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    小檗堿調(diào)控核因子κB信號轉導通路對幽門螺桿菌感染人胃癌細胞的影響

    2022-11-16 07:56:56徐艷霞劉圓圓
    世界中醫(yī)藥 2022年12期
    關鍵詞:黃連素信號轉導介素

    高 煒 徐艷霞 劉圓圓 徐 媺

    (青島市中心醫(yī)院/青島市腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結合科,青島,266042)

    胃癌屬于臨床上較為常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤,隨著人們生活方式的不斷改變其發(fā)病率正呈逐年上升趨勢,已成為嚴重威脅人類生命安全的重大疾病之一[1]。且有研究報道表明,幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori,Hp)感染可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程,促進了胃黏膜細胞的凋亡[2]。目前,臨床上廣泛用以治療胃癌的化療藥物普遍存在細胞毒性,患者接受治療后往往會出現(xiàn)嚴重不良反應,從而影響治療效果以及患者的預后轉歸[3]。因此,近年來不少醫(yī)學研究人員開始將研究重點轉移至從天然藥物內(nèi)尋求存在抗腫瘤活性,且毒性較低的成分。小檗堿主要是由黃連等天然植物中提取而來,具有一定的抑制腫瘤細胞增殖作用[4]。鑒于此,現(xiàn)通過研究小檗堿調(diào)控核因子κB信號轉導通路影響Hp感染人胃癌細胞增殖與炎癥反應的影響并予以分析,深入探究小檗堿應用于胃癌中的可能機制,繼而為臨床胃癌的治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞 Hp標準菌株由課題組細胞培養(yǎng)室獲得。胃癌HGC-27細胞系購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏細胞庫傳代獲得。

    1.1.2 藥物 小檗堿(碧云天生物技術公司,批號:040801),質量分數(shù)≥98%。

    1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國,貨號:16000-044、12800017)。超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司,型號:SCB-1360)。二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國,型號:311)。酶標儀(Perkin Elmer公司,美國,型號:EnSpire)。DAB顯色試劑盒(博士德生物公司,批號:AR1026)。

    1.2 方法

    1.2.1 分組與模型制備 建立Hp感染人胃癌細胞模型:胃癌HGC-27細胞系培養(yǎng)在普通的DMEM培養(yǎng)基中,配方添加了10%的胎牛血清,1%雙抗儲存液的DMEM的培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。Hp的培養(yǎng)條件氣體環(huán)境是:5%氧氣、85%氮氣及10%二氧化碳,濕度要求為95%。采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d并且通過紫外分光光度計進行計數(shù)。按照比例關系將Hp加入到胃癌細胞中進行共同培養(yǎng),檢測Hp對胃癌細胞增殖的影響。

    將上述1)細胞模型分成4組,包括對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組。其中對照組則予以等量生理鹽水干預;黃連素組予以100 μg/mL濃度小檗堿干預;5-氟尿嘧啶組予以5 μg/mL的5-氟尿嘧啶干預;黃連素+5-氟尿嘧啶組則同時予以上述劑量的小檗堿和5-氟尿嘧啶干預;每組設3個復孔。

    1.2.2 檢測指標與方法 以流式細胞儀完成細胞周期的檢測Hp和胃癌細胞共同培養(yǎng)3 d后,將對照組和其他組細胞進行消化,磷酸鹽緩沖液洗過之后用細胞周期檢測試劑盒的實驗步驟進行處理,然后在BD FACSCalibur細胞儀上進行分析,最后的實驗結果通過flow Jo軟件進行分析。

    胃癌細胞增殖情況評估:將Hp感染人胃癌細胞進行消化計數(shù),在96孔板中每個孔加入1 000個細胞,12 h后檢測第1次細胞活力檢測試劑盒(CCK8)數(shù)值,剩余的樣本待細胞貼壁后按比例關系將Hp加入到B~黃連素+5-氟尿嘧啶組中,各組都有3個孔的重復,24 h,48 h和72 h之后再次檢測CCK8數(shù)值。

    核因子κB信號通路相關蛋白表達檢測:采集上述上清液以Bradford法測定IκB激酶α以及P65蛋白濃度。將20 μg蛋白和6×SDS加樣緩沖液混合,以100 ℃煮沸5 min,實施10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。在室溫條件下封閉4 h加入相應的一抗,4 ℃過夜后洗去一抗,并加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗,反應2 h。最后以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,光密度掃描定量分析。相關抗體均購自美國Santa Cruz公司,貨號:91-95-2。

    炎癥反應指標檢測:調(diào)節(jié)細胞密度至1×105個/mL,接種在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL,于37 ℃的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行24 h的培養(yǎng)。預處理1 h后,于37 ℃的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行24 h的培養(yǎng)。手機細胞上清液,遵循酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書完成白細胞介素-4、白細胞介素-6水平的檢測。相關試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司,貨號:94218-72-1。

    2 結果

    2.1 各組Hp感染人胃癌細胞增殖情況比較 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組干預后2 d、3 d時的胃癌細胞增殖率呈逐漸下降趨勢,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1、圖1。

    圖1 不同處理方式對Hp感染人胃癌細胞增殖的影響

    表1 各組Hp感染人胃癌細胞增殖

    2.2 各組Hp感染人胃癌細胞周期變化比較 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組感染人變化比較胃癌細胞G0/G1期、S期呈逐漸下降趨勢,而G2/M期呈逐漸升高趨勢,各組差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

    表2 各組Hp感染人胃癌細胞周期變化比較

    2.3 各組核因子κB信號通路相關蛋白表達比較 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組IκB激酶α表達水平呈逐漸升高趨勢,而P65蛋白表達水平呈逐漸降低趨勢,各組差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表3、圖2。

    表3 各組核因子κB信號通路相關蛋白表達比較

    圖2 各組IκB激酶α表達(HE染色,×400)

    2.4 各組炎癥反應指標水平評價 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組白細胞介素-4水平呈逐漸升高趨勢,而白細胞介素-6呈逐漸下降趨勢,且經(jīng)單因素方差分析可知各組差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表4。

    表4 各組炎癥反應指標水平評價

    3 討論

    目前,臨床上已有不少研究報道證實,Hp感染在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起至關重要的作用,屬于胃癌危險因素之一,且臨床上超過50%的胃癌患者均可檢測到Hp感染[5-7]。雖然近年來針對胃癌的治療手段有明顯的進步,但療效以及預后均無法令人滿意,鑒于胃癌的高發(fā)病率以及高死亡率,探討胃癌的具體發(fā)病機制,并以此為依據(jù)尋找有效的治療手段是研究學者的首要任務[8-10]。核因子κB屬于哺乳動物細胞核轉錄因子之一,與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,核因子κB信號轉導通路于多種腫瘤中均處于活化狀態(tài),介導了腫瘤的侵襲以及轉移過程[11-13]。由此可見,Hp感染可能是通過核因子κB信號轉導通路,實現(xiàn)對胃癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控,針對這一機制尋求一種有效的藥物治療方案具有極其重要的意義。小檗堿是近年來胃癌治療研究的熱點[14-16],然而關于其對胃癌細胞核因子κB信號轉導通路是否產(chǎn)生影響尚無研究證實,具有一定的研究價值。

    本研究結果發(fā)現(xiàn),小檗堿的應用可明顯抑制胃癌細胞的增殖,且在和5-氟尿嘧啶聯(lián)合應用時的抑制效果更為明顯。小檗堿可通過將細胞阻滯在G0/G1期,從而促使細胞無法進入S期合成DNA,進一步誘導胃癌細胞的凋亡,同時促使腫瘤細胞增殖受到明顯抑制,最終發(fā)揮治療胃癌的作用[17-18]。此外,對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組感染人胃癌細胞G0/G1期、S期呈逐漸下降趨勢,而G2/M期呈逐漸升高趨勢,各組差異有統(tǒng)計學意義。這提示小檗堿抑制胃癌細胞增殖的可能機制在于誘導腫瘤細胞周期阻滯在G1期、S期或G2/M期,從而抑制胃癌細胞的DNA以及蛋白質合成,最終發(fā)揮抑制胃癌細胞增殖的作用。另外,P65可通過和P50結合形成異二聚體,后者屬于核因子κB的重要活化形式,且在正常生理狀態(tài)下,核因子κB(P65/P50)與IκB激酶α結合,從而以無活性的復合物定位在細胞質內(nèi),當細胞遭受細胞因子或氧化應激刺激時,會引起核因子κB(P65/P50)與IκB激酶α的分離,且IκB激酶α會出現(xiàn)降解,進一步影響靶基因的轉錄以及表達,介導調(diào)控細胞增殖、凋亡以及轉化,最終影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉移過程。而本研究結果發(fā)現(xiàn),對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組IκB激酶α蛋白表達水平逐漸升高趨勢,而P65蛋白表達水平呈逐漸降低趨勢,各組差異有統(tǒng)計學意義。由此可見,小檗堿可能是通過調(diào)控核因子κB信號轉導通路相關蛋白的表達,繼而發(fā)揮抑制Hp感染人胃癌細胞增殖的作用。本研究結果還顯示,對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組白細胞介素-4水平呈逐漸升高趨勢,而白細胞介素-6呈逐漸下降趨勢,各組差異有統(tǒng)計學意義。其中白細胞介素-6屬于炎癥起始階段重要的炎癥介質之一,與急性期炎癥反應中可促進反應蛋白的產(chǎn)生以及關節(jié)軟骨組織的損害。白細胞介素-4則是一種抗炎因子,可有效抑制多種炎癥介質的表達。二者均被相關研究報道參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程[19-20]。由此可見,調(diào)控核因子κB信號轉導通路影響炎癥介質的表達,可能亦是小檗堿抗胃癌的重要機制之一。

    綜上所述,小檗堿具有明顯的抑制Hp感染人胃癌細胞增殖與炎癥反應作用,而發(fā)揮上述作用的主要機制可能和調(diào)控核因子κB信號轉導通路相關蛋白的表達有關,值得臨床重點關注。

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