細(xì)胞焦亡與心肌缺血再灌注損傷及中藥單體干預(yù)研究進(jìn)展

王益民，李焱，王怡斐，蘇文革*（.山東中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 50000；.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 5004）

急性心肌梗死（AMI）是導(dǎo)致全球心血管疾病患者死亡的主要原因之一，目前通過及時有效的溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）和冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）等治療AMI 取得了巨大進(jìn)展，缺血心肌的血運(yùn)重建可恢復(fù)心肌功能，但也會產(chǎn)生額外的心肌損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）[1-3]。臨床上，MIRI 常發(fā)生在急性ST 段抬高型心肌梗死患者中，會造成心肌的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣超載等，引起心肌的二次損傷，增加心肌梗死面積，從而降低再灌注治療的獲益[1，4]。MIRI 的確切分子機(jī)制目前尚未完全闡明，也沒有有效的藥物來控制和預(yù)防。近年來研究表明，細(xì)胞焦亡與多種心血管疾病密切相關(guān)，如MIRI、動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭以及冠狀動脈鈣化等[5]。其中細(xì)胞焦亡在MIRI 中具有重要作用，相關(guān)機(jī)制研究和藥物研究都取得了很大的進(jìn)展，本文就細(xì)胞焦亡在MIRI 中的作用機(jī)制及中藥單體干預(yù)研究進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制

細(xì)胞焦亡是一種伴隨炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡，其特征是gasdermin D（GSDMD）介導(dǎo)的膜孔形成、細(xì)胞腫脹和細(xì)胞溶解，并釋放大量的促炎介質(zhì)，如白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）等。細(xì)胞焦亡是一種非特異性先天免疫反應(yīng)，不僅在抗病原微生物感染中發(fā)揮著重要作用，而且與眾多非病原微生物感染也密切相關(guān)[6]。

1.1 參與細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵分子

細(xì)胞焦亡的發(fā)生涉及諸多分子的參與。先天免疫反應(yīng)依賴于模式識別受體（PRRs）來識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）。PRRs 家族主要包括NOD 樣受體（NLRs）、Toll 樣受體（TLRs）和C 型血凝素受體（CLRs）。炎癥小體在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞焦亡的炎癥小體主要有NLRs 家族、AIM2和Pyrin，其中NLRs 家族包括NLRP3、NLRP6 和NLRP9 等，以NLRP3 的相關(guān)研究最多[7-9]。Caspase家族是一類進(jìn)化保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞質(zhì)中多以酶原（pro-caspase）形式存在，根據(jù)其功能和結(jié)構(gòu)域，可以將caspase 家族成員分為炎性caspase 和凋亡性caspase[10-11]。在gasdermin 家族中，人類擁有g(shù)asdermin A（GSDMA）、gasdermin B（GSDMB）、gasdermin C（GSDMC）、GSDMD、gasdermin E（GSDME）和DFNB59，其中GSDMD在細(xì)胞焦亡中被廣泛研究，有“細(xì)胞焦亡的執(zhí)行者”之稱[12-14]。

1.2 經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑

經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑是由caspase-1 介導(dǎo)的，在PRRs 接受到PAMPs 和DAMPs 刺激后，PRRs發(fā)生寡聚化，與凋亡相關(guān)的微粒蛋白（ASC）和pro-caspase-1 聚合形成炎癥小體，并激活caspase-1[13，15]。一方面，caspase-1 的激活使失活的IL-1β和IL-18 的前體裂解，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18；另一方面，激活的caspase-1 作用于GSDMD，并將其裂解為N 末端和C 末端產(chǎn)物，其中N 末端結(jié)構(gòu)域是脂質(zhì)選擇性的，可以在細(xì)胞膜上形成孔隙，釋放IL-1β、IL-18 等炎性細(xì)胞因子，從而引起細(xì)胞滲透壓變化，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，并引起細(xì)胞膨脹、破裂、死亡[16]。

1.3 非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑

非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑依賴于caspase-11/4/5介導(dǎo)，不需要炎癥小體激活，可直接作為受體與脂多糖（LPS）等分子結(jié)合而激活，活化的caspase-11/4/5 通過切割GSDMD、釋放成熟的IL-1β和IL-18，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[17]。此外，活化的caspase-11/4/5 還可以通過Pannexin-1/ATP/P2X7 通路，介導(dǎo)NLRP3/ASC/caspase-1 活化，促進(jìn)IL-1β和IL-18 成熟和釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[18]。

1.4 其他細(xì)胞焦亡途徑

近年來研究發(fā)現(xiàn)，活化的caspase-3 可通過切割GSDME 并促進(jìn)GSDME-N 結(jié)構(gòu)域向細(xì)胞膜聚集，來誘導(dǎo)細(xì)胞膜孔隙的形成，從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[19]。Caspase-8 對依賴于NLRP3 的caspase-1 通路起正向調(diào)節(jié)作用，還可以作為caspase-3 的上游蛋白或者直接切割GSDMD 或GSDME 來誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[20]。顆粒酶A 或B 可以取代caspase 的“傳統(tǒng)效應(yīng)”，裂解gasdermin 蛋白家族，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[21]。

2 細(xì)胞焦亡與MIRI

MIRI 的病理生理學(xué)涉及多種細(xì)胞的參與，如心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等[22]。根據(jù)最新的研究結(jié)果，心房區(qū)域含有約30.1%的心肌細(xì)胞、24.3%的心肌成纖維細(xì)胞和12.2%的血管內(nèi)皮細(xì)胞；心室區(qū)域含有約49.2%的心肌細(xì)胞、15.5%的心肌成纖維細(xì)胞和7.8%的血管內(nèi)皮細(xì)胞[23]。這三類細(xì)胞占整個心肌組織細(xì)胞總數(shù)的70%左右，深入了解這三類細(xì)胞在MIRI 中的焦亡機(jī)制，可為MIRI 的治療提供新方向。

2.1 細(xì)胞焦亡與心肌細(xì)胞

心肌細(xì)胞的炎癥和壞死在MIRI 的病理生理過程中起關(guān)鍵作用。根據(jù)最新的研究，心肌缺血再灌注可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡，其中氧化應(yīng)激是關(guān)鍵誘導(dǎo)因素，并主要通過caspase-11/GSDMD 信號通路來介導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡，這個過程伴隨著成熟的IL-18 的釋放，并且GSDMD基因敲除和GSDMD 抑制劑均可顯著減輕心肌細(xì)胞焦亡所致的心肌損傷[24]。有研究證明相關(guān)蛋白也可介導(dǎo)MIRI 中的心肌細(xì)胞焦亡的發(fā)生，如水通道蛋白4（AQP4）介導(dǎo)了MIRI 中心肌細(xì)胞焦亡，AQP4 抑制劑可通過抑制心肌細(xì)胞焦亡來減輕MIRI；甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（METTL3）通過6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾促進(jìn)RNA 綁定蛋白DiGeorge 關(guān)鍵區(qū)域8（DGCR8）與pri-miR-143-3p 的結(jié)合，從而增強(qiáng)miR-143-3p 的表達(dá)，抑制蛋白激酶C-epsilon（PRKCE）轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致MIRI 中的心肌細(xì)胞焦亡[25-26]。這些研究提示抑制caspase-11/GSDMD 信號通路是治療MIRI 中心肌細(xì)胞焦亡的核心，未來的藥物研究可以該通路作為研究對象；多種相關(guān)蛋白也參與到了MIRI 中心肌細(xì)胞焦亡的發(fā)生，如AQP4 和METTL3 等，進(jìn)一步探討這些蛋白對焦亡的調(diào)控機(jī)制，可為MIRI 的治療提供新靶點(diǎn)。

2.2 細(xì)胞焦亡與心肌成纖維細(xì)胞

心肌成纖維細(xì)胞是心肌組織中含量最豐富的非心肌細(xì)胞，它可以感知心臟損傷或應(yīng)激時釋放的危險信號，在維持心臟正常功能方面具有重要作用[27]。在心肌缺血再灌注中可通過活性氧（ROS）產(chǎn)生和K＋外流介導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體激活，誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞焦亡[28]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA GAS5（LncRNA GAS5）的DNMT1 沉默可以激活NLRP3 炎癥小體，導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞焦亡，從而促進(jìn)心肌纖維化的進(jìn)展[29]。在心肌成纖維細(xì)胞中，環(huán)氧合酶-2（COX-2）參與了NLRP3 炎癥小體的激活，沉默COX-2基因或使用COX-2 抑制劑均降低了NLRP3 炎癥小體和下游細(xì)胞因子的表達(dá)和激活[30]。在缺氧/復(fù)氧（H/R）條件下，心肌成纖維細(xì)胞可分泌含有miR-133a 的外泌體，遞送到心肌細(xì)胞中，靶向ELAV 樣RNA 結(jié)合蛋白1（ELAVL1）并抑制心肌細(xì)胞焦亡[31]。由此可見，NLRP3 炎癥小體的激活是MIRI 時心肌成纖維細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵，NLRP3 炎癥小體是MIRI 極具潛力的治療靶點(diǎn)。另外，進(jìn)一步揭示心肌成纖維細(xì)胞在MIRI 時對心肌組織的自我保護(hù)機(jī)制，或許是未來的研究方向。

2.3 細(xì)胞焦亡與血管內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞對H/R 的變化極為敏感，其功能障礙是導(dǎo)致MIRI 的重要病理基礎(chǔ)之一。有研究表明，在H/R 誘導(dǎo)下，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞可發(fā)生焦亡，其機(jī)制與NLRP3/caspase-1 介導(dǎo)的IL-1β分泌有關(guān)[32]。在小鼠MIRI 模型中，自噬相關(guān)基因BECN1可以調(diào)節(jié)caspase-4 介導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡[33]。也有研究指出，抑制促炎因子的釋放、降低ROS 表達(dá)和抑制NLRP3 炎癥小體的激活，可降低心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡水平[34]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可再次導(dǎo)致冠狀動脈血管功能障礙，因此抑制MIRI 中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷極具意義。抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低ROS 水平，進(jìn)而降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡水平，可減輕MIRI。

3 中藥單體對MIRI 中細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制研究

3.1 黃酮類化合物

柚皮苷是存在于柚子皮、化橘紅、骨碎補(bǔ)等中藥材中的一種黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、清除自由基等作用，對心腦血管疾病具有潛在的應(yīng)用價值[35-36]。王婷婷等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，柚皮苷低劑量（10 mg·kg－1）、中劑量（50 mg·kg－1）、高劑量（100 mg·kg－1）組心肌組織中caspase-1、NLRP3、ASC 以及GSDMD 蛋白的表達(dá)水平均比模型組降低，其發(fā)揮心肌保護(hù)作用與降低心肌組織的細(xì)胞焦亡水平有關(guān)。提示柚皮苷可通過抑制細(xì)胞焦亡進(jìn)而減輕MIRI，但其抑制細(xì)胞焦亡的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

芹菜素是存在于芹菜、車前子、絡(luò)石藤等中藥材中的一種黃酮類化合物，具有抗動脈粥樣硬化、抗高血壓以及抗自身免疫性心肌炎等多種藥理學(xué)作用[38]。Li 等[39]研究發(fā)現(xiàn)在缺血/缺氧（I/H）處理的大鼠心肌細(xì)胞（H9C2 細(xì)胞系）模型中，芹菜素可呈劑量依賴性降低NLRP3、caspase-1、GSDME-N、IL-1β和IL-18 的表達(dá)水平，其發(fā)揮心肌保護(hù)作用可能與抑制心肌細(xì)胞焦亡有關(guān)。然而芹菜素抑制MIRI 中細(xì)胞焦亡的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

木犀草素是存在于野菊花、金銀花、紫蘇葉等中藥材中的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗高血壓和心臟保護(hù)等作用[40]。Zhang 等[41]研究發(fā)現(xiàn)在雄性SD 大鼠MIRI 和H/R 處理的H9C2 細(xì)胞系模型中，木犀草素有效地抑制了心肌細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1、Toll 樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）的表達(dá)，其心肌保護(hù)機(jī)制也可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡有關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示木犀草素對MIRI 具有較強(qiáng)的心臟保護(hù)作用，未來可進(jìn)一步探索其臨床應(yīng)用價值。

3.2 萜類化合物

獐牙菜苷是從龍膽科植物獐牙菜中提取的一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎活性[42]。Li 等[43]研究發(fā)現(xiàn)在雄性Wistar 大鼠MIRI 和H/R 處理的H9C2 細(xì)胞系模型中，獐牙菜苷能抑制Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）并誘導(dǎo)核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）核易位，降低NLRP3、ASC、caspase-1 和IL-1β的表達(dá)水平，能顯著抑制心肌細(xì)胞焦亡，并發(fā)現(xiàn)通過抑制Nrf2 的表達(dá)可以消除其對心肌細(xì)胞焦亡的抑制作用，推測獐牙菜苷可能通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2 軸抑制細(xì)胞焦亡，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究還發(fā)現(xiàn)，獐牙菜苷對心肌細(xì)胞焦亡的抑制作用部分受Keap1/Nrf2 軸的調(diào)節(jié)，這表明還有其他途徑參與了抗焦亡作用，尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確證其抗焦亡作用的最強(qiáng)或最具潛力的途徑[43]。

3.3 香豆素類化合物

秦皮甲素是從中藥秦皮中提取的一種香豆素類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗血栓形成等多種藥理學(xué)作用[44]。Xu 等[45]研究發(fā)現(xiàn)在雄性SD 大鼠MIRI 和接受氧氣-葡萄糖剝奪/恢復(fù)（OGD/R）處理的新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCM）模型中，秦皮甲素可通過AKT/GSK3β/NF-κB 通路抑制NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而減輕MIRI 和OGD/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。同時還發(fā)現(xiàn)秦皮甲素（30 mg·kg－1）治療組在減輕再灌注心律失常、心肌損傷和恢復(fù)血流動力學(xué)功能方面與硝苯地平（10 mg·kg－1）治療組沒有明顯差異，這些結(jié)果證實(shí)了秦皮甲素可有效減輕MIRI，是極具前途的治療MIRI 的候選藥物。

3.4 醌類化合物

大黃素是從中藥大黃根莖中提取的一種蒽醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化等藥理作用，在心血管疾病方面具有極大的應(yīng)用潛力[46-47]。Ye 等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在雄性SD 大鼠MIRI 和H/R 處理的心肌細(xì)胞模型中，大黃素可減少心肌細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生，降低TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3 和GSDMD-N 的表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞焦亡，其作用是通過抑制TLR4/MyD88/NFκB/NLRP3 通路實(shí)現(xiàn)的。提示大黃素是治療MIRI的候選藥物，TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 通路可能包含MIRI 的重要治療靶點(diǎn)。然而，大黃素介導(dǎo)的肝腎等器官毒性的細(xì)胞和分子機(jī)制仍不明確，還需要進(jìn)一步研究其臨床應(yīng)用價值[49-50]。

3.5 生物堿類化合物

胡椒堿是存在于黑胡椒和長胡椒中的一種生物堿類化合物，現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)其具有抑制心肌纖維化、減少線粒體氧化應(yīng)激、清除ROS 以及擴(kuò)張血管等諸多心臟保護(hù)作用[51]。Guo 等[52]研究發(fā)現(xiàn)在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，胡椒堿可降低心肌組織的細(xì)胞焦亡水平，其機(jī)制與胡椒堿抑制了miR-383 的表達(dá)和促進(jìn)RP105/PI3K/AKT通路的激活有關(guān)，并提示miR-383 通過RP105/PI3K/AKT 依賴的方式調(diào)節(jié)MIRI 中的細(xì)胞焦亡。miRNA 是一種高度保守的非編碼RNA，可通過直接結(jié)合3' UTR 來抑制靶mRNA，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞焦亡和MIRI[53]。胡椒堿可通過調(diào)控miRNA，進(jìn)而抑制MIRI 中的細(xì)胞焦亡，為我們從miRNA角度研究細(xì)胞焦亡和MIRI 之間的關(guān)系以及藥物作用機(jī)制提供了思路。

3.6 酚類化合物

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹的根皮中提取的一種酚類化合物，具有抗動脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、保護(hù)心肌細(xì)胞以及抑制心肌纖維化等多種藥理學(xué)作用[54]。丁華勝等[55]研究發(fā)現(xiàn)在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，丹皮酚預(yù)處理可呈劑量依賴性地抑制TLR4 的表達(dá)及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，降低NLRP3/ASC/caspase-1 介導(dǎo)的心肌組織的細(xì)胞焦亡水平，減輕MIRI。丹皮酚作為治療心血管疾病極具潛力的候選藥物，未來可結(jié)合臨床試驗(yàn)進(jìn)一步評價其在MIRI 中的治療價值。

3.7 有機(jī)酸類化合物

肉桂酸是從中藥肉桂皮中提取的一種有機(jī)酸類化合物，具有廣泛的藥理學(xué)作用，如抗氧化、抗炎、心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)等，對心血管疾病具有潛在的治療作用[56-57]。Peng 等[58]研究發(fā)現(xiàn)在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，肉桂酸能抑制MIRI 后大鼠心肌的炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷，縮小心肌梗死面積，改善心功能，其機(jī)制主要表現(xiàn)為下調(diào)NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 和GSDMD-N 蛋白的表達(dá)，顯著抑制心肌組織中NLRP3 炎癥小體的激活和隨后的心肌細(xì)胞焦亡。提示肉桂酸可通過抑制心肌細(xì)胞焦亡來減輕MIRI，并具有良好的心肌保護(hù)活性，但其治療和預(yù)防MIRI 的能力尚需要進(jìn)一步的系統(tǒng)評價和臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

3.8 苷類化合物

天麻素是從中藥天麻中提取的一種糖苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多種藥理學(xué)作用，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療[59-60]。Sun 等[32]研究發(fā)現(xiàn)在雄性C57BL/6J 小鼠MIRI 和H/R 處理的人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞系（HCMECs）模型中，天麻素可通過抑制NLRP3/caspase-1 信號通路，降低心肌組織和HCMECs 的焦亡水平，減少炎性細(xì)胞浸潤，具有心肌保護(hù)作用。由此可見，天麻素可通過抑制經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑發(fā)揮心肌保護(hù)作用，然而天麻素調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的深層分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

4 小結(jié)與展望

細(xì)胞焦亡是MIRI 的重要機(jī)制之一，從細(xì)胞焦亡角度探討MIRI 的治療或許是一個潛在策略[61]。雖然目前還沒有開發(fā)出治療MIRI 的特異性藥物，但中藥單體中多種天然化合物均顯示出抗MIRI 活性，為尋找特異性抗MIRI 的藥物提供了選擇。多種中藥單體抗MIRI 已經(jīng)進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究，在發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制鈣超載、調(diào)節(jié)心肌能量代謝、改善血管內(nèi)皮功能以及調(diào)節(jié)線粒體功能等方面具有重要作用[62]，但目前臨床推廣極少，也導(dǎo)致其實(shí)用價值下降。藥物制劑的創(chuàng)新或許有利于藥物的臨床推廣，可以考慮將中藥單體與納米藥物遞送系統(tǒng)相結(jié)合[63]，在臨床試驗(yàn)中以提高藥物靶向性，并減少不良反應(yīng)。

結(jié)合目前的研究，多種中藥單體的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示出抗MIRI 中細(xì)胞焦亡活性，為下一步開發(fā)治療MIRI 的特異性藥物奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。但我們?nèi)匀豢梢钥吹揭韵虏蛔悖?/p>

① 機(jī)制研究不深入：目前的研究多是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）來檢測基因或蛋白表達(dá)的層面，未來可利用基因敲除或抑制關(guān)鍵蛋白等研究來驗(yàn)證中藥單體的作用靶點(diǎn)，還可利用分子對接技術(shù)等結(jié)構(gòu)藥理學(xué)方法揭示中藥單體的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步闡明中藥單體的具體作用機(jī)制。

② 模型構(gòu)建待改進(jìn)：由于MIRI 特定的發(fā)病狀態(tài)，體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建存在一定的難度。目前OGD/R、H/R 等造模方式缺乏神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，并不能完全模擬MIRI 期間的病理生理變化，可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的偏差。未來的研究可進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并選擇公認(rèn)的模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

③ 藥理研究不完善：除了完善對中藥單體的藥物效應(yīng)動力學(xué)研究外，還應(yīng)進(jìn)一步研究藥物代謝動力學(xué)以及藥物毒理學(xué)等內(nèi)容，完善對中藥單體的藥理學(xué)研究。

④ 臨床試驗(yàn)尚缺乏：目前對中藥單體的研究多是基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，尚未有臨床試驗(yàn)的證據(jù)支持，未來還需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)來證明中藥單體的安全性和有效性。

總之，中醫(yī)藥在治療MIRI 中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，雖然目前仍處于基礎(chǔ)研究階段，還存在諸多問題需要解決，但我們應(yīng)開拓研究思路，進(jìn)一步結(jié)合新技術(shù)、新方法，開發(fā)治療MIRI 的新藥物。