真菌病毒AfPV1對寄主黃曲霉抗壓力耐受的影響*

江銀輝， 楊碧， 劉翔， 田詢， 禹文峰， 齊曉嵐， 吳昌學

(貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

真菌病毒是一類感染真菌的病毒，包含單分體病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Partitiviridae)、巨大雙分核糖核酸病毒科(Megabirnaviridae)、產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分病毒科(Quadriviridae)、內(nèi)源核糖核酸病毒科(Endornaviridae)及呼腸孤病毒科(Reoviridae)共7個科[1-2]。大多數(shù)真菌病毒感染寄主是隱形的、且不引起明顯的癥狀，但是有些真菌病毒感染能夠引起寄主明顯的致病力減弱[3-4]。因此，這些能夠引起寄主真菌致病力衰退的真菌病毒具有控制真菌引起的危害的潛力[5]。黃曲霉(Aspergillusflavus，A.flavus)是自然界中廣泛存在的一種真菌，它可以感染許多農(nóng)業(yè)作物，造成巨大的經(jīng)濟損失[6]；此外，黃曲霉污染的食品含有大量的黃曲霉毒素B，可引起急性黃曲霉病或者肝細胞的癌變[7]；同時黃曲霉也是一種條件致病菌，能夠感染免疫缺陷病人[6]。目前，只有抗真菌藥物用于治療曲霉病，但抗真菌藥物往往對人體有毒性，容易導致耐藥菌株產(chǎn)生[8]。因此，迫切需要一種新的治療策略來控制黃曲霉感染。真菌病毒已經(jīng)用于植物病原真菌的生物防治，如Cryphonectriaparasitica、Sclerotiniasclerotiorum、Helminthosporiumvictoriae、Botrytiscinerea[9]。隨著真菌病毒的報道越來越多，真菌病毒作為治療人類真菌感染的治療策略逐漸受到重視[10]，一些能導致黃曲霉弱致病力的真菌病毒具有治療黃曲霉感染的潛力[11]。在前期的研究中分離得到一種真菌病毒，對其進行測序分析并命名為aspergillus flavus partitivirus 1(AfPV1)，能夠選擇性感染黃曲霉，使寄主發(fā)生表型衰退，但被真菌病毒AfPV1感染的黃曲霉對外界壓力的變化尚未知[12]，本研究對真菌病毒AfPV1感染對寄主黃曲霉抵抗外界壓力的影響進行了系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株和細胞株 真菌病毒AfPV1(NCBI GenBank No. MK344768，No. MK344769，No. MK344770)，LD-F1為脫病毒并具有嘧啶磺胺抗性標記的黃曲霉菌株，用病毒AfPV1感染黃曲霉菌株LDF1獲得菌株LD-F1-b，以上黃曲霉菌株和病毒由本課題組前期獲得。小鼠巨噬細胞RAW264.7，購自美國美國菌種保藏中心ATCC公司。人肺泡上皮細胞A549，為貴州醫(yī)科大學分子生物學重點實驗室王琴容老師惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 超凈臺購自蘇州市金凈凈化設備科技有限公司，生化培養(yǎng)箱購自天津賽得利斯，冷凍高速離心機購自美國GENE公司，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、Triton-X100和嘧啶磺胺均購自美國sigma公司，剛果紅(congo red，CR)、氯化鈉(NaCl)和過氧化氫(H2O2)均為國產(chǎn)分析純，酶聯(lián)免疫反應檢測試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)購于四正柏生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1孢子懸液制備 將黃曲霉菌株LD-F1、LD-F1-b分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA；馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g及瓊脂粉13 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min)平板上30 ℃培養(yǎng)5 d，用10 mL含0.1%吐溫80的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；pH為7.2～7.4)沖洗PDA平板表面，然后用滅菌的擦鏡紙過濾掉菌絲，收取黃曲霉孢子，6 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS(含0.1%吐溫80)再次重懸，6 000 r/min離心，通過血細胞計數(shù)板計數(shù)，并根據(jù)實驗要求調(diào)整曲霉分生孢子的濃度。

1.2.2黃曲霉對細胞壁壓力、滲透壓、氧化壓力的測定 參考Takahashi-Nakaguchi等[13]的方法有改動。對照組為不含任何試劑的酵母葡萄糖固體培養(yǎng)基(yeast glucose solid medium，YGM；酵母膏1 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min)；細胞壁壓力組為含有100 mg/L、150 mg/L CR的YGM固體培養(yǎng)基；透壓壓力組為含有0.8 mol/L、1.2 mol/L、1.6 mol/L NaCl的YGM固體培養(yǎng)基；化壓力組為含有4 mmol/L、8 mmol/L H2O2的YGM固體培養(yǎng)基。取新鮮的孢子懸液10 μL(濃度為1×106CFU/mL)，分別接種到以上培養(yǎng)基的9 cm培養(yǎng)皿上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每天測量菌落直徑并記錄。生長抑制百分率=[(對照組直徑-實驗組直徑)/對照組直徑]×100%。

1.2.3黃曲霉對紫外線耐受的測定 取30 μL黃曲霉孢子懸液(濃度為1×103CFU/mL)接種在含有沙氏固體培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar，SDA；蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂13 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min)的9 cm培養(yǎng)皿上，涂布均勻，并在60 W/cm2的紫外線下照射30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，然后置于30 ℃培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，對照組不予照射。紫外殺傷率=[(對照組菌落數(shù)-紫外對照組菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)]×100%。

1.2.4黃曲霉對巨噬細胞殺滅耐受的測定 參考Lau等[14]的方法有改動。將巨噬細胞RAW264.7用完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)重懸鋪在6孔培養(yǎng)板(4×105個細胞/孔)、37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、棄培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔重新加入2 mL完全培養(yǎng)基。將制備黃曲霉分生孢子懸液加入上述6孔板中，每孔107個孢子，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h、棄培養(yǎng)液，加PBS清洗細胞5次(清除細胞外未被黏附的分生孢子)，每孔重新加入2 mL完全培養(yǎng)基。將6孔板放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，對照組不予培養(yǎng)，然后以終濃度為0.2% Triton-X100室溫處理20 min裂解細胞，梯度稀釋后接種于SDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，進行菌落計數(shù)。孢子死亡百分率=[(0 h菌落數(shù)-1 h菌落數(shù))/0 h菌落數(shù)]×100%。

1.2.5黃曲霉分子孢子對人肺癌上皮細胞的黏附 參考Takahashi-Nakaguchi等[13]的方法有改動。將人肺癌上皮細胞A549用用完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)重懸鋪在6孔培養(yǎng)板(1×105細胞/孔)，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合。將黃曲霉分生孢子懸液，于上述6孔板中加入102個孢子，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h棄上清培養(yǎng)液，加PBS清洗細胞3次(除去細胞外未被黏附的分生孢子)，每孔加5 mL SDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)26 h，進行菌落計數(shù)。孢子黏附百分率=(每孔菌落數(shù)/每孔加入102個孢子)×100%。

1.2.6黃曲霉對巨噬細胞一氧化氮(NO)和炎癥因子產(chǎn)生的影響 將巨噬細胞RAW264.7重懸鋪在6孔培養(yǎng)板(2×106細胞/孔)，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，每孔加入4×106個孢子與細胞共培養(yǎng)6 h；陽性對照為終濃度為1 mg/L的LPS處理，陰性對照為PBS處理。根據(jù)格里斯(Griess)反應，使用NO檢測試劑盒檢測巨噬細胞產(chǎn)生的NO，ELISA試劑盒測定細胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、IFN-β、TNF-α。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 對細胞壁壓力、滲透壓、氧化壓力的耐受

為了觀察AfPV1對寄主黃曲霉抗逆性的影響，測定了菌株LD-F1-b和LD-F1對細胞壁壓力、滲透壓、氧化壓力的耐受。研究發(fā)現(xiàn)，AfPV1感染使寄主黃曲霉對氧化脅迫和滲透脅迫的敏感性增強(圖1A和1B)，但對細胞壁脅迫抗性(CR)沒有顯著影響(圖1C)。

注：A～C為H2O2、Nacl、CR不同濃度的生長抑制率；(1)與菌株LD-F1比較，P<0.001。

2.2 對紫外線的耐受能力

AfPV1的感染減弱了寄主黃曲霉對紫外線的耐受。與LD-F1相比，LD-F1-b對紫外線照射極為敏感，當紫外線照射時間達到150 s時，LD-F1-b分生孢子的死亡率為100%(圖2)。

注：(1)與菌株LD-F1比較，P<0.001。

2.3 對巨噬細胞殺滅的耐受情況

巨噬細胞吞噬3 h后的黃曲霉的分生孢子死亡率均高于巨噬細胞吞噬1 h后的死亡率(圖3)。在巨噬細胞吞噬1 h或3 h后，LD-F1-b分生孢子的死亡率高于LD-F1。見圖3。結(jié)果表明病毒AfPV1降低了寄主黃曲霉抵抗巨噬細胞殺滅的能力。

注：(1) 與菌株LD-F1比較，P<0.05。

2.4 對人肺腺癌細胞的黏附能力

與LD-F1相比，LD-F1-b的分生孢子對肺上皮細胞A549的黏附能力降低(圖4)，提示病毒AfPV1降低了黃曲霉孢子的對肺上皮細胞的黏附能力。

注：(1)與菌株LD-F1比較，P<0.001。

2.5 對巨噬細胞產(chǎn)生NO和細胞因子的影響

在巨噬細胞與黃曲霉分生孢子共培養(yǎng)后，檢測了巨噬細胞產(chǎn)生NO和細胞因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-6和IL-10。結(jié)果表明，陽性對照組LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生了TNF-α、IFN-β、NO、IL-1β、IL-6、IL-10，但黃曲霉不能誘導巨噬細胞產(chǎn)生NO和IL-6；LD-F1-b能誘導巨噬細胞產(chǎn)生IL-10、IFN-β，而在LD-F1處理組沒有觀察到IL-10、IFN-β的產(chǎn)生。與LD-F1相比，LD-F1-b誘導巨噬細胞產(chǎn)生更高濃度TNF-α。在IL-1β的檢測中，LD-F1誘導細胞產(chǎn)生IL-1β的濃度高于LD-F1-b。見圖5。

注：A～F分別為PBS、LPS、LD-F1-b、LD-F1對巨噬細胞產(chǎn)生NO和細胞因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-6及IL-10的影響；(1)與陽性對照LPS處理比較，P<0.001。

3 討論

隨著大量使用廣譜抗生素，對腫瘤患者進行放療化療，以及對器官和干細胞移植的患者免疫抑制劑的使用，免疫力低下人群逐漸增多，導致曲霉病的發(fā)生率逐年升高，而黃曲霉是引起曲霉病的第二大病原菌[15]。而目前用于治療曲霉病的抗真菌藥物有限。目前，只有3類抗真菌藥物用于治療曲霉病，如多烯類(兩性霉素B)、三唑類(伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑)和棘白菌素類(卡泊芬凈和米卡芬凈)[8,16]。此外，抗真菌藥物對人體有一定的毒性，而且隨著黃曲霉對現(xiàn)有抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性，使其治療效果不理想[16]。真菌病毒是一種能夠選擇性感染真菌的病毒，有些真菌病毒能夠引起寄主致病力衰退，因此具有治療病原真菌感染的潛力[10]。本研究前期得到一種能夠引起A.flavus表型嚴重衰退的真菌病毒AfPV1[12]。本研究中，真菌病毒AfPV1的感染使寄主黃曲霉對滲透脅迫、氧化脅迫和紫外線脅迫壓力更敏感。而這些脅迫壓力也被發(fā)現(xiàn)與黃曲霉的毒力因子密切相關(guān)[17]。由此，本研究推測真菌病毒AfPV1也可能降低寄主黃曲霉的致病力，具有一定的治療潛力。

免疫缺陷是曲霉感染的重要因素，而免疫系統(tǒng)抵抗感染主要是通過吞噬細胞來清除曲霉菌[18]。此外，真菌病毒AfPV1降低了分生孢子對宿主上皮細胞的黏附，降低了分生孢子被巨噬細胞殺滅的耐受。因此免疫細胞可能更容易清除掉真菌病毒AfPV1感染的黃曲霉孢子。在本研究中，真菌病毒AfPV1感染菌株的孢子誘導巨噬細胞產(chǎn)生更高濃度TNF-α的趨勢，但其機制有待進一步研究。IL-6可以趨化和刺激中性粒細胞，通過自分泌和旁分泌方式刺激細胞生長、促進細胞分化，而曲霉上調(diào)IL-6 mRNA水平具有劑量效應依賴[19]。本研究中，黃曲霉孢子處理組未檢測到IL-6，可能為共培養(yǎng)的孢子劑量偏低，刺激量不足。有研究表明，炎癥因子IL-1β在煙曲霉的感染過程中，雖然沒有直接參與對孢子和菌絲的清除和殺滅，但參與炎癥和免疫反應相關(guān)細胞的分化中發(fā)揮著重要的作用，其中包括與抗原協(xié)同作用、促進B 細胞生長和分化、吸引中性粒細胞、引起炎癥介質(zhì)釋放等[20]。IL-10是免疫統(tǒng)中抗炎的細胞因子，參與調(diào)節(jié)細胞的生長與分化，調(diào)節(jié)機體免疫平衡[21]。在過敏性支氣管肺曲霉病中，IL-10可以抑制炎癥反應，發(fā)揮了抗炎、抗免疫的保護性作用，防止過度的炎性損傷[22]。黃曲霉感染后，本研究只檢測到低劑量的NO。在細菌感染過程中，IFN-β對宿主是有害的，其限制了產(chǎn)生保護性IL-17的T細胞反應的發(fā)展[23]。有結(jié)果表明，IFN的表達水平不僅受真菌活性程度的影響，而且可能與免疫反應的程度有關(guān)。在本研究中，巨噬細胞易于產(chǎn)生TNF-α炎癥因子，但真菌病毒AfPV1感染黃曲霉會導致巨噬細胞產(chǎn)生更多的TNF-α。