基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討肉蓯蓉苯乙醇總苷對肝細胞癌的潛在分子機制

張嘉偉 文麗梅 胡君萍 楊建華

(1 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊，830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊，830011)

原發(fā)性肝癌是全球高發(fā)病率和致死率的惡性腫瘤之一，5年內(nèi)的生存率僅為7%[1]。肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是其中最主要的病理類型，占85%以上[2]。最新數(shù)據(jù)表明，我國HCC的病死率和發(fā)病率分別排在所有惡性腫瘤的第3位和第4位，具有發(fā)展較快、易復(fù)發(fā)的特點[3-4]。肝癌的病因和發(fā)病機制尚不清楚，其發(fā)生可能與宿主基因多態(tài)性、環(huán)境因素(包括代謝綜合征和黃曲霉毒素B1)、飲酒和病毒因素(包括乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染)的相互作用有關(guān)[5]。中藥可用于晚期HCC患者，具有抗腫瘤、減少放療化療的不良反應(yīng)、提高腫瘤患者免疫力、改善生命質(zhì)量等作用[6]。

肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖[7]，具有補腎、益精、潤燥、通便的功效，是我國西北干旱地區(qū)特有的名貴補益類藥材，應(yīng)用歷史悠久。肉蓯蓉始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味甘、微溫。主五勞七傷，補中，除莖中寒熱痛，養(yǎng)五臟，強陰，益精氣，多子，婦人癥瘕，久服輕身”，被列為上品[8]。肉蓯蓉苯乙醇總苷(Phenylethanoid Glycosides from Cistanche，CPhGs)作為肉蓯蓉中的主要有效成分，包括毛蕊花糖苷、松果菊苷、紅景天苷、2′-乙?；锘ㄌ擒铡⒐芑ㄜ誃等[9]，具有肝臟保護、抗癡呆、抗疲勞、缺血保護、抗骨質(zhì)疏松、潤腸通便、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老及改善生殖等作用[10]。已有研究證明，CPhGs具有良好的防治肝癌作用。Yuan等[11]的研究表明CPhGs通過外源性和內(nèi)源性凋亡途徑抑制H22細胞的生長。胡瓊等[12]發(fā)現(xiàn)CPhGs能夠抑制肝癌細胞的生長，這可能與CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP的含量，提高荷瘤小鼠的免疫力有關(guān)。目前，尚未發(fā)現(xiàn)針對CPhGs防治HCC作用及其分子作用機制的深入研究，其活性成分、作用靶點及分子機制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將現(xiàn)有的“一靶一藥”方式更新為“網(wǎng)絡(luò)靶點-多成分”的研究方式，即在此基礎(chǔ)上對中藥的療效進行綜合分析，從系統(tǒng)視角和分子水平探索中醫(yī)藥，構(gòu)建中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)新思路[13-14]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，基于中醫(yī)藥整體觀，對CPhGs防治HCC的作用機制進行系統(tǒng)探討，結(jié)合“中藥-活性成分-靶點-信號通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)模式，預(yù)測CPhGs防治HCC作用的關(guān)鍵靶點及作用機制，并利用分子對接技術(shù)進行驗證，闡述CPhGs多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用機制，為顯著提升CPhGs的藥用資源開發(fā)領(lǐng)域，為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 CPhGs類成分的收集 通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(Encyclopaedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID)等數(shù)據(jù)庫并結(jié)合國家知識基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)、PubMed數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻，收集CPhGs類的化學(xué)成分及靶點信息。通過在TCMSP、ETCM、TCMID數(shù)據(jù)庫及文獻內(nèi)檢索，最終確定29個化合物作為候選化合物[15-16]。

1.2 藥物潛在治療靶點的預(yù)測及“中藥-活性成分-靶標”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將檢索得到成分的SDF格式文件導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫，進行潛在靶點的預(yù)測分析，并采用UniProt KB搜索功能對靶點名稱進行校正。運用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 HCC相關(guān)基因的篩選 將“Hepatocellular Carcinoma”“HCC”作為關(guān)鍵詞在以下4個數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲得HCC靶點的信息：1)OMIM數(shù)據(jù)庫；2)DrugBank數(shù)據(jù)庫；3)GeneCards數(shù)據(jù)庫；4)治療靶點數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database，TTD，http://db.idrblab.net/ttd)。篩選后將靶點信息進行匯總整理。

1.4 CPhGs治療HCC的靶點映射 通過在線繪圖軟件制作韋恩圖，將CPhGs類成分作用靶點與HCC靶標進行映射，交集靶點即為CPhGs類成分治療HCC潛在作用靶點，通過韋恩圖確定CPhGs類成分與HCC的藥物-疾病交集靶點。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進行共有靶點的PPI分析，設(shè)置Combined Score>0.4，并將結(jié)果利用Cytoscape 3.8.0進行拓撲分析，以度值大于中位數(shù)的2倍篩選出關(guān)鍵共有靶點。

1.6 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對CPhGs和HCC共同作用靶點蛋白進行GO分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P≤0.05，篩選出具有顯著性差異的生物過程和通路，并通過Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 核心靶點的分子對接驗證 選擇關(guān)鍵靶點蛋白用于分子對接，從RCSBPDB數(shù)據(jù)庫獲取這些靶點蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件，從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取這些靶點的活性成分的結(jié)構(gòu)文件，利用Autodock_vina軟件計算靶點蛋白與活性成分間的最低結(jié)合能并將分子對接模擬驗證結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 肉蓯蓉苯乙醇總苷的活性成分及其預(yù)測靶點 最終確定29個化合物作為候選化合物，包括Echinacoside、Acteoside、Isoacteoside、2′-Acetylacteoside、Tubuloside A等基本信息。見表1。通過數(shù)據(jù)庫及PharmMapper預(yù)測出成分的靶標并去重后，獲得410個可能的靶標。

表1 肉蓯蓉苯乙醇苷類成分基本信息

2.2 “中藥-活性成分-靶標”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 “中藥-活性成分-靶標”網(wǎng)絡(luò)涉及439個節(jié)點，7 515條邊。圖中白色節(jié)點為中藥；圖中黃色節(jié)點中的縮寫為成分名稱，如PhGs9為Acteoside，其余略；圖中藍色節(jié)點為靶標名稱，如CASP3為Caspase-3蛋白。見圖1。

圖1 CPhGs類成分“中藥-活性成分-靶標”網(wǎng)絡(luò)

2.3 HCC疾病靶點的獲取及CPhGs類成分靶點映射 共獲得HCC相關(guān)靶點1 944個。通過韋恩圖將CPhGs成分預(yù)測的靶點與HCC的靶點進行映射，發(fā)現(xiàn)共有173個交集靶點，即CPhGs治療HCC的作用靶點。見圖2。

圖2 CPhGs-HCC共同靶點數(shù)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 CPhGs治療HCC的靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)涉及173個節(jié)點，2 202條邊。見圖3。度值中位數(shù)為20，根據(jù)度值大于中位數(shù)2倍篩選出核心網(wǎng)絡(luò)蛋白29個，包括ALB、AKT1、EGFR、MAPK1、IGF1、SRC、CASP3、MMP9、HRAS、HSP90AA1、MAPK8、ESR1、MMP2、RHOA、MAPK14、ANXA5、CAT、MDM2、KDR、PIK3R1、CDC42、MAP2K1、STAT1、GRB2、AR、IL-2、NOS3、IGF1R、JAK2。以上靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中的位置，表明其在CPhGs治療HCC中可能發(fā)揮重要作用。見圖4。

圖3 CPhGs治療HCC潛在作用靶點之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI核心基因柱狀圖

2.5 GO分類富集分析和KEGG通路富集分析 將篩選出的29個關(guān)鍵靶點進行GO和KEGG富集分析，得到生物過程(Biological Process，BP)65條，主要包括蛋白質(zhì)磷酸化，細胞增殖、遷移、凋亡，腎上腺素信號通路等；細胞組分(Cellular Components，CC)18條，主要與細胞質(zhì)，細胞間連接，細胞內(nèi)外基質(zhì)等有關(guān)；分子功能(Molecular Function，MF)23條，主要與蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等有關(guān)。見圖5。以上數(shù)據(jù)P值均小于0.05。通過KEGG富集得到92條信號通路(P<0.05)，主要涵蓋癌癥信號通路(hsa05200：Pathways in Cancer)、癌癥蛋白聚糖通路(hsa05205：Proteoglycans in Cancer)、PI3K-AKT信號通路(hsa04151：PI3K-AKT Signaling Pathway)、RAS信號通路(hsa04014：Ras Signaling Pathway)、FoxO信號通路(hsa04068：FoxO Signaling Pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(hsa04370：VEGF Signaling Pathway)等，排名前20的通路。見圖6。

圖5 CPhGs潛在靶標的GO富集分析

圖6 CPhGs潛在靶標的KEGG通路富集分析

2.6 “中藥-活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 CPhGs治療HCC的“中藥-活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)共有79個節(jié)點和901條邊，涉及29種活性成分、29個關(guān)鍵靶點、20條KEGG通路，體現(xiàn)了CPhGs可能通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮多效應(yīng)的特點。見圖7。

圖7 CPhGs成分治療HCC的“中藥-活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接驗證 根據(jù)“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中靶點的度值選擇CPhGs活性成分5個(毛蕊花糖苷、松果菊苷、2-乙酰毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A)與PPI分析中度值排名前10的靶點蛋白(ALB、AKT1、EGFR、MAPK1、IGF1、SRC、CASP3、MMP9、HRAS、HSP90AA1)進行分子對接，篩選對接結(jié)果中結(jié)合能低的分子構(gòu)象即為最優(yōu)對接結(jié)果，其中活性成分與蛋白間的結(jié)合能等信息。見表2。具體對接過程見圖8。結(jié)果顯示，50個對接結(jié)果均有較優(yōu)的(Total Score≤-5.0)對接活性，其中，43個對接結(jié)果有強烈的匹配活性(Total Score≤-7.0)。以上對接結(jié)果充分表明，CPhGs活性組分與HCC關(guān)鍵核心靶基因的結(jié)合作用良好。

表2 活性成分與靶點蛋白結(jié)合能(kcal/mol,1 cal=4.184 J)

圖8 靶點受體蛋白與活性成分的分子對接模式

3 討論

HCC是嚴重威脅人類健康的十大惡性腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿，進展迅速，治療困難、轉(zhuǎn)移概率高的特點[17]。HCC是各種信號通路及細胞因子共同參與的病理生理過程，因此單靶點、單通路治療很難起效。中藥具有多成分、多作用靶點和作用途徑復(fù)雜等特點，并以“人”為核心，將整體與局部相關(guān)聯(lián)，通過中藥有效成分在體內(nèi)的代謝過程，進而從系統(tǒng)上實現(xiàn)藥物對機體的調(diào)控。

通過“中藥-活性成分-靶點”的網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，CPhGs類成分毛蕊花糖苷、松果菊苷、紅景天等均具有較高的防治肝癌活性，在治療過程中可能發(fā)揮重要作用。毛蕊花糖苷對環(huán)境、飲食及二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝癌具有預(yù)防作用，其發(fā)揮作用可能是由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3依賴性的氧化應(yīng)激和凋亡調(diào)控介導(dǎo)的[18]。另外，毛蕊花糖苷可通過干擾JNK信號通路的激活和調(diào)控自噬蛋白的表達來抑制肝癌細胞的增殖[19]。研究表明，松果菊苷(ECH)能抑制二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠肝癌，并對HepG2肝癌細胞株具有抗增殖和促凋亡作用，其作用機制可能是通過降低骨髓細胞觸發(fā)受體2(Triggering Receptors Expressed on Myeloid Cells 2，TREM2)的表達和PI3K/AKT信號通路發(fā)揮其抗腫瘤活性[20]。紅景天苷聯(lián)合奧沙利鉑給藥可以提高HCC患者的化療療效，通過抑制HIF-1α信號通路，顯著提高HCC患者對鉑類藥物的敏感性，抑制缺氧誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transformation，EMT)[21]。

綜上所述，目前針對CPhGs類成分防治HCC的作用機制研究較少，尚未見有關(guān)CPhGs防治HCC作用機制的報道?；诖耍菊n題應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)對CPhGs防治HCC的作用機制進行系統(tǒng)研究，豐富和完善中藥、天然藥物治療HCC的研究資料，拓展新疆地產(chǎn)藥材肉蓯蓉的開發(fā)應(yīng)用價值。

本研究的PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析顯示，CPhGs治療HCC的核心靶點有29個，其中包括AKT1，PIK3R1，STAT1，SRC，MAPK1，CASP3，MAPK8，MAPK14，IGF1R等，均涉及細胞凋亡和細胞增殖過程。采用DAVID數(shù)據(jù)庫對上述29個關(guān)鍵靶點進行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示CPhGs可以對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞遷移、細胞增殖、細胞免疫等生物過程起調(diào)控作用，涉及細胞膜、核、質(zhì)、細胞器膜及細胞空間等細胞組成過程，并通過與蛋白、酶各類受體結(jié)合等分子功能產(chǎn)生活性。KEGG功能富集分析結(jié)果顯示，CPhGs防治HCC可能是通過調(diào)控癌癥信號通路、癌癥蛋白聚糖通路、PI3K/AKT信號通路、GnRH信號通路等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中均涉及PI3K/AKT信號通路，其作用尤為關(guān)鍵。

PI3K/AKT信號通路在肝癌的起始過程中起著至關(guān)重要的作用，涉及多種生物學(xué)過程，如增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥、抗輻射、能量代謝和自噬等[22-23]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)是由調(diào)節(jié)亞單位p85和催化亞單位p110組成的異源性二聚體。根據(jù)底物和序列同源性，將PI3K分為3個亞型，都能磷酸化磷脂酰肌醇第3位羥基，從而產(chǎn)生特定的磷酸肌醇形式而發(fā)揮作用[24]。蛋白激酶B是位于PI3K下游的靶蛋白，是細胞增殖和存活的重要調(diào)節(jié)因子。目前，已經(jīng)鑒定出3種AKT基因，分別稱為AKT1、AKT2和AKT3。抑制AKT活性可誘導(dǎo)一系列哺乳動物的細胞凋亡，因此，將蛋白激酶B抑制劑與抗癌藥物聯(lián)合治療具有突變的腫瘤有一定的療效[25]。

本研究將“中藥-活性成分--靶點”網(wǎng)絡(luò)中排名前5的核心活性化合物與PPI分析中度值排名前10的蛋白靶點進行分子對接，進一步明確其發(fā)揮效用的治療機制。采用Autodock vina進行對接，選取親和力最佳的構(gòu)象，其中最低結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol即表明藥效分子與蛋白對接效果良好,結(jié)合能越低，表明分子與蛋白結(jié)合能力越佳。本研究結(jié)果提示肉蓯蓉中的苯乙醇苷類活性化合物與蛋白激酶B1、HSP90AA1等靶標結(jié)合后最低結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，表明其具有較強的結(jié)合能力，充分驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果。蛋白激酶B是一種人類絲氨酸-蘇氨酸激酶，是AGC蛋白激酶家族的成員[26]。蛋白激酶B在大多數(shù)癌癥類型中都高度表達，包括HCC、肺癌、乳腺癌和以及結(jié)腸癌，其中蛋白激酶B1是治療癌癥的主要藥物靶點，在細胞增殖和抗凋亡的過程中發(fā)揮作用。有研究表明沉默蛋白激酶B1能夠抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)細胞凋亡，并可有效上調(diào)腫瘤抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的表達、減少Notch1的表達，靶向蛋白激酶B1可以抑制HCC的發(fā)展[27]。熱激蛋白90α(Heat Shock Protein 90α，Hsp90α)由HSP90AA1基因編碼，是分子伴侶Hsp90的誘導(dǎo)亞型，是真核生物中高度保守且必不可少的伴侶蛋白[28]。HSP90已成為治療癌癥中的關(guān)鍵目標，Hsp90與多種促進腫瘤發(fā)生的蛋白相互作用，因此，Hsp90是一個重要的致癌因子。研究表明，HCC患者血清HSP90AA1水平明顯高于健康對照組[29]，分泌型HSP90AA1可能是HCC良好的生物標志物，被批準用于中國HCC的臨床診斷[30]。

綜上所述，本文以CPhGs主要活性成分為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析其潛在的防治HCC靶點及信號通路，并結(jié)合分子對接方法初步驗證了CPhGs主要活性成分能與HCC靶點發(fā)生相互作用，為進一步深入探討其作用機制奠定了基礎(chǔ)。