(fā)現(xiàn)，其他的幾種病毒病發(fā)生較少。筆者對(duì)主要的蘆筍病毒病的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，旨在為蘆筍病毒相關(guān)研究提供借鑒，為培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的蘆筍提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 天門冬1 號(hào)病毒（AV-1）

1.1 AV-1 基因組結(jié)構(gòu)

天門冬1 號(hào)病毒（AV-1）是馬鈴薯Y 病毒科馬鈴薯Y 病毒屬的成員，AV-1 是一種彎曲的絲狀病毒，長770～790 nm，寬13 nm[11]。AV-1 是單鏈正義RNA 病毒，基因組長度為9 741 nt，不包括3′端多聚poly（A）尾，編碼一個(gè)包含3 112 個(gè)氨基酸的多聚蛋白，分子質(zhì)量為342 ku[12]。

AV-1 基因組RNA 的5′末端連帽狀病毒編碼的VPg 蛋白，3′末端由poly（A）尾巴組成，編碼區(qū)為單一開放閱讀框（ORF）。ORF 可表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)多聚蛋白前體，包含10 種蛋白：P1 蛋白（333aa）、HCPro 輔助蛋白酶（458aa）、P3 蛋白（351aa）、6K1 蛋白（52aa）、CI 柱 狀 包 含 體 蛋 白（643aa）、6K2 蛋 白（53aa）、VPg 病毒基因組連接蛋白（193aa）、NIa 核內(nèi)含體蛋白a（243aa）、NIb 核內(nèi)含體蛋白b（518aa）和CP 外殼蛋白（268aa）。

筆者對(duì)NCBI 上登錄的16 個(gè)AV-1 分離物的CP基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，16 個(gè)分離物的CP基因均為443 個(gè)堿基。16 個(gè)分離物的CP基因同源性高，核苷酸序列同源性在96.8%～100%，氨基酸同源性在95.2%～100%。

1.2 AV-1 對(duì)蘆筍的危害

TOMASSOLI 等[6]對(duì)西西里島和坎帕尼亞采集的650 多個(gè)蘆筍樣品進(jìn)行檢測，54%樣品檢測出AV-1，86%取樣點(diǎn)發(fā)現(xiàn)有被病毒侵染，發(fā)病率最高的是老植株。

蘆筍感染病毒病會(huì)影響其質(zhì)量，導(dǎo)致彎曲筍、細(xì)筍、散頭筍明顯增多，同時(shí)會(huì)使植株變得瘦弱，嚴(yán)重影響蘆筍品質(zhì)。由于感染病毒的植株沒有明顯癥狀，因此，常常被忽視其造成的經(jīng)濟(jì)損害[13]。歐洲種植的蘆筍感染AV-1，減產(chǎn)可達(dá)30%～70%[13-14]；對(duì)云南燕山縣蘆筍病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于AV-1 危害導(dǎo)致蘆筍產(chǎn)量下降了25%[15]；受AV-1 危害，蘆筍莖長降低了12%～20%、莖質(zhì)量降低了10%～33%[16]。

1.3 侵染途徑

在蘆筍中發(fā)現(xiàn)了3 種機(jī)械傳播的病毒：TSV、AV-1 和AV-2[17-18]。AV-1 同絕大多數(shù)的馬鈴薯Y病毒一樣,是以非持續(xù)性傳播。除了機(jī)械傳播外，還主要通過桃蚜與豆蚜傳播，不通過種子進(jìn)行傳播。

2 天門冬2 號(hào)病毒（AV-2）

2.1 AV-2 基因組結(jié)構(gòu)

天門冬2 號(hào)病毒(AV-2)是雀麥花葉病毒科等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒屬第2 亞組中的一員，是一種小型球形病毒[11]。AV-2 基因組結(jié)構(gòu)為三分體正義單鏈mRNA，5′末端有帽狀結(jié)構(gòu)，3′末端無poly（A）尾巴。AV-2 全基因組由RNA1、RNA2、RNA3 和亞基 因 組RNA4 組成[19]。RNA1 的長度是3 431 nt，是一個(gè)單一的ORF，編碼P1 蛋白，含有1 076 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為121 ku，同時(shí)包含一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū) 域 和 解 旋 酶 信 號(hào)，RNA1 的5′UTR 和3′UTR 分別為72、128 nt。RNA2 的長度為2 916 nt，其ORF的5′端編碼P2 蛋白，含790 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量91 ku，包含聚合酶信號(hào)，ORF 的3′端編碼2b 蛋白，含193 個(gè)氨基酸的，分子質(zhì)量21 ku。RNA2 的5′UTR 和3′UTR 分別為72、194 nt。RNA3 包含2 個(gè)ORF，ORF1 編碼運(yùn)動(dòng)蛋白MP，含281 個(gè)氨基酸，MP 是參與病毒在細(xì)胞和細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)的重要蛋白，ORF2 編碼外殼蛋白CP，含217 個(gè)氨基酸。CP 是由RNA3后半部分對(duì)應(yīng)的亞基因組RNA4翻譯[19-20]。

筆者對(duì)AV-2 的7 個(gè)分離物的CP基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，7 個(gè)分離物的CP基因均為654 個(gè)堿基，編碼217 個(gè)氨基酸。核苷酸序列同源性在99.1%～100%，核苷酸在240、314、439、446、465 和555 位置處存在差異。氨基酸同源性在99.1%～100%，氨基酸在105 和149 位置處存在差異。發(fā)現(xiàn)AV-2 分離株的外殼蛋白(CP)的遺傳變異性非常低，且均高度保守，在分離株間具有大于99%的同源性，這與SHIMURA 等[21]的研究結(jié)果相一致。

對(duì)AV-2 的7 個(gè)分離物的2b基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，7 個(gè)分離物的2b基因均為582 個(gè)堿基，編碼193 個(gè)氨基酸。核苷酸序列同源性在99.3%～100%，核苷酸在51、166、167 和194 位置處存在差異。氨基酸同源性在98.5%～99.5%，氨基酸在56和65 位置處存在差異。

2.2 AV-2 對(duì)蘆筍的危害

2.2.1 病毒發(fā)病率高 據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，密歇根蘆筍種植田有50%～70%的植株感染AV-2，且大多數(shù)是種植了5 a 以上的植株[22]。當(dāng)蘆筍父本感染AV-2時(shí)，子代幼苗中有16.7%植株攜帶AV-2；只有母本感染時(shí)，子代幼苗中有46.6%植株攜帶AV-2；當(dāng)父母本都感染時(shí)，有94.5% 子代植株攜帶AV-2[23]。

2.2.2 影響品質(zhì)和產(chǎn)量 蘆筍感染了AV-2，導(dǎo)致減產(chǎn)大約25%，在收獲期1～5 a，商品筍平均產(chǎn)量分別降低14%、28%、20%、48%和57%，次品筍產(chǎn)量分別提高93%、105%、207%、352%和167%；未受AV-2 危害的植株商品筍產(chǎn)量逐年增加，直到第5 年到達(dá)高峰，而受AV-2 危害的植株產(chǎn)量增長到第3 年后便開始逐年下降[24]。

2.2.3 影響授粉和種子質(zhì)量 蘆筍感染病毒對(duì)幼苗適宜性、植株的生長、授粉能力和種子發(fā)芽率都有顯著影響。蘆筍親本植株感染AV-2 可導(dǎo)致花朵發(fā)育受損，會(huì)使授粉成功率降低21%～29%，種子質(zhì)量減少11%～8%，種子數(shù)量減少12%～46%，種子萌發(fā)率降低8～23%，蘆筍幼苗活力下降4%～15%[23]。

張連長還想爭辯,曲干事把他扯到一旁,低聲說:“我不是裝好人,明擺著,只能先收在你們連了!這老爺子要不高興起來,團(tuán)長也會(huì)不高興,師長也會(huì)不高興,這點(diǎn)事兒你都不懂?”

2.2.4 影響幼苗生長 蘆筍幼苗感染AV-2 時(shí)，植株的生長速度和活力都會(huì)降低，AV-1 和AV-2 這2 種病毒同時(shí)存在時(shí)，蘆筍植株在發(fā)病2 a 后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的衰退和死亡[17]。AV-l 或AV-2 單一感染時(shí)導(dǎo)致蘆筍幼苗生長和存活率下降10%～20%，而AV-l 和AV-2 雙重感染時(shí)則使蘆筍幼苗生長和存活率下降40%～70%[24]。

2.2.5 影響組培快繁 此外，蘆筍病毒病對(duì)蘆筍快繁可產(chǎn)生影響，會(huì)降低外植體的生根率和存活率，無病毒的外植體生根率為40%～45%。感染病毒的植株上取的外植體在組培過程中根系發(fā)育緩慢，存活率降低15%～75%，培養(yǎng)28 d 后，感染AV-1的蘆筍組培苗生根率為14%～30%，感染AV-2 的生根率為28%～32%，感染2 種病毒的外植體生根率僅為6%～20%[25]。

2.3 侵染途徑

AV-2 主要是通過機(jī)械和種子傳播[26-27]。蘆筍是一種異花授粉的植物，通過風(fēng)吹傳播或蜜蜂攜帶花粉以及薊馬的攝食活動(dòng)等方式傳播，AV-2 通過花粉傳播可使病毒傳入健康的植株，使其在植株內(nèi)迅速傳播[20,22]。EVANS 等[22]從感染AV-2 的蘆筍植株花粉中檢測到AV-2 的病毒粒子，并在花粉外膜上定位到病毒抗原，證實(shí)AV-2 可通過授粉活動(dòng)進(jìn)行傳播。另外，農(nóng)事操作如用被AV-2 污染的切刀或者割草機(jī)等切割母莖也是機(jī)械傳播AV-2 的途徑之一，且易在較老的植株中廣泛傳播。

蘆筍種子感染AV-2達(dá)5%～60%，平均為22%。由于種子感染AV-2 比例高，因此，受感染的種子是AV-2 最初進(jìn)行傳播的最可能來源，攜帶AV-2的種子進(jìn)行交流可能會(huì)把AV-2 傳播到全世界，特別是在偏遠(yuǎn)地區(qū)和新西蘭等島國，意大利[28]、北美[17]和新西蘭[29]蘆筍感染AV-2 的比例也很高。

3 蘆筍其他病毒病

3.1 天門冬3 號(hào)病毒（AV-3）

AV-3 最早從日本的蘆筍中分離出來,被歸類為馬鈴薯X 病毒屬的成員。AV-3 的全基因組長度為6 937 nt，不包括poly（A）尾，5′UTR 和3′UTR 分別為81、101 nt?；蚪MRNA 中包括5 個(gè)ORF，ORF1（82～4 926 nt）編碼一個(gè)182 ku 的RNA 聚合酶（RdRp），ORF2（4 959～5 702 nt）、ORF3（5 635～5 994 nt）和ORF4（5 837～6 094 nt）分別編碼28 ku TGBp1、13 ku TGBp2 和9 ku TGBp3 的 蛋 白 質(zhì)，稱為三基因阻斷蛋白（TGBps），ORF5（6 144～6 836 nt）編碼26 ku 的外殼蛋白（CP）[11]。到目前為止，除日本外，還沒有其他國家報(bào)道該病毒，因此，關(guān)于其特性和對(duì)產(chǎn)量影響的相關(guān)信息較少。

3.2 黃瓜花葉病毒（CMV）

CMV 是黃瓜病毒科黃瓜病毒屬中的一員。蘆筍上CMV 最早在德國發(fā)現(xiàn)[30]。受CMV 感染的蘆筍無典型癥狀，CMV 可以通過超過80 種蚜蟲以非持久性的方式進(jìn)行傳播。CMV 的蘆筍分離物很容易通過機(jī)械方式接種到藜麥和莧屬等草本指示植物上，接種后引起葉片典型局部病變，以及系統(tǒng)花葉[10]。CMV 已知在至少20 種植物中通過種子傳播，但沒有關(guān)于CMV 病毒通過種子和花粉在蘆筍中傳播的報(bào)道。發(fā)現(xiàn)蘆筍上經(jīng)?；旌细腥綜MV 與AV-1，同時(shí)感染2 種病毒對(duì)蘆筍產(chǎn)量的影響更大，如感染AV-1+CMV 造成蘆筍減產(chǎn),最高可達(dá)70%；感染AV-2+CMV 可導(dǎo)致減產(chǎn)20%～49.5%[12]。

3.3 煙草條紋病毒（TSV）

TSV 是等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬中的一員，蘆筍上的TSV 最早在丹麥的蘆筍中被分離出來，然后根據(jù)生物學(xué)、物理和血清學(xué)特性，該分離物被證明與TSV 有關(guān)[10]。美國加州的蘆筍在自然條件下也可感染TSV，但地中海國家的蘆筍上未檢測到TSV。感染TSV 的蘆筍植株發(fā)育不良，莖部呈褪綠或褐色條紋，擬葉變褐色，TSV 在蘆筍中不能通過種子傳播，但可以通過薊馬攜帶傳播[31]。

4 蘆筍病毒病的檢測方法

4.1 指示植物法

藜麥?zhǔn)呛芎玫闹甘局参?用于檢測AV-1 的存在與否，藜麥接種AV-1 病毒4～12 d 后，接種葉上出現(xiàn)褪綠、紅棕色或黃色斑點(diǎn)，而后受影響的組織開始?jí)乃繹30]。另外，本氏煙也可用于鑒別AV-1 分離株[32]。

4.2 血清學(xué)檢測法

JASPERS 等[17]使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）成功檢測了蘆筍枝條AV-2的感染情況。HOWELL等[33]采用血清學(xué)法區(qū)別不同地域來源的AV-1 病毒株系。此外，蘆筍CMV 病毒也可通過ELISA 進(jìn)行檢測[30]。

4.3 電鏡觀察法

電鏡法是通過觀察病毒顆粒形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)、內(nèi)涵體組成和亞結(jié)構(gòu)等特征來確定蘆筍病毒是否存在。FUJISAWA[8]通過提純分離蘆筍病毒粒子，用提純液來做電鏡制片，觀察到了AV-3 的粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)。LI 等[15]利用電子顯微技術(shù)觀測到國內(nèi)首例AV-1 病毒長度等。

4.4 分子生物學(xué)檢測法

分子生物學(xué)檢測法比血清學(xué)法的靈敏度要高,特異性強(qiáng)，有著更快的檢測速度，操作也比較簡便，可用于大量樣品的檢測。TOMASSOLI 等[6]利用AV-1 病毒外殼蛋白CP 區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，建立RT-PCR 反應(yīng)體系，對(duì)不同地區(qū)采集的蘆筍樣品進(jìn)行AV-1 檢測。JASPERS 等[17]利用已發(fā)表的AV-2 外殼蛋白核苷酸序列（Genbank 登錄號(hào)×86352）設(shè)計(jì)引物，用于檢測AV-2。

5 蘆筍病毒病的防治

5.1 選育抗病品種

選育抗病毒品種是防治病毒病的最有效措施，目前研究者們發(fā)現(xiàn)了對(duì)蘆筍病毒病具有抗性的資源。TOMASSOLI 等[34]研究表明，蘆筍野生近緣種A. maritimus感染病毒率低于10%。此外，TIBERINI 等[35]在意大利蘆筍田中發(fā)現(xiàn)A. albus、A.amarus、A. stipularis和A. horridus無AV-1 感染。NOTHNAGEL 等[36-37]對(duì)44 個(gè)蘆筍栽培種、基因文庫和育種系以及34 個(gè)蘆筍野生近緣種進(jìn)行AV-1 抗性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)A.amarus、A.verticillatus、A.prostratus、A.maritimus、A.acutifolius和A.stipularis未檢測到AV-1，這些抗性種質(zhì)資源由二倍體、四倍體和六倍體組成，分別來自歐亞和非洲，其中，地中海野生近緣種A. amarus對(duì)AV-1 具有完全抗性，且A.amarus為六倍體。這些抗性資源的發(fā)掘?yàn)樘J筍抗病毒病育種提供了新的契機(jī)。

5.2 農(nóng)業(yè)措施

蘆筍種子攜帶病毒是重要的毒源，因此，在播種前對(duì)種子進(jìn)行消毒處理能在一定程度上降低病毒病發(fā)生的可能性。合理密植、合理施肥、灌溉、培育壯苗、拔除早期病株、農(nóng)具與機(jī)械進(jìn)行消毒消除潛在病毒等措施可減輕病害發(fā)生[38-39]。

5.3 傳播介體防控

傳播介體主要是蚜蟲、粉虱、薊馬等，可通過阻礙傳播媒介傳播，達(dá)到防治病毒目的[40]。物理防治：利用黃板或藍(lán)板、性誘劑等趨避蚜蟲、粉虱、薊馬，大棚的通風(fēng)口安裝防蟲網(wǎng)進(jìn)行隔離。生物防治：可通過釋放捕食性或寄生性天敵的方式防治薊馬，從而減少蘆筍病毒病的發(fā)生?；瘜W(xué)防治：在蘆筍生長過程中，使用高效、低毒、低殘留農(nóng)藥防控蚜蟲、粉虱、薊馬。

6 展望

蘆筍質(zhì)嫩味美、富含生物活性因子，具有很好的藥用保健功效，且被列入新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)診療方案預(yù)防方案目錄。近年來，國內(nèi)蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度迅速，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大。蘆筍病毒病使蘆筍產(chǎn)量降低，使蘆筍散頭造成商品性大打折扣，影響出口創(chuàng)匯。筆者認(rèn)為今后應(yīng)該從以下幾個(gè)方面開展研究：（1）建立脫毒種苗繁育體系。目前，并無抗病毒病的蘆筍品種，而蘆筍主要傳播途徑之一是帶病毒的種子進(jìn)行傳播，因此，獲得優(yōu)良的蘆筍脫毒苗是當(dāng)前防治蘆筍病毒病的主要方法之一，所以，對(duì)蘆筍進(jìn)行莖尖脫毒種苗快速繁育研究尤為重要。（2）建立快速、簡便、特異性強(qiáng)的蘆筍病毒病檢測方法。筆者發(fā)現(xiàn)很多蘆筍園中有疑似病毒病的植株，因此，建立快捷檢測方法為更好地研究蘆筍病毒在田間的侵染率、發(fā)生情況等方面提供依據(jù)，也為脫毒種苗的生產(chǎn)提供了技術(shù)保障，是有效開展蘆筍病毒病綜合防治工作的關(guān)鍵，對(duì)蘆筍的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。（3）加強(qiáng)抗病毒資源鑒定、篩選與利用。目前為止還沒有育成抗病毒的品種，主要是因?yàn)槠贩N的共同起源導(dǎo)致遺傳背景狹窄。防治蘆筍病毒病最經(jīng)濟(jì)且有效的方法就是發(fā)掘天然的抗病毒病的種質(zhì)資源和抗病毒基因，利用野生近緣植物作為抗性來源是現(xiàn)代植物育種的常用策略。將發(fā)掘的高抗病毒病的蘆筍野生近緣種通過種間雜交、胚胎拯救和離體再生技術(shù)有可能將野生種中的抗性轉(zhuǎn)移到栽培種中[41-42]。這為今后培育抗病毒病的蘆筍品種提供了可能，因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)抗性資源的鑒定、篩選和開發(fā)利用。另外，應(yīng)加快蘆筍病毒病致病的分子機(jī)理和植物抗病毒病的分子機(jī)理等方面的基礎(chǔ)研究。