白果仁配方顆粒質(zhì)量標準研究與產(chǎn)品評價

朱亞文，易躍能，易劍平，付 猛，魏丹丹

（1.湖南易能生物醫(yī)藥有限公司，湖南 長沙 410007；2.北京同仁堂研究院，北京 100079）

白果又名平仲果、銀杏、鴨腳子[1]，為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟種子。白果仁為除去硬殼的種仁，始載于《紹興本草》。《本草綱目》與《滇南本草》收載其可作為藥用[2]。白果仁具有斂肺定喘、止帶縮尿之功效，可用于治療腎咳、膀胱咳、帶下白濁、遺尿尿頻。明代著名醫(yī)家王肯堂認為：“腎虛不納，水寒射肺而為腎咳；……，腎失攝納影響膀胱，膀胱氣化不利影響肺之氣化，稱為膀胱咳”[3]。故其可用于治療腎咳?！陡登嘀髋啤窇冒坠委燑S帶下、婦人下焦寒濕不孕、腎虛腰痛遺尿等癥[4]?，F(xiàn)代藥理學研究[5-8]表明，白果仁具有抗氧化、抗炎、保護神經(jīng)、抗腫瘤、抗菌、止喘等多種藥理作用。

白果仁中含有黃酮類、萜內(nèi)酯類、酚酸類等多種有效成分，其中黃酮類成分有銀杏雙黃酮、異銀杏黃素、金松雙黃酮、銀杏黃素、松柏苷、甘草苷、腺苷、熊果酸等，萜內(nèi)酯類成分有銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯M、銀杏內(nèi)酯J、白果內(nèi)酯等[5-9]。

白果仁配方顆粒以白果藥材為原料，經(jīng)炮制、水提、濃縮、干燥等工序制備而成。市場上白果仁配方顆粒生產(chǎn)廠家繁多，質(zhì)量參差不齊，為保證其療效，規(guī)范生產(chǎn)，需對產(chǎn)品進行質(zhì)量控制。本實驗從薄層色譜、特征圖譜及松柏苷的含量等方面進行了研究，旨在為本品質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695-2996高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（PDA）和低溫柱溫箱（美國Waters公司）；BSA124S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；AUW120D電子天平（日本島津公司）；KQ-500DB超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 白果仁配方顆粒（批號：Z279CPSY16，Z279CPSY17，Z279CPSY18）購于北京康仁堂藥業(yè)有限公司；15批白果藥材分別來源于江蘇泰州市泰興市、江蘇南通市海安縣、山東省臨沂市郯城縣（見表1），全部經(jīng)湖南省藥品檢驗院方石林主任藥師鑒定為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟種子；銀杏內(nèi)酯A對照品（批號：11862-201612）、銀杏內(nèi)酯C（批號：110864-201809）均購于中國食品藥品檢定研究院；松柏苷（批號：AF21072402，純度≥98.0%）購于成都埃法生物科技有限公司；青島海洋化工有限公司硅膠G板（規(guī)格：100 mm×100 mm；批號：20210807）；乙腈、甲醇（色譜純）購于天地人生物科技有限公司；超純水購于屈臣氏商標有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 15 批藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取白果仁配方顆粒約10 g，研細，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液回收溶劑至干。殘渣加水15 mL使溶解，濾過，濾液通過聚酰胺柱（80～100目，3 g，內(nèi)徑為10～15 mm），用水70 mL洗脫，收集洗脫液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次40 mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干。殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 取銀杏內(nèi)酯A對照品、銀杏內(nèi)酯C對照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg、1 mg的溶液，即得。

2.1.3 陰性對照品溶液的制備 取缺白果仁陰性對照品顆粒，照“2.1.1”制備方法制備缺白果仁陰性對照溶液。

2.1.4 薄層鑒別方法 照2020年版《中華人民共和國藥典》通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，分別點于同一含4%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶20∶5∶0.6）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以醋酐，在140～160 ℃加熱30 min，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而缺白果仁陰性對照品無干擾。（見圖1）

圖1 薄層鑒別色譜圖

2.2 含量測定與特征圖譜

2.2.1 色譜條件 Agilent 5TC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～3 min，10%A；3～8 min，10%A→15%A；8～20 min（15%A→20%A）；檢測波長為255 nm；流速為1 mL/min；柱溫為20 ℃；進樣體積為20 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取松柏苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 對照藥材溶液的制備 取白果對照藥材1.0 g，置具塞錐形瓶中，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加70%甲醇10 mL，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）20 min，取出，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 供試品溶液的制備 取白果仁配方顆粒適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.4 陰性對照溶液的制備 取糊精按白果仁配方顆粒工藝制備顆粒，取糊精顆粒，研細，取約0.1g，精密稱定，按“2.2.2.3”中制備方法制備白果仁配方顆粒陰性對照溶液。

2.2.2.5 空白溶液的制備 取70%甲醇25 mL，置具塞錐形瓶中，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 特征圖譜

2.2.3.1 精密度試驗 分別精密吸取供試品（批號：Z279CPSY17）溶液，按照“2.2.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以松柏苷峰為參照峰；計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD均小于1%，相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），方法精密度良好。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品（批號：Z279CPSY17）溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h，按“2.2.1”色譜條件測定，以松柏苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD均小于1%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在室溫放置24 h基本穩(wěn)定。

2.2.3.3 重復性試驗 取白果仁配方顆粒（批號：Z279CPSY17）適量，研細，取0.5 g，精密稱定，按照“2.2.2.3”方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”色譜方法測定，記錄色譜圖，以松柏苷峰為參照峰；計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD均小于1%，相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），方法重復性良好。

2.2.3.4 特征圖譜的建立 取15批白果藥材經(jīng)炮制、水提、濃縮、冷凍干燥等工序制備15批白果仁標準湯劑（凍干粉）。按“2.2.1”色譜條件測定，15批白果仁標準湯劑（凍干粉）、3批白果仁配方顆粒和對照藥材HPLC疊加特征圖譜見圖2，對照特征圖譜見圖3。3批白果仁配方顆粒呈現(xiàn)與15批白果仁標準湯劑（凍干粉）、對照藥材一致的5個明顯的峰，經(jīng)指認峰2為松柏苷，且峰響應值較高，故以峰2松柏苷作為S峰。供試品色譜中呈現(xiàn)5個特征峰，并與對照藥材參照物色譜中的5個特征峰保留時間相對應，與松柏苷參照物峰相對應的峰為S峰，計算峰1、峰3、峰4、峰5與S峰的相對保留時間，其相對保留時間在規(guī)定值的±10%范圍之內(nèi)，規(guī)定值為：0.72（峰1）、1.10（峰3）、1.18（峰4）、1.25（峰5）。

圖2 15 批白果仁標準湯劑（凍干粉）、3 批白果仁配方顆粒和對照藥材HPLC 重疊特征圖譜

圖3 白果仁配方顆粒HPLC 對照特征圖譜

2.2.4 含量測定

2.2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、空白溶液、陰性對照溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”方法測定，即得。結(jié)果白果仁配方顆粒與對照品溶液的保留時間一致，陰性對照、空白溶液在目標物保留時間附近無干擾，專屬性符合要求。（見圖4）

2.2.4.2 線性關系考察 取質(zhì)量濃度為106.5 μg/mL的松柏苷對照品貯備液，分別稀釋至質(zhì)量濃度為53.25、26.62、10.65、5.32、1.065 μg/mL的對照品溶液，進樣，測定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行回歸分析，松柏苷的回歸方程為：Y=60 224.369 1X-14 062.298 0，r=1.000，結(jié)果表明松柏苷在1.065～106.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.4.3 精密度試驗 取同一份供試品溶液（批號：Z279CPSY17），按照“2.2.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算松柏苷峰面積RSD為0.4%，表明本方法儀器精密度良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取白果仁配方顆粒（批號：Z279CPSY17）適量，研細，取0.5 g，按照“2.2.2.3”方法制備供試品溶液，取供試品溶液于0、2、4、8、12、18、24 h分別進樣，記錄色譜峰面積，計算松柏苷峰面積RSD值為1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 重復性試驗 取白果仁配方顆粒（批號：Z279CPSY17）適量，研細，取0.5 g，精密稱定，按照“2.2.2.3”方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件測定，記錄色譜圖，計算松柏苷的平均含量為0.55 mg/g，RSD值為1.4%，表明本方法重復性良好。

2.2.4.6 加樣回收率試驗 取白果仁配方顆粒（批號：Z279C PSY17）適量，研細，取0.25 g，6份，精密稱定，分別加入同一濃度（相當于100%濃度水平）的松柏苷對照品溶液，按照“2.2.2.3”方法平行制備6份供試品溶液。按“2.2.1”色譜條件測定，計算加樣平均回收率為101.6%，RSD為1.6%，表明本方法準確度良好。（見表2）

表2 松柏苷加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.4.7 含量測定 取15批白果仁標準湯劑（凍干粉）和3批白果仁配方顆粒適量，分別按“2.2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定，記錄峰面積，計算樣品含量。（見表3）

表3 18 批樣品含量測定結(jié)果

3 討論

白果藥材在2020年版《中華人民共和國藥典》中雖有記載，但無含量測定要求。白果中黃酮及萜內(nèi)酯類成分等具有抗自由基氧化、抗炎的藥理作用；松柏苷為白果中黃酮類成分，也是活性成分，具有較好的抗氧化、抑菌、抗病毒活性，且含量相對較高。

結(jié)合文獻[10-15]資料，本研究以松柏苷作為含量測定指標，對白果仁配方顆粒進行含量研究和特征圖譜研究，分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同流動相系統(tǒng)的洗脫效果，結(jié)果表明以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相時，對照品峰型最佳，與前后組分峰分離度最好，其他特征峰的峰形、分離度最佳，且特征圖譜峰信息較全面。同時在此色譜條件下松柏苷含量測定方法準確度高、專屬性強、重現(xiàn)性好。

為使配方顆粒更好的表達中藥材的特征，本研究從藥材、飲片、標準湯劑（凍干粉）、干膏粉、配方顆粒進行全過程監(jiān)控。本研究通過對15批白果仁標準湯劑（凍干粉）和3批白果仁配方顆粒的檢測，結(jié)果顯示15批白果仁標準湯劑（凍干粉）松柏苷平均含量為0.87 mg/g，含量范圍在0.42～1.24 mg/g之間，±3SD含量范圍0.20～1.53 mg/g。15批白果仁標準湯劑（凍干粉）特征圖譜含有5個特征峰，與松柏苷參照物峰相對應的峰為S峰。本研究計算了峰1、峰3、峰4、峰5與S峰的相對保留時間，結(jié)果顯示其相對保留時間在平均值的±10%范圍之內(nèi)。3批配方顆粒松柏苷含量均在白果仁標準湯劑（凍干粉）的可接受范圍（0.42～1.24 mg/g）之內(nèi)。

白果仁中內(nèi)酯類成分銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯C也有一定的藥效作用，但其水溶性較差，在樣品中含量較低，故本研究未將其列入含量測定指標，但對薄層色譜進行了研究。結(jié)果表明，15批白果仁標準湯劑（凍干粉）和3批白果仁配方顆粒薄層色譜圖均與銀杏內(nèi)酯A對照品、銀杏內(nèi)酯C對照品在相應位置上顯相同顏色的斑點，且斑點顯色清晰，分離度佳，可用于白果仁配方顆粒薄層鑒別。

白果新酸、氫化白果酸、十七烷一烯銀杏酸、十七烷二烯銀杏酸、白果酸等銀杏酸是一種物理性質(zhì)豐富的酚酸類物質(zhì)，存在于銀杏種實（外種皮、胚乳、種胚）中，是導致銀杏及其制品中出現(xiàn)中毒和過敏反應的主要物質(zhì)之一，但其在溫度41～42 ℃時會分解[16]。2020年版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定銀杏葉提取物的總銀杏酸不得過5 mg/kg，但對白果藥材及其飲片中總銀杏酸的限量未作規(guī)定[17]。本試驗對15批白果仁標準湯劑（凍干粉）和3批白果仁配方顆粒中總銀杏酸的含量進行了研究，18批次樣品中，均未檢測到總銀杏酸，分析原因可能是高溫煎煮的時間較長，銀杏酸分子由于不耐熱分解，從而導致總銀杏酸含量明顯降低。

本研究對白果仁配方顆粒質(zhì)量進行了較為全面的研究：篩選出的HPLC色譜條件檢測指標成分準確度高、特征圖譜專屬性強、重現(xiàn)性好；優(yōu)選的薄層鑒別方法重現(xiàn)性好，耐用性好，以上研究結(jié)果能為白果仁配方顆粒質(zhì)量標準的建立提供科學依據(jù)。