骨質(zhì)疏松癥相關信號通路的研究進展

張 薇，熊斌彬，李冰枝，林海鳴

（福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福建 福州 350122）

隨著老齡人口日益增長，骨質(zhì)疏松癥對生活質(zhì)量的影響愈發(fā)受到重視。作為骨代謝相關的常見慢性病之一，其發(fā)病機制還尚未完全闡明，該疾病還未被攻克［1］。研究表明，雌激素缺乏、衰老［1］、氧化應激［2］等都是引起骨質(zhì)疏松的重要因素，近年相關通路也成為學者的研究熱點。現(xiàn)對Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路、Hedgehog-Gli 通路、Notch 通路、骨形態(tài)發(fā)育蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路、沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2 同源蛋白 1（silent matingtype information regulation 2 homolog 1，SIRT1）通路的相關研究進展作一綜述，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 Wnt/β-catenin 信號通路

Wnt 基因是一類由小鼠乳腺癌致病基因和果蠅無翅基因合并命名的分泌型糖蛋白［3］。Wnt/βcatenin 通路又稱經(jīng)典Wnt 信號通路，屬于Wnt 通路中的一種。Wnt 信號通路可以調(diào)控細胞的生長、分化，對機體正常的生長、發(fā)育過程起到重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 通路與成骨細胞增殖分化密切關系，是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點［4］。

該通路的機制是Wnt 蛋白先黏附到細胞膜表面，與膜蛋白受體復合物相結合，隨后激活膜內(nèi)的胞質(zhì)內(nèi)松散蛋白（dishevelled，Dsh），使其磷酸化，抑制胞內(nèi)的四聚體活性，即腺瘤性結腸息肉病基因蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、骨架蛋白、糖原合成酶激酶-3β、β-catenin，使其解體，從而使βcatenin 在胞質(zhì)中含量增加并積聚，后移動到核內(nèi)結合轉錄因子T 細胞因子（T cell transcription factor，TCF）/淋巴增強因子（lymphoid enhancer factor，LEF），形成基因轉錄復合體，最后在相關輔助因子作用下啟動轉錄過程。但胞外Wnt 蛋白缺乏或膜蛋白受體被抑制時，復合物與β-catenin 結合成四聚體，導致磷酸化后 β-catenin 被降解［5］。

Wnt/β-catenin 通路主要通過影響骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）分化為成骨細胞的過程發(fā)揮作用。當BMSCs 數(shù)量不足時，則無法產(chǎn)生足量成骨細胞，使破骨細胞介導的骨吸收相對增加，導致骨質(zhì)疏松癥［6］。此前學者研究主要停留在蛋白水平，在已發(fā)現(xiàn)的19 種Wnt 蛋白中，Wnt1、Wnt7a、Wnt6、Wnt10a 和 Wnt10b 通過該通路推動BMSCs 成骨分化，后3 種還可以抑制其成脂分化［3，7-9］。并且由于各通路間的相互作用，Wnt10b 還可以通過增強BMP/Smad 通路的信號傳導促進 BMP9 誘導 BMSCs 成骨分化［10］。因絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與雌激素水平下調(diào)密切相關，所以雌激素也是學者重點關注的因素之一。此前有研究表明雌激素能正向調(diào)節(jié)BMSCs 的成骨分化，而近年來薛青等［11］的研究再次證實了這個觀點：通過上調(diào)Wnt3a 可以啟動Wnt 通路，促進去勢大鼠骨形成。在已知 Wnt 蛋白中，Wnt3a、Wnt4、Wnt5a 也參與破骨細胞的分化過程［12］。李蕓等［13］以肺腺癌骨轉移小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)益腎固骨方可通過Wnt5a 減少小鼠股骨處破骨細胞表達。近年來逐漸有學者將目光投向了基因水平，Wnt 信號通路能促進BMSCs 分化，正調(diào)控 miRNAs 的產(chǎn)生［14］。有的基因通過上調(diào)該通路的表達起抑制骨質(zhì)疏松的作用。為探討 miR-141 在 Wnt/β-catenin 通路中的作用，LIU和GUO［15］分別使用了Wnt 通路激動劑和抑制劑進行實驗，發(fā)現(xiàn)miR-141 高度表達能增加去勢大鼠模型頜骨中的骨密度水平和骨形成相關標志物。miR-141 可通過激活Wnt 途徑抑制去卵巢大鼠頜骨骨質(zhì)疏松。孫新志等［16］研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA Crnde通過調(diào)節(jié)Wnt 通路促進成骨細胞增殖，正調(diào)控骨形成。而有的基因表達則會抑制該信號通路，若此基因過表達將導致骨質(zhì)疏松癥狀加?。坏侨绻麑⒃摶蜃鳛榘悬c，抑制其表達，則能起治療作用。miR-409-5p 的表達抑制Wnt 通路，從而抑制成骨分化，故在去勢小鼠中沉默miR-409-5p 表達可修復骨小梁微結構并抑制骨吸收［17］。ZHANG 等［18］將目的基因導入BMSCs后進行實驗，結果表明下調(diào)miR-15a-5p 表達可通過 Wnt/β-catenin/PPARγ 信號通路抑制BMSCs 凋亡。因此針對miRNAs 進行靶向治療或將成為骨質(zhì)疏松治療新思路。

2 Hedgehog-Gli 信號通路

Hedgehog（Hh）蛋白最早是由Christiane Nüsslein-Volhard 和Eric F.Wieschaus 在研究果蠅時作為一個“體節(jié)極性”基因發(fā)現(xiàn)的，該基因突變會導致果蠅胚胎呈多刺小球狀，如同刺猬一般，故命名為Hedgehog［19］。有研究認為Hh 信號通路可以調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的分化，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關系［20-21］。

該通路的機制是在沒有Hedgehog 蛋白（Indian hedgehog/Ihh、Sonic hedgehog/Shh、Desert hedgehog/Dhh）的情況下，特異性受體Patched（Ptc）抑制Smoothened（Smo）的轉移和活性，使下游靶基因轉錄受抑制；而當 Hedgehog 蛋白與 Ptc 結合，解除對 Smo 抑制時，Smo 與胞內(nèi)信號分子結合形成復合物，使Gli 與蛋白激酶A 結合導入細胞核內(nèi)，與目的基因啟動子結合，激活轉錄［22］。

Hh 通路不僅可以通過調(diào)控成骨細胞介導的骨形成過程，還可以通過刺激破骨細胞的核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表達促進增殖分化，從而調(diào)控骨吸收過程。宋斌等［23］分析研究數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，沉默miR-152 的小鼠骨重建平衡相關指標BMP-2、Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）表達量升高，RANKL 蛋白表達量降低，Hh 通路 Shh、Gli1蛋白表達量均升高，明顯促進骨重建失衡恢復。鄧洋洋等［24］用補腎活血中藥干預去勢大鼠，檢測股骨與腎中Ihh 含量后得出Ihh 含量降低與骨質(zhì)疏松有關的結論。高舉會等［20］通過探究左歸丸對骨質(zhì)疏松作用發(fā)現(xiàn)：上調(diào)去勢大鼠Smo、Gli1 可以激活Hh 通路，以達治療骨質(zhì)疏松的目的。梁學振等［25］研究結果顯示，通過補腎活血膠囊含藥血清干預可以誘導Hh 通路對BMSCs 成骨分化的正向調(diào)控，并抑制其成脂分化。Hh 通路一方面可通過刺激成骨細胞生長促進骨形成，另一方面又可刺激破骨細胞活性，促進骨吸收。Hh 通路表達和性別、年齡都有一定關系，LI 等［26］發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏可以使去卵巢小鼠體內(nèi)Hh 通路上調(diào)，誘導破骨細胞分化以促進骨吸收。MATSUMOTO 等［27］通過研究比較發(fā)現(xiàn)，Shh 可直接刺激老年小鼠破骨細胞形成，但是對于幼齡小鼠則刺激成骨細胞形成，并通過骨保護素間接抑制破骨細胞的形成。正是因為Hh 通路的雙向調(diào)控作用，使其在骨代謝中具有重要作用。

3 Notch 通路

Notch 是一種跨膜受體兼轉錄因子，與細胞生長、分化密切相關，因此可以參與人體的多種功能，如與各種遺傳疾病和癌癥有關，與骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展也密切相關［28］。

該通路的機制是Notch 的配體（Delta1、Delta3、Delta4 和 Jagged1、Jagged2）和受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）相互作用。Notch受體分為胞外結構域、胞內(nèi)結構域（Notch intracellular domain，NICD）和跨膜結構域。NICD 缺失會抑制Notch 靶基因的轉錄。Notch 未激活時，重組信號結合蛋白jκ（recombination signal binding protein jκ，RBPjκ）與轉錄抑制因子結合。Notch 經(jīng)3 次酶切與配體結合活化后經(jīng)γ-分泌酶復合體識別并釋放NICD，NICD 在胞核內(nèi)與DNA 結合蛋白結合為轉錄復合物，使其與轉錄抑制因子解離，啟動轉錄因子，調(diào)控靶基因轉錄［29-30］。

Notch 信號通路對成骨細胞、破骨細胞和BMSCs 的功能調(diào)節(jié)均有重要影響。有部分學者認為Notch1 的激活可誘導 RANKL 抑制劑 OPG 表達，從而抑制骨吸收。還可以抑制硬化蛋白和Dkk1，增強 Wnt 信號，使成骨細胞分化，促進骨形成［31］。Notch1a 胞內(nèi)區(qū)在成骨細胞中過表達甚至會導致骨質(zhì)增生［32］。也有學者持相反觀點，認為Notch 通路抑制成骨細胞分化：Notch1 激活時，通過抑制成骨細胞特異性轉錄因子（osterix，Osx）、Runx2 和 βcatenin 抑制成骨細胞生成［33］。王貴玲等［34］證明miR-34a-5p 通過抑制Notch1 通路促進成骨分化。研究表明Notch 激活不僅抑制成骨細胞分化，其持續(xù)激活還將一同抑制BMSCs 的成骨分化［35］。除此之外，多項實驗結果提示Notch 通路對破骨細胞同樣具有抑制作用，平依林等［36］通過體外病毒轉染的方法使Notch1 蛋白高表達，刺激Notch 通路。該實驗結果顯示Notch1 的高表達對于RANKL 和巨噬細胞集落刺激因子誘導的破骨細胞的增殖分化過程產(chǎn)生了抑制效應。張濤等［37］研究證明高表達miR-187 對于調(diào)控Notch 通路作用于破骨細胞的強大作用，高表達該基因不但可以抑制破骨細胞增殖，同時還能誘導破骨細胞凋亡。王汝杰等［38］研究表明Notch 通路的配體Jagged1 可以抑制RAW 264.7 細胞的增殖，與何飛等［39］結果相一致。但也有相反的觀點認為Notch2 的 NICD 與NF-κB 相關，誘導破骨細胞增加，促進了骨吸收。因存在不同的觀點，所以還需要進一步深入研究，以闡明作用機制。

值得注意的是，Notch 通路與其他通路之間的聯(lián)系尤為密切。王君等［40］分別刺激或抑制RANKL通路和Notch 通路中相關分子的表達，數(shù)據(jù)顯示Notch1 對RANKL 有負調(diào)控作用，可以影響破骨細胞的分化及溶骨效應。COLOMBO 等［41］研究表明，Notch 的激活可以促進破骨細胞生成因子RANKL的分泌，Notch2 可以通過促進RANKL 信號的分泌刺激破骨細胞的分化。

4 BMP 通路

BMP 是TGF-β 超家族的一種組成成分，通過與存在于細胞表面的受體結合來執(zhí)行不同的功能［42］。而 Smad 是 BMP 受體下游的轉錄調(diào)節(jié)因子，BMP 通過與其受體結合在骨骼生長和發(fā)育過程中發(fā)揮作用［43］。

該通路的機制是在調(diào)節(jié)骨代謝過程中，分為經(jīng)典Smad 途徑和非經(jīng)典絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）途徑。經(jīng)典途徑中，BMPs 先和細胞膜上的特異性受體結合，使BMPR-1 磷酸化后再與Smad 蛋白（主要為Smad1、Smad5、Smad8）結合，該復合物進入細胞核后激活Runx2、Osx 等轉錄因子，誘導BMSCs 向成骨細胞分化［44-45］。非經(jīng)典途徑中，BMP 通過激活 TAK1/2-MEK1/2-ERK1/2 通路，調(diào)節(jié)靶基因表達，影響成骨分化過程。這2 條通路之間可相互聯(lián)系。

BMP 在介導骨形成過程中發(fā)揮重要作用［46］。BMPs 分為 4 個亞族，其中 BMP2、BMP6、BMP7 和BMP9 有骨愈合促進作用，而 BMP3、BMP13 則對骨生長起負性調(diào)節(jié)作用［47-48］。目前基于該通路利用傳統(tǒng)中藥對骨相關疾病治療的研究不在少數(shù)。王皓等［49］發(fā)現(xiàn)骨化三醇膠囊可通過激活BMP-2/Smad/Runx2 通路，促進成骨分化。柴爽等［50］發(fā)現(xiàn)補腎健脾活血方可以通過調(diào)控BMP-2/Smad 通路的信號上調(diào)Runx2 表達以促進成骨細胞分化，還可以上調(diào)OPG 表達抑制破骨細胞分化。在基因層面，TANG等［51］表明在成骨分化過程中IncRNA-OG 的表達上調(diào)了 12 倍，且 IncRNA-OG 與 hnRNPK 在 BMSCs 的細胞核中可以形成復合物，證明IncRNA 促進成骨分化。還有其他研究證明miR-144 和miR-224 靶向 Smad 抑制 BMSCs 成骨分化［52-53］。

5 SIRT1 通路

SIRT1 是一種去乙?；福c多條通路聯(lián)系密切，間接作用于其他通路。SIRT1 主要在BMSCs 中表達，對BMSCs 的多向分化起調(diào)節(jié)作用。在骨重建過程中，SIRT1 促進BMSCs 成骨細胞分化，抑制破骨細胞分化。骨祖細胞中存在一種骨形成抑制因子——叉形頭轉錄因子的O 亞型1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1），其作用機制為減弱Wnt 轉導和骨祖細胞的增殖。而SIRT1 可以通過驅動FOXO1 和βcatenin 去乙?；偈筗nt 信號轉導和成骨細胞生成［54］。 SIRT1 還 可 以 通 過 作 用 于 Runx2 通 路 和TGF-β 通路，促進 BMSCs 的成骨分化進程［55-56］。SIRT1 對相關轉錄因子也有調(diào)控作用，PPARγ2 是成脂分化的關鍵分子，會抑制BMSCs 向成骨細胞分化，它可以被SIRT1直接抑制，或通過運用PPARγ拮抗劑干預間接使成脂分化方向受阻，使SIRT1 推動BMSCs 向成骨細胞分化。同時還發(fā)現(xiàn)在基因分子水平研究中miR-146a-5p 直接靶向SIRT1 抑制成骨細胞活性。抑制miR-146a-5p 在骨形成中的表達有助于預防衰老和雌激素減退引起的骨丟失［57］。H2O2處理可以模擬成骨細胞的凋亡和氧化應激的增加，YAO等［54］基于對新生小鼠顱骨MC3T3-E1 細胞的H2O2處理發(fā)現(xiàn)：在SIRT1 過表達的成骨細胞中，ROS 水平升高的程度減少，說明SIRT1 適度過表達可以降低氧化應激來提高成骨細胞存活率，這與β-catenin 和FOXO1 途徑的特異性靶基因表達有關。

6 小 結

除了上述目前研究較多的信號通路外，還存在如 RANKL 通路［58］、腺苷酸活化蛋白激酶［Adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］通路［59］、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）通路［47］、PI3K/Akt 通路［60］、MAPK 通路［61］等通路，都對于骨質(zhì)疏松癥的機制探究有意義。

綜上所述，信號通路可以通過作用于BMSCs、成骨細胞或破骨細胞的增殖分化影響骨代謝，若其調(diào)節(jié)失衡則會產(chǎn)生骨質(zhì)疏松的風險。目前學術界對于該病的信號通路研究大多還停留在單一信號通路，但近年來逐漸有學者意識到該疾病機制復雜，可能涉及多種通路相互作用。只有更深入交叉研究各通路間的關系才能徹底闡明骨質(zhì)疏松的發(fā)生機制。目前已發(fā)現(xiàn)有傳統(tǒng)中藥作用于多條信號通路治療骨質(zhì)疏松的研究，梁倩欣等［62］借助網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)骨康方中藥治療骨質(zhì)疏松起效與方劑中各君、臣、佐、使作用于通路有關，雖然每種中藥有各自特有的靶點與通路，但都以MAPK 通路為樞紐聯(lián)系，共同調(diào)控，以達到最佳療效。黃勝男等［63］通過探究左歸丸在骨質(zhì)疏松治療中的作用機制，發(fā)現(xiàn)其靶標網(wǎng)絡也具有多靶點，借助多條交錯復雜的不同通路作用于成骨和破骨過程，以達治療目的。隨著研究的深入，靶向的定位清晰，有望揭示骨質(zhì)疏松癥及其他骨代謝相關疾病的分子機制，為研制具有針對性的靶向藥物提供理論依據(jù)。