氣相色譜-質譜法測定沙格列汀中的3種甲磺酸酯類雜質

劉小瓊，曹杰永，劉春亮，堵偉鋒（.安徽省藥品審評查驗中心，合肥 005；.合肥合源藥業(yè)有限公司，合肥 0088；.滁州市食品藥品檢驗中心，安徽 滁州 9000；4.安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 005）

沙格列汀是一種強效降糖藥，其生產工藝是起始物料Ⅰ與甲磺酸反應得到中間體，中間體再與起始物料Ⅱ經過多步反應后生成。在生產過程中，中間體上的甲磺酸基團可能會與甲醇、乙醇、異丙醇等生成甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、甲磺酸異丙酯（IMS）等甲磺酸酯類化合物，如圖1。甲磺酸酯類是一類典型的基因毒性物質，能破壞服用者體內的DNA 結構，產生致癌物質，為了保證藥品的安全性，藥品監(jiān)管系統(tǒng)不斷完善基因毒性雜質控制的指導細則[1-3]，藥物研發(fā)以及藥品生產企業(yè)不斷探索甲磺酸酯類雜質的檢驗方法[4-6]。目前已報道的甲磺酸酯類的檢驗方法有氣相色譜-質譜（GC-MS）法、液相色譜-質譜（LC-MS）法等，但運用GC-MS 法檢測沙格列汀中的基因毒性雜質尚未見報道，僅有GC 法[7]測定的研究，可這種方法存在靈敏度低、檢測限高的問題，對小劑量的沙格列汀制劑來說存在漏檢出甲磺酸酯類雜質的可能，本文利用GC-MS 對沙格列汀的甲磺酸酯類雜質進行檢測，該法檢測限更低，靈敏度和準確度更高，能更有效評價沙格列汀的安全性。

圖1 沙格列汀反應步驟及甲磺酸酯類的結構Fig 1 Reaction of saxagliptin，and structure of methanesulfonates

1 儀器與試藥

GCMS-QP2010 Plus 型氣質聯(lián)用儀（日本島津公司），XS-105 型電子天平、MS105DU 型電子天平（精度：0.01 mg，瑞士梅特勒公司），KQ-500超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MMS對照品（批號：I2009166，純度：98.57%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），EMS 對照品（批號：AQX836，純度：97.00%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司），IMS 對照品（批號：D8NRR0ED，純度：99.06%，安徽澤升科技有限公司），沙格列汀（批號：SG-190801R1、SG-190901R1、SG-190902R1、SG-200401、SG-200402、SG-200403，合肥合源藥業(yè)有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

毛細管色譜柱（CP-SIL 8 CB，30.0 m×0.32 mm，1.0 μm）；質譜檢測器；氦氣作為載氣。

參數設定情況： 起始柱溫60 ℃， 以10 ℃·min－1的速率升溫至150 ℃，保持1 min，再以30 ℃·min－1速率升溫至200 ℃，保持13 min；柱流速設定為2.0 mL·min－1；進樣口溫度設定為200 ℃；分流比設定為5∶1；進樣量為1.0 μL。

2.2 質譜條件

EI 離子源（設定為70.0 eV）；SIM 檢測模式。離子源的溫度設定為200 ℃，接口溫度設定為240 ℃；線性模式；MMS 的質荷比（m/z）設定為80，EMS 的m/z設定為79，IMS 的m/z為123。

2.3 溶液的制備

混合對照品溶液：精密稱取3 種甲磺酸酯類對照品各適量置同一量瓶中，用甲醇溶解定容，制備成3 種雜質的質量濃度均為0.51 μg·mL－1的溶液。同時用作系統(tǒng)適用性溶液。

混合對照品母液：稱取對照品MMS、EMS和IMS 約10 mg，精密稱定，置同一量瓶中，用甲醇溶解定容至100 mL，再從量瓶中精密量取10.0 mL 置200 mL 量瓶中，用甲醇稀釋定容即可。

供試品溶液的制備：取待測供試品沙格列汀，用甲醇溶解并稀釋定容成質量濃度為1.7 mg·mL－1的溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取空白溶劑（甲醇）、系統(tǒng)適用性溶液1.0 μL 進樣，以SIM 模式采集，記錄質譜圖，結果如圖2，質譜圖顯示空白溶劑對3種甲磺酸酯類雜質的檢測沒有影響，專屬性較好。

圖2 SIM 質譜圖Fig 2 SIM mass spectra

2.4.2 準確度考察 精密稱取3 份批號為SG-200402 的沙格列汀原料藥170 mg，分別置于3個100 mL 量瓶中，再分別向不同量瓶中移入5.0、10.0 以及15.0 mL 混合對照品母液，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得到50%、100%、150%限度濃度供試品溶液，每個濃度平行制備3 份。精密量取1.0 μL 上述限度濃度供試品溶液以及混合對照品溶液，進樣，計算。結果顯示MMS 在各限度濃度的平均回收率分別是96.51%、98.45%、97.98%，RSD均小于2.0%；EMS 在各限度濃度的平均回收率分別是95.21%、98.91%、98.50%，RSD均小于2.5%；IMS 在各限度濃度的平均回收率分別是94.48%、96.45%、95.83%，RSD均小于2.0%。表明本方法的準確度好。

2.4.3 重復性考察 吸取1.0 mL 混合對照品母液置10 mL 量瓶中，用甲醇定容，搖勻作為備用液；向10 mL 量瓶中加入17 mg 批號為SG-200402 的沙格列汀原料藥，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為不加雜質的樣品；向10 mL 量瓶中加入17 mg 同批次沙格列汀原料藥和1.0 mL 混合對照品母液，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為加限度濃度雜質的樣品（相當于100%限度濃度供試液）。取上述備用液、6 份不加雜質的樣品和加限度濃度雜質的樣品各1.0 μL，進樣，計算。結果在不加雜質的情況下，樣品中3 種甲磺酸酯類未檢出；在樣品中加入限度濃度雜質后，3 種甲磺酸酯類的平均檢出量分別為0.030%、0.029%和0.029%，RSD分別為2.4%、2.4%和3.0%，表明本方法的重復性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取“2.4.2”項下100%限度濃度供試品溶液作為穩(wěn)定性考察溶液，室溫放置，分別于4、8、12、16、20、24 h 后，進樣測定，記錄圖譜，結果放置不同時間后的3 種甲磺酸酯類雜質含量的RSD值分別為2.8%、2.6%、3.3%，表明24 h 內供試品溶液中雜質含量波動較小，溶液較穩(wěn)定。

2.4.5 檢測限與定量限考察 用甲醇逐級稀釋混合對照品母液配制成不同濃度的溶液，分別精密量取上述濃度溶液各1.0 μL，進樣，按S/N為3∶1 計算MMS、EMS 和IMS 的檢測限分別為6.21、6.14、6.17 ng·mL－1；按S/N為10∶1 計算MMS、EMS 和IMS 的定量限分別為0.0261、0.0255 和0.0255 μg·mL－1。

2.4.6 線性考察 分別精密量取混合對照品母液1.0、1.5、2.5、5.0、8.0、10.0 mL，置于6 個50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列濃度對照品溶液。精密量取上述溶液各1.0 μL，分別進樣，記錄圖譜，計算，結果見表1。MMS、EMS 和IMS 分別在0.1045 ～1.0448、0.1019 ～1.0185 和0.1020 ～1.0203 μg·mL－1的質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

表1 線性關系考察結果Tab 1 Linearity

2.4.7 耐用性考察 按照“2.4.3”項下備用液、不加雜質的樣品和加限度濃度雜質樣品的制法制備耐用性考察所需的測試溶液，單因素考察初始柱溫、分流比、柱流速、離子源溫度以及控制模式對測定結果的影響（見表2）。精密量取上述測試溶液1.0 μL，進樣，計算。本方法耐用性考察情況見表3。通過實驗可以發(fā)現，在變動色譜條件后，不加雜質的樣品依然未檢出；加限度濃度雜質樣品中的3 種甲磺酸酯類的RSD在3.9%～6.6%，備用液的峰面積穩(wěn)定，峰面積RSD的最大值為5.0%，小于限度要求的10%。表明色譜條件的變動不會影響檢測結果，本檢驗方法的耐用性良好。

表2 色譜參數變動情況Tab 2 Changes of chromatographic conditions

表3 耐用性考察情況Tab 3 Durability test

2.5 樣品檢測

對6 批次沙格列汀原料藥進行處理，按要求配制相應的供試品溶液，各取1.0 μL 的混合對照品溶液和供試品溶液進樣，結果見圖3。6 批次沙格列汀原料藥中均未檢出3 種甲磺酸酯類雜質，滿足雜質含量小于0.03%的限度要求。

圖3 混合對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的質譜圖Fig 3 Mass spectra of mixed reference（A）and test solution（B）

3 討論

3.1 升溫程序的確定

由于沙格列汀原料藥中需要檢測的基因毒性雜質較多，雜質間的差異性較大，為了更好地分離出被測組分，明確采取系統(tǒng)程序升溫法開展實驗。經過摸索[8-9]，發(fā)現按照“起始柱溫60 ℃，以10 ℃·min－1的速率升溫至150 ℃，保持1 min，再以30 ℃·L－1速率升溫至200 ℃，保持13 min”的程序進行升溫，分離效果最好。

3.2 質譜定量離子的確定

本實驗采用SIM 監(jiān)測模式，通過對空白溶液和系統(tǒng)適用性溶液進行質譜采集，觀察采集圖譜可以看出MMS、EMS 在m/z80 和m/z79 處有最高豐度，故選定其作為相應雜質的定量離子；IMS 在m/z43 處有最高豐度，由于此處的檢測結果容易受到系統(tǒng)及溶劑的影響，故選擇豐度僅次于最高處的m/z123 作為定量離子[10]。

3.3 基因毒性雜質限度的確定

TTC 法是常用的基因毒性雜質限度制訂方法，企業(yè)為了收緊和方便控制原料藥中的基因毒性雜質，統(tǒng)一設定TTC 值為1.5 μg·d－1，按照沙格列汀片的最大日劑量是5 mg 計算，可得出基因毒性雜質的控制限度應為0.03%[11-12]。本方法選擇樣品的質量濃度為1.7 mg·mL－1，若雜質達到控制上限0.03%時，對照品質量濃度是本方法選定的0.51 μg·mL－1，可直接比對樣品和對照品中對應的甲磺酸酯類峰面積判定基因毒性雜質是否超出限度。

4 結論

本文采取的檢驗方法具有靈敏度高、準確度好等優(yōu)勢，運用GC-MS 法檢測沙格列汀原料藥中的基因毒性雜質甲磺酸酯類，可大大提高藥品的使用安全系數，降低患者的用藥風險。