康氏木霉對小麥和黃瓜種子發(fā)芽的影響

趙詩杰，梁 松，邱新月，許 蓉，張作剛，暢引東，姚艷平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

木霉菌（Trichoderma）作為一類常見的、應(yīng)用廣泛的生防菌株，在植物病害的防治中具有廣闊的研究與開發(fā)前景[1-3]。生防木霉菌具有競爭作用、促生作用、重寄生作用和拮抗作用等多種作用機(jī)制[4-6]，其促生效果主要表現(xiàn)為提高種子發(fā)芽率、增加植株高度、降低倒伏率、增大葉面積、促進(jìn)提前開花[7-9]等。

木霉菌不但能夠抑制多種病原菌[10-11]，還能促進(jìn)小麥、水稻、玉米、蔬菜、水果和煙草等多種植物種子、幼苗的生長發(fā)育，提高種子的發(fā)芽率和出苗率，促進(jìn)土壤營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化吸收[12-13]。張屹等[14]研究表明，棘孢木霉（T. asperellum）處理后水稻的株高、地上部干質(zhì)量、根際土壤總氮和硝態(tài)氮含量均顯著增加。劉峰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉（T.harzianum）對玉米苗期的根系、葉長、葉寬、莖粗、株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等生長指標(biāo)均有顯著提高作用。趙曉燕等[16]研究表明，蓋姆斯木霉（T. gamsii）孢子懸浮液能夠顯著提高黃瓜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。周曉馥等[17]、劉暢等[18]、張欣玥等[19]和王禹佳等[20]研究均表明，木霉菌對黃瓜幼苗的生物量、光合能力和植物抗性具有促進(jìn)作用?；粞┭┑萚21]研究也發(fā)現(xiàn)，綠色木霉（T. viride）孢子液可以促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)、幼苗生長和生物量增加。YU 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的木霉菌孢子懸浮液能促進(jìn)番茄幼苗的生長，促進(jìn)有效氮的吸收，提高番茄幼苗的抗性。潘宣圳等[23]研究表明，木霉固體發(fā)酵物可促使小白菜根長、葉長、鮮質(zhì)量顯著增加。HALIFU等[24]研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌能促進(jìn)樟子松幼苗的生長，促進(jìn)根際土壤中總磷、全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化。張燁等[25]也研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉培養(yǎng)液濃度在30%時對煙草具有明顯的促生作用。

康氏木霉菌株（T. koningii）為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的具有高效抑菌活性的生防菌株，為了明確該生防菌株的促生效果，本研究選用單子葉植物小麥種子和雙子葉植物黃瓜種子為試驗(yàn)材料，探索康氏木霉菌株孢子懸浮液和培養(yǎng)濾液對小麥和黃瓜種子萌發(fā)和生長的影響，為康氏木霉菌株促生作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，為康氏木霉生防菌劑的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥種子（運(yùn)旱20410）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；黃瓜種子（中裕新春四號）由山西省中裕種業(yè)公司提供；供試木霉菌株為康氏木霉菌株（Trichoderma koningii），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2021 年10-12 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，121 ℃高壓滅菌20 min 后備用。

1.2.2 菌種的活化 將康氏木霉菌株接種于馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。

1.2.3 康氏木霉菌孢子懸浮液的制備 在已培養(yǎng)好的康氏木霉菌的平板培養(yǎng)基上倒入無菌水，刮取菌絲，得到一定濃度的孢子懸浮液，稀釋成1.0×103、1.0×105、1.0×107cfu/mL 等3 個濃度。

1.2.4 康氏木霉發(fā)酵液的制備 將康氏木霉菌株接種至已滅菌的PDB 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、160 r/min 的搖床上振蕩培養(yǎng)8 d，培養(yǎng)基中會產(chǎn)生大量菌體及孢子，用4 層無菌紗布過濾，得到木霉菌的發(fā)酵原液。將發(fā)酵原液通過細(xì)菌過濾器進(jìn)行抽濾，獲得抽濾發(fā)酵液；將發(fā)酵原液進(jìn)行121 ℃高壓滅菌20 min 后，得到滅菌發(fā)酵液。分別將發(fā)酵原液、抽濾發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵液稀釋為100%、75%、50%、25%、10%和1%的濃度備用。

1.2.5 康氏木霉菌浸種處理 先將小麥、黃瓜種子用75%的酒精進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3～4 次后用無菌水浸泡3 h，分別用不同濃度的康氏木霉菌孢子懸浮液、發(fā)酵原液、抽濾發(fā)酵液、滅菌發(fā)酵液浸泡小麥和黃瓜種子5 h，用無菌水沖洗3 次，放置于培養(yǎng)皿中保濕催芽，每皿放20 粒種子，孢子懸浮液處理以無菌水作為對照，發(fā)酵原液、抽濾發(fā)酵液、滅菌發(fā)酵液處理以PDB 液體培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復(fù)3 次。分別于發(fā)芽后第2、3 天統(tǒng)計種子發(fā)芽率、芽長和根長，計算康氏木霉菌株的促生率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 康氏木霉菌孢子懸浮液對小麥種子萌發(fā)與生長的影響

從表1 可以看出，康氏木霉菌孢子懸浮液處理小麥種子2 d 后，明顯促進(jìn)小麥種子芽的生長，與對照相比差異顯著，濃度為1.0×103cfu/mL 處理的小麥種子芽長最長，達(dá)到1.12 cm，促生率為60.00%。不同濃度孢子懸浮液對小麥種子根的生長均有促進(jìn)作用，1.0×103cfu/mL 孢子懸浮液的根長促生率為26.85%，與對照相比差異顯著?？凳夏久规咦討腋∫簩π←湻N子的發(fā)芽率沒有促生作用，反而在一定程度上抑制了種子的發(fā)芽，發(fā)芽抑制率為3.16%?？凳夏久咕咦討腋∫禾幚硇←湻N子3 d 后，對小麥種子發(fā)芽率、芽長和根長的促進(jìn)作用不一致，但均與對照沒有顯著性差異。綜合分析，1.0×103cfu/mL 的康氏木霉菌孢子懸浮液對小 麥種子生長的促生效果最好。

表1 康氏木霉菌孢子懸浮液對小麥種子生長的影響Tab.1 Effects of Trichoderma koningii spore suspension on wheat seed growth

2.2 康氏木霉菌發(fā)酵液對小麥種子萌發(fā)與生長的影響

康氏木霉菌發(fā)酵液對小麥種子生長的影響如表2 所示。

表2 康氏木霉菌發(fā)酵液對小麥種子生長的影響（3 d）Tab.2 Effects of Trichoderma koningii fermentation broth on wheat seed growth（3 d）

從表2 可以看出，康氏木霉菌發(fā)酵原液處理小麥種子3 d 后，芽長、根長與對照相比差異顯著；10%的發(fā)酵原液處理后，芽長達(dá)到最大，為1.96 cm，芽長促生率為79.82%；50%發(fā)酵原液處理后根長為3.59 cm，根長促生率達(dá)到最大，為44.18%。25%和1%發(fā)酵原液處理后，發(fā)芽率達(dá)到最高，均為97%，與對照相比差異顯著?？凳夏久钩闉V發(fā)酵液處理均抑制了小麥種子芽長的生長，100%抽濾發(fā)酵液的抑制率最高，達(dá)28.18%。除100%和1%濃度外，其他濃度的抽濾發(fā)酵液同時也抑制了小麥種子的發(fā)芽率；所有濃度的抽濾發(fā)酵液處理均促進(jìn)根的生長，10%和100%的抽濾發(fā)酵液根促生率較高，分別可達(dá)10.40% 和13.25%?？凳夏久咕鷾缇l(fā)酵液對小麥芽長的促生作用最強(qiáng)，芽長促生率均在90%以上；1%滅菌發(fā)酵液處理3 d后芽長為2.25 cm，芽長促生率達(dá)到106.67%。康氏木霉菌滅菌發(fā)酵液各濃度處理的根長與對照相比差異顯著，均促進(jìn)根的生長，10%滅菌發(fā)酵液處理后根長達(dá)到3.04 cm，根長促生率為22.18%；75%滅菌發(fā)酵液處理的發(fā)芽率達(dá)到100%，促生率達(dá)7.53%。

2.3 康氏木霉菌孢子懸浮液對黃瓜種子萌發(fā)與生長的影響

康氏木霉菌孢子懸浮液對黃瓜種子發(fā)芽與生長的影響如表3 所示。在發(fā)芽后3 d，黃瓜種子雖已萌發(fā)，但大部分的種子芽長為0 cm，故未對黃瓜種子的芽長指標(biāo)進(jìn)行測定。木霉菌孢子懸浮液處理黃瓜種子后，其根長和發(fā)芽率表現(xiàn)不同。1.0×103cfu/mL的康氏木霉菌孢子懸浮液處理黃瓜種子2 d 后，根長最大，達(dá)到2.17 cm，根長促生率為16.04%。1.0×105cfu/mL 的康氏木霉菌孢子懸浮液處理黃瓜種子3 d 后，明顯抑制了根的生長，根抑制率為9.97%。1.0×103cfu/mL 的孢子懸浮液處理后，發(fā)芽率最高，達(dá)99%，發(fā)芽促生率為7.61%。綜合分析，濃度為1.0×103cfu/mL 的康氏木霉菌孢子懸浮液對黃瓜種子的促生作用較好。

表3 康氏木霉菌孢子懸浮液對黃瓜種子生長的影響Tab.3 Effects of Trichoderma koningii spore suspension on cucumber seed growth

2.4 康氏木霉菌發(fā)酵液對黃瓜種子萌發(fā)與生長的影響

康氏木霉菌發(fā)酵液對黃瓜種子萌發(fā)與生長的影響如表4 所示?？凳夏久咕l(fā)酵原液處理黃瓜種子3 d 后，根長和發(fā)芽率與對照相比差異顯著，75%的發(fā)酵原液處理后，根長達(dá)到最大，為4.20 cm，根長促生率為37.81%；100%和10%發(fā)酵原液處理后，發(fā)芽率達(dá)到最高，均為98%，發(fā)芽促生率均達(dá)6.81%。25%抽濾發(fā)酵液處理后黃瓜種子的根長最大，達(dá)到5.23 cm，根長促生率為71.59%；25%抽濾發(fā)酵液處理后的發(fā)芽率達(dá)100%，發(fā)芽促生率為8.99%。1%康氏木霉菌滅菌發(fā)酵液處理黃瓜種子3 d 后根長最大，為3.66 cm，根長促生率達(dá)到20.03%；100%和75%滅菌發(fā)酵液處理后，發(fā)芽率均達(dá)到100%，發(fā)芽促生率均為8.99%。綜合分析，康氏木霉菌抽濾發(fā)酵液對黃瓜種子萌發(fā)和根生長的促生作用最強(qiáng)。

表4 康氏木霉菌發(fā)酵液對黃瓜種子生長的影響（3 d）Tab.4 Effects of Trichoderma koningii fermentation broth on cucumber seed growth（3 d）

續(xù)表4 康氏木霉菌發(fā)酵液對黃瓜種子生長的影響（3 d）Tab.4（Continued） Effects of Trichoderma koningii fermentation broth on cucumber seed growth（3 d）

3 結(jié)論與討論

本研究表明，康氏木霉菌株對小麥種子的促生效果優(yōu)于對黃瓜種子的促生效果；對小麥芽長的促生效果優(yōu)于根長的促生效果。

木霉菌對植物的促生機(jī)制表現(xiàn)在4 個方面[26]。首先，木霉菌通過在土壤中產(chǎn)生有機(jī)酸，溶解其中難溶的微量元素，或通過螯合或降解可溶解金屬氧化物，促進(jìn)植物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而促進(jìn)植物生長[27-28]。其次，木霉菌與植物根際微生物發(fā)生互作，在木霉促生效果中起到了重要作用[29-30]。再次，木霉具有強(qiáng)根際定植能力，木霉在植物根際定植后，可提高植物的光合效率，使木霉菌和植物達(dá)到互利共生[31]。最后，木霉可產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)，如吲哚乙酸（IAA）和赤霉素（GA3），在木霉菌促生效果中，植物激素類物質(zhì)起到一定的作用[32]。LI 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，短密木霉（T. brevicompactum）新菌株BF06 可以迅速定植于黃瓜根部表面，對黃瓜幼苗側(cè)根的形成和生長有顯著促進(jìn)作用。張麗榮等[34]研究也發(fā)現(xiàn)，木霉制劑可顯著提高土壤中細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量，以此來改善土壤微生態(tài)環(huán)境?？凳夏久箤S瓜和小麥種子的促生作用有可能是產(chǎn)生吲哚乙酸和赤霉素等植物激素物質(zhì)，從而促進(jìn)植物種子的生長，具體的促生機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。本研究表明，經(jīng)發(fā)酵原液、抽濾發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵液處理后，小麥種子芽長的促生效果表現(xiàn)為滅菌發(fā)酵液優(yōu)于發(fā)酵原液，發(fā)酵原液優(yōu)于抽濾發(fā)酵液；而小麥種子根長的促生效果是發(fā)酵原液優(yōu)于滅菌發(fā)酵液，滅菌發(fā)酵液優(yōu)于抽濾發(fā)酵液。發(fā)酵原液、抽濾發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵液處理后，黃瓜種子根長的促生效果是抽濾發(fā)酵液優(yōu)于發(fā)酵原液，發(fā)酵原液優(yōu)于滅菌發(fā)酵液。針對不同的植物種子，不同形態(tài)康氏木霉發(fā)酵液的生物活性表現(xiàn)具有極大差異，一方面是由于發(fā)酵原液、抽濾發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵液中包含的生物活性因素的差異造成，另一方面，也可能是因?yàn)椴煌参锓N子對生物活性因素的敏感性差異造成。

本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為1.0×105cfu/mL 康氏木霉孢子懸浮液對小麥和黃瓜種子發(fā)芽具有一定抑制效果，康氏木霉抽濾發(fā)酵液對小麥種子的萌發(fā)和芽長生長大多表現(xiàn)為抑制作用，可能是康氏木霉菌產(chǎn)生了具有植物毒性的代謝產(chǎn)物，抑制小麥和黃瓜種子的萌發(fā)和芽生長。WRIGHT 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉在無土培養(yǎng)基上會產(chǎn)生抑制植物生長的綠膠霉素和膠霉毒素。HARAGUCHI 等[36]研究認(rèn)為，膠霉毒素會對植物乙酰乳酸合成酶活性產(chǎn)生影響，對植物生長產(chǎn)生抑制作用?？凳夏久拱l(fā)酵原液經(jīng)過121 ℃高壓滅菌20 min 處理后得到滅菌發(fā)酵液，高溫高壓的處理過程有可能破壞了發(fā)酵液中具有植物毒性的不穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，所以，康氏木霉的抽濾發(fā)酵液與滅菌發(fā)酵液相比，前者對小麥種子生長的抑制作用較強(qiáng)。本研究中滅菌發(fā)酵液對小麥種子的促生效果優(yōu)于抽濾發(fā)酵液，而黃瓜種子表現(xiàn)為抽濾發(fā)酵液的促生效果優(yōu)于滅菌發(fā)酵液，造成這種差異的原因有2 個方面：一方面抽濾發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵液中包含的生物活性因素不同，從而造成促生效果的差異；另一方面是康氏木霉發(fā)酵原液中包含的代謝產(chǎn)物種類很多，且非常復(fù)雜，經(jīng)過滅菌處理后，高溫高壓條件促使某些代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或者生物活性發(fā)生變化，如破壞了其中具有植物毒性的或促生作用的不穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，進(jìn)而造成促生效果的變化。

本研究僅僅對康氏木霉菌株的室內(nèi)促生效果進(jìn)行了初步的探索，為了明確康氏木霉菌株的促生機(jī)制，后期還需開展木霉菌株與植物及根際微生物的互作研究；同時為了提高康氏木霉菌株促生效果應(yīng)用的穩(wěn)定性和廣泛性，還需開展系統(tǒng)的田間促生試驗(yàn)，優(yōu)化促生作用條件，為康氏木霉菌株的生防應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。