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    燧心膠囊對心力衰竭大鼠心肌纖維化的保護作用

    2022-11-16 08:19:52郭丹丹于思明李佳卓許文婷董柏涵
    世界中醫(yī)藥 2022年12期
    關鍵詞:纈沙坦氧化應激纖維化

    郭丹丹 于思明 李佳卓 許文婷 董柏涵

    (黑龍江中醫(yī)藥大學,哈爾濱,150040)

    心力衰竭(Heart Failure,HF)是心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要的死因,幾乎所有HF患者都有左心室迅速惡化的風險,但其具體機制尚不清楚[1]。研究表明,心肌纖維化參與了HF的進展,HF患者的左心室(Left Ventricular,LV)發(fā)現(xiàn)了心肌膠原纖維的顯著積累[2]。因此,闡明心肌纖維化的機制,尋找抗心肌纖維化的藥物對HF的治療具有重要意義。燧心膠囊為黑龍江中醫(yī)藥大學國家級名老中醫(yī)李延教授經(jīng)驗方,由真武湯與陳士鐸“引火湯”化裁而來,具有提高LV射血分數(shù),改善HF患者的臨床癥狀的功效[3]。研究發(fā)現(xiàn),心肌細胞凋亡在HF中發(fā)揮重要作用[4]。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)是細胞能量的感受器和代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)器,其激活對改善線粒體生物發(fā)生有重要作用[5]。此外,心臟AMPK活性降低被認為會增強心臟對果糖脂肪喂養(yǎng)大鼠缺血再灌注損傷的程度[6]。最近的研究表明,AMPK可以通過刺激核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關因子(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2,Nrf2)依賴地血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)的上調(diào)來抑制氧化應激,并且在哺乳動物心肌能量代謝方面發(fā)揮著重要作用[7]。本研究建立了大鼠HF模型,探討燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的保護作用及其潛在信號機制,特別關注了AMPK/Nrf2信號,為燧心膠囊治療HF提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠180~200只,體質(zhì)量(200±20)g,購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(黑)2016-004,在黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心按無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級操作規(guī)程適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。本研究符合國家醫(yī)學倫理相關規(guī)定。

    1.1.2 藥物 燧心膠囊由紅參、制附子、熟地黃、麥冬、五味子、丹參、茯苓、白術(shù)、澤瀉組成,為黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院自制藥,掉膠囊皮,用蒸餾水溶解后進行2次煎煮(30 min/次),合并水煎液后進行濃縮,進行醇沉,將醇沉物用蒸餾水進行溶解,配成生藥量為5.2 g/mL的溶液,分裝滅菌,4 ℃冷藏備用;阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司,國藥準字H44024359);纈沙坦膠囊(湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司,國藥準字H20103521)。

    1.1.3 試劑與儀器 Masson染液(上海碧云天生物技術(shù)研究所,批號:954264);活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:954612、631154、687912);RIPA裂解緩沖液(上海生工生物工程有限公司,批號:20052342);AMPK、Nrf2、HO-1、β-肌動蛋白和辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司,美國,貨號:8457516、7538219、8124337、6434719);VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,型號:VM7型);ASP300S型組織脫水機和Leica RM2255型全自動輪轉(zhuǎn)切片機等病理配套設備(Leica公司,德國,型號:ASP300S型和Leica RM2255型);光學顯微鏡(Nikon公司,日本,型號:ECLIPSE MA200型);HBS-1096B型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司,型號:HBS-1096B型);BIO-RAD垂直電泳儀(BIO-RAD公司,美國,Mini-Protean型);凝膠成像儀(UVP公司,美國,型號:GelCam 310型)。

    1.2 方法

    1.2.1 分組及造模 選60只成年雄性SD大鼠均分為對照組、模型組、燧心膠囊低劑量組、燧心膠囊中劑量組、燧心膠囊高劑量組和纈沙坦組。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(2 mL/kg),其余各組大鼠腹腔注射阿霉素溶液(2 mg/kg),1次/周,連續(xù)6周,以多普勒超聲顯示左室射血分數(shù)(Left Ventricular Ejection fraction,LVEF)≤45%為HF模型成功標志[8]。

    1.2.2 給藥方法 造模成功后次日,燧心膠囊低、中、高劑量組依次灌胃給予燧心膠囊(1.3 mg/kg、2.6 mg/kg、5.2 mg/kg)[9],纈沙坦組灌胃給予纈沙坦(13.35 mg/kg)[10],1次/d,假手術(shù)組和模型對照組給予等量生理鹽水,各組連續(xù)給藥8周。

    1.2.3 檢測指標與方法 心功能檢測:末次給藥1 h后,對大鼠進行麻醉后平臥位固定,將探頭置于胸骨左緣,取左室長軸最大直徑處,標記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內(nèi)膜位置,采用VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀分別測量LVEF、左室縮短分數(shù)(Left Ventricular Fractional Shortening,LVFS)、左室收縮期末內(nèi)徑(Left Ventricular End-systolic Dimension,LVSD)、左室舒張末內(nèi)徑(Left Ventricular End-Diastolic Dimension,LVDD),取5個心動周期求平均值。

    大鼠心臟組織形態(tài)學檢查:做完心功能檢測后處死大鼠,分離心臟,沿左心室中部橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織,進行甲醛溶液固定,剩余心臟組織進行凍存。固定的組織經(jīng)脫水,包埋、切片(4 μm)后進行Masson染色,用顯微鏡觀察心臟纖維化變化。

    心臟組織中ROS、GSH和SOD水平檢測:稱取100 mg心臟組織,用預冷生理鹽水沖洗3次,按1 mL/100 mg的比例加入生理鹽水,制成勻漿,離心半徑10 cm離心10 min取上清,根據(jù)試劑盒說明書檢測心臟組織中ROS、GSH和SOD水平。

    蛋白質(zhì)印跡法檢測心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平:稱取100 mg心臟組織,制成勻漿,加入1 mL RIPA裂解緩沖液,離心后取上清,進行電泳(30 μg/孔)、轉(zhuǎn)膜,孵育AMPK(1∶200)、Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶400)和β-肌動蛋白(1∶1 000)抗體,過夜(4 ℃),用IgG抗體(1∶10 000)在室溫下孵育(30 min),顯色,采集圖像進行分析。

    2 結(jié)果

    2.1 燧心膠囊對HF大鼠心功能的影響 與對照組比較,模型組大鼠LVEF和LVFS水平降低、LVSD和LVEDD水平升高(P<0.05),模型組大鼠造模成功;與模型組比較,各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠LVEF和LVFS水平增高,LVSD和LVEDD水平降低,各燧心膠囊組大鼠LVEF、LVFS、LVSD和LVEDD水平隨燧心膠囊劑量增加而變化,但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表1。

    表1 燧心膠囊對HF大鼠心功能的影響

    2.2 燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的影響 在Masson染色中,心肌細胞染色為暗紅色,膠原蛋白被染色為藍色;對照組大鼠心肌細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰;模型組組大鼠心肌細胞排列不規(guī)則、細胞肥大、細胞間出現(xiàn)大量的纖維組織;各燧心膠囊劑量組和纈沙坦組大鼠心肌細胞排列尚整齊,細胞輕度肥大,伴有不同程度的纖維組織增生,較模型組明顯減輕,其中纈沙坦組大鼠改善最為顯著。見圖1。

    圖1 燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的影響(Masson染色,×400)

    2.3 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中ROS、GSH和SOD水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠ROS水平升高,GSH和SOD水平降低(P<0.05);與模型組比較,各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠ROS水平降低,GSH和SOD水平升高,各燧心膠囊組大鼠ROS、GSH和SOD水平隨燧心膠囊劑量增加而變化,但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表2。

    表2 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中ROS、GSH和SOD水平的影響

    2.4 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平降低(P<0.05);與模型組比較,各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平升高,各燧心膠囊組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平隨燧心膠囊劑量增加而變化,但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表3。

    表3 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響

    圖2 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響

    3 討論

    現(xiàn)代中醫(yī)認為HF的病機主要是本虛標實,其中本虛以心氣虛、心腎陽虛為主。溫陽法是HF的常用治法,中醫(yī)學的“引火歸元”理論具有較重要的指導意義,引火歸元在溫振心陽的同時,增強了腎臟對上炎之火的收納,使君火相火上下相濟,從而達到溫陽而不礙邪的理想狀態(tài)[11]。燧心膠囊以溫腎助陽、引火歸元、化氣行水為治則。方中以制附子為君,既補心火,又助腎陽;紅參大補元氣,復脈固脫,益氣安神;熟地黃補腎水,麥冬滋肺陰,金水相生,水火既濟,各安本位。再以茯苓、白術(shù)、澤瀉導水趨下,使“妄火”隨之下行,歸于腎水;又佐以丹參活血養(yǎng)血,化瘀通絡,祛除痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物,且能調(diào)暢氣機,從而達到“陰平陽秘”的平衡狀態(tài)[12]。本研究結(jié)果顯示,燧心膠囊能改善HF大鼠心功能,證實了上述中醫(yī)理論。纖維化可能在舒張功能障礙和收縮泵功能方面發(fā)揮重要作用,是致死性心律失常的結(jié)構(gòu)基質(zhì)之一,從而在HF的進展和猝死中發(fā)揮重要作用[13]。研究證明,心肌纖維化的減少與高血壓患者接受不同抗高血壓藥物(如纈沙坦)長期治療時左室功能參數(shù)的改善有關[14]。本研究結(jié)果顯示,纈沙坦能抑制減少HF大鼠心肌纖維化的產(chǎn)生,燧心膠囊也有類似作用,雖然其作用不如纈沙坦,但纈沙坦只能維持HF的穩(wěn)態(tài)。因此,研究燧心膠囊治療HF具有重要意義。

    HF可導致心肌組織氧化應激和能量代謝紊亂,誘導線粒體功能障礙,增加ROS的產(chǎn)生,進而導致心肌氧化應激損傷,凋亡或壞死[15]。ROS的生理濃度對于維持基礎細胞的活動至關重要,但過量產(chǎn)生的ROS可導致氧化應激的誘導。阿霉素會導致氧化應激和心臟結(jié)構(gòu)改變,最終導致心肌損害。阿霉素增加了心臟組織對ROS的敏感性,同時降低抗氧化劑如谷胱甘肽過氧化物酶、GSH和SOD活性[16]。具有抗氧化活性的各種天然產(chǎn)物已被證明可恢復HF大鼠中這些抗氧化劑的功能。燧心膠囊的配方中有多種物質(zhì)具有抗氧化活性,在心肌梗死引起的心肌損傷過程中發(fā)揮心臟保護作用,降低丙二醛含量和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表達,并增強SOD活性,從而抵抗氧化應激[17]。本研究結(jié)果顯示,燧心膠囊組能降低HF大鼠心臟中ROS水平,同時增加GSH和SOD水平,發(fā)揮一定的抗氧化活性。此外,燧心膠囊通過激活AMPK/Nrf2通路,發(fā)揮抗纖維化作用。然而,目前尚無直接的研究表明心肌系統(tǒng)中AMPK/Nrf2通路參與HF大鼠心肌纖維化調(diào)控,這正是本研究的創(chuàng)新性。

    AMPK/Nrf2通路是一條公認的氧化應激途徑。AMPK刺激上調(diào)了線粒體的生物發(fā)生,增加ATP生成,從而調(diào)節(jié)細胞能量含量,這對于抑制阿霉素引發(fā)的氧化應激是必要的。AMPK抑制加重了壓力超載誘導的阿霉素喂養(yǎng)大鼠左心室肥厚[18]。在果糖飲食誘導的2型糖尿病中,氧化應激會觸發(fā)AMPK磷酸化,從而刺激Nrf2及其下游抗氧化酶(包括HO-1),給予AMPK抑制劑可抑制AMPK磷酸化,而且可以降低糖尿病心肌中Nrf2和HO-1的表達[19]。此外,AMPK刺激通過調(diào)節(jié)線粒體貯存和Nrf2通路,對產(chǎn)前應激誘發(fā)的認知缺陷的神經(jīng)保護作用[20]。Nrf2也被認為與炎癥小體的刺激有關,通過誘導線粒體生物發(fā)生,Nrf2的激活保護心肌細胞免受阿霉素誘導的心肌病[21]。同時,Nrf2會激活HO-1信號來保持復合體Ⅰ,復合體Ⅳ活性和線粒體膜電位,從而減少腦缺血再灌注引起的線粒體氧化損傷[22]。此外,Nrf2還通過抑制炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄來阻斷炎癥反應,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥小體的激活需要通過抑制Nrf2表達,本研究將在后續(xù)的研究中進行完善[23]。

    綜上所述,燧心膠囊可通過降低心臟氧化應激水平及激活AMPK/Nrf2通路,抑制HF大鼠心肌纖維化,為燧心膠囊治療HF纖維化提供了理論依據(jù)。

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