膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型應(yīng)用現(xiàn)狀和研究進(jìn)展

張師僥，李 寧，楊永菊，呂世偉，關(guān)雪峰

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以軟骨破壞、軟骨下骨硬化、骨質(zhì)增生和滑膜炎性病變?yōu)椴±硖卣鞯呐R床常見病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和活動(dòng)受限，嚴(yán)重者周圍肌肉萎縮甚至關(guān)節(jié)畸形，影響日常生活。根據(jù)中國健康與養(yǎng)老追蹤調(diào)查研究［1］顯示，我國癥狀性KOA的患病率為8.1% ，女性高于男性。KOA 臨床治療主要依據(jù)其影像學(xué)表現(xiàn)和病變程度選擇保守治療或手術(shù)治療，但究其根本發(fā)病機(jī)制尚沒有統(tǒng)一定論，所以想要探究和驗(yàn)證其發(fā)病機(jī)制和各項(xiàng)治療方法的作用機(jī)理需要開展大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。理想的動(dòng)物模型需要在解剖結(jié)構(gòu)、發(fā)病基礎(chǔ)和病情進(jìn)展等各方面同人類相似，所以不同疾病動(dòng)物模型的選擇應(yīng)該有不同的側(cè)重點(diǎn)。目前KOA 動(dòng)物模型的研究焦點(diǎn)在于西醫(yī)各建模方法的選擇以及依據(jù)中醫(yī)證型特點(diǎn)建立病證結(jié)合動(dòng)物模型。筆者將檢索到的近年與KOA 造模相關(guān)的文章歸納和總結(jié)如下，以期能夠?yàn)檎诨蚣磳⑦M(jìn)行KOA 相關(guān)研究工作的同道提供一點(diǎn)參考。

1 模型選擇

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇是決定能否成功開展基礎(chǔ)研究的第一步，也是至關(guān)重要的一步。常被用于科學(xué)研究的動(dòng)物有很多種，按照其體型大小可以分為小型動(dòng)物、中型動(dòng)物和大型動(dòng)物。小型動(dòng)物飼養(yǎng)方便，但基因與人類相差較大。中大型動(dòng)物雖然基因與人類更相近，但采購和飼養(yǎng)成本高。按照種類又可以分為嚙齒類、哺乳類、家禽類和靈長(zhǎng)類。選擇哪一種動(dòng)物進(jìn)行研究往往需要考慮諸多因素，例如：與人類基因的相似度、實(shí)驗(yàn)研究的目的、采購和飼養(yǎng)成本、飼養(yǎng)難易度和倫理法規(guī)要求等。由于KOA 的特殊生理結(jié)構(gòu)，其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇有自身特殊性，常見于KOA 實(shí)驗(yàn)研究且被文獻(xiàn)記載的動(dòng)物主要包括小鼠、大鼠、Hartley 豚鼠、C57 黑鼠、雞、兔、犬、山羊、綿羊、馬、豬、短尾猴、獼猴、食蟹猴、鴯鹋等。其中最常見于實(shí)驗(yàn)研究的是鼠和兔。

1.1 鼠

鼠類是KOA 實(shí)驗(yàn)研究中最為常見的動(dòng)物模型之一。小鼠體積小、價(jià)格便宜、飼養(yǎng)成本低，常被用于遺傳學(xué)相關(guān)研究［2］，但其膝關(guān)節(jié)體積小，軟骨少而薄，不方便實(shí)驗(yàn)取材。大鼠相較于小鼠具有一定優(yōu)勢(shì)，其飼養(yǎng)周期短，生命力頑強(qiáng)，抗感染能力強(qiáng)，軟骨結(jié)構(gòu)相對(duì)較厚，有利于實(shí)驗(yàn)取材。常被用于進(jìn)行KOA 疼痛和軟骨相關(guān)研究［3，4］。Hartley 豚鼠和C57黑鼠因其特殊生理特點(diǎn)，常被作為自發(fā)性KOA 模型進(jìn)行研究。3 個(gè)月左右大的豚鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)可以出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，體現(xiàn)在軟骨表層不平整、軟骨細(xì)胞減少等［5］。2 個(gè)月左右的C57 黑鼠KOA 的發(fā)生率為20%，16 個(gè)月則能達(dá)到80%［6］。Hartley 豚鼠性格溫順，習(xí)慣久坐，可針對(duì)此特點(diǎn)進(jìn)行KOA 非運(yùn)動(dòng)損傷引起的退變機(jī)制研究［7］。但因兩種鼠價(jià)格比較昂貴，飼養(yǎng)周期較長(zhǎng)，飼養(yǎng)成本較高，所以實(shí)際應(yīng)用受限較多。

1.2 兔

兔是第二類最常用于KOA 研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。其性格溫順，飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，膝關(guān)節(jié)腔較大，取材容易，膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)除髕骨外基本與人相似［8］，所以廣泛應(yīng)用于各種KOA 實(shí)驗(yàn)研究。缺點(diǎn)是其膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期處于屈曲狀態(tài)，與人體膝關(guān)節(jié)角度相差較大，步態(tài)和生物力學(xué)與人類有明顯區(qū)別。

1.3 其他動(dòng)物

其他被記載用于KOA 研究的動(dòng)物主要包括：雞、犬、山羊、綿羊、馬、豬、短尾猴、獼猴、食蟹猴、鴯鹋等。比如犬類，膝關(guān)節(jié)除一處籽骨和伸肌腱與人體膝關(guān)節(jié)不同外，其余結(jié)構(gòu)基本相同，且犬類胃腸道和人體相似，可用于某些腸內(nèi)療法的研究［9］。Catarino 等［10］通過犬類模型研究發(fā)現(xiàn)同種異體PRP 應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎犬的適用性和安全性。山羊和綿陽的膝關(guān)節(jié)同樣與人體相似度較高，所以可以與犬類一樣進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡和核磁共振檢查，以便更精準(zhǔn)的進(jìn)行KOA 研究。Howarth 等［11］對(duì)40 只經(jīng)過閹割的年輕成年公山羊進(jìn)行半月板橫向或縱向1.0 cm 撕裂，并伴或不伴微骨折進(jìn)行造模，研究發(fā)現(xiàn)通過微骨折將骨髓元素釋放到膝蓋可以提高半月板的愈合率。但羊的關(guān)節(jié)不易形成關(guān)節(jié)炎，造模時(shí)間較長(zhǎng)。豬的基因譜和人類接近，且其行走時(shí)膝關(guān)節(jié)屈曲程度與人類相似，所以可以進(jìn)行KOA 病理研究。吳清洪等［12］研究發(fā)現(xiàn)切除左膝關(guān)節(jié)外側(cè)半月板并離斷前交叉韌帶建立豬早期KOA 動(dòng)物模型是理想的，可應(yīng)用于在體功能性MRI 的早期KOA 相關(guān)研究。短尾猴、獼猴、食蟹猴等屬于靈長(zhǎng)類動(dòng)物，其膝關(guān)節(jié)生理結(jié)構(gòu)和退變機(jī)制相比于其他動(dòng)物與人類最為相似。Liu 等［13］通過對(duì)不同年齡的食蟹猴進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)食蟹猴可能是一種與年齡相關(guān)的KOA 變化的動(dòng)物模型，故認(rèn)為食蟹猴可能更適用于人類退行性膝骨關(guān)節(jié)炎的研究。雞、馬和鴯鹋近年來已經(jīng)很少用于KOA 研究。以上動(dòng)物相比于鼠和兔，雖然各方面生理結(jié)構(gòu)更接近于人類，但由于其存在來源少、成本高、飼養(yǎng)難度大、倫理難通過等客觀問題，其應(yīng)用存在很大程度受限。

2 西醫(yī)模型

2.1 西醫(yī)發(fā)病機(jī)制下的模型分類

KOA 西醫(yī)發(fā)病機(jī)制大多停留在軟骨、軟骨下骨、滑膜等方面的探討，其分子生物學(xué)層面涉及細(xì)胞因子、炎癥通路、軟骨基質(zhì)降解、氧自由基學(xué)說等，眾說紛紜，尚沒有統(tǒng)一定論。

在西醫(yī)理論指導(dǎo)下建立KOA 動(dòng)物模型大體可以分為自發(fā)模型、誘發(fā)模型和轉(zhuǎn)基因模型。自發(fā)模型是指自然條件下，動(dòng)物未經(jīng)任何人為干預(yù)形成某種病理改變的動(dòng)物模型。誘發(fā)模型指人為地誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生類似人類疾病的動(dòng)物模型。在KOA 造模中誘發(fā)模型主要包括手術(shù)誘發(fā)和非手術(shù)誘發(fā)，手術(shù)誘發(fā)包括離斷交叉韌帶、切除半月板等方法，非手術(shù)誘發(fā)包括飲食誘發(fā)、藥物注射誘發(fā)、關(guān)節(jié)制動(dòng)誘發(fā)、寒冷誘發(fā)、骨內(nèi)高壓誘發(fā)、關(guān)節(jié)應(yīng)力改變誘發(fā)、異物置入誘發(fā)和關(guān)節(jié)撞擊誘發(fā)等多種方法。轉(zhuǎn)基因模型指通過基因敲除、插入和轉(zhuǎn)染的方法獲得所需生理改變的動(dòng)物模型。

2.2 自發(fā)模型

Hartley 豚鼠和C57 黑鼠是兩種較為常見的KOA 自發(fā)模型?？钓卧矗?4］通過對(duì)不同月齡的25 只Dunkin-Hartley 豚鼠進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)Dunkin-Hartley 豚鼠在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下3 個(gè)月齡時(shí)出現(xiàn)了輕度關(guān)節(jié)軟骨退變，且病情隨著月齡的增加逐漸加重。Yu 等［15］通 過C57 黑 鼠 和TNF-α 敲 除 小 鼠，分別建立KOA 模型并進(jìn)行全身震動(dòng)干預(yù)。通過ELISA、組織學(xué)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記、免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)軟骨，體外熒光素酶活性試驗(yàn)研究TNF-α 與候選蛋白的關(guān)系，結(jié)果在KOA 中發(fā)現(xiàn)了全身震動(dòng)干預(yù)引起的軟骨退行性變的新機(jī)制。自發(fā)模型不用人為干預(yù)，方便實(shí)驗(yàn)操作，降低實(shí)驗(yàn)難度，避免因造模時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)誤而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但其造模周期較長(zhǎng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)整體進(jìn)度減慢，從而各項(xiàng)成本隨之增加，是此類模型應(yīng)用受限的原因。

2.3 手術(shù)誘發(fā)模型

2.3.1 前交叉韌帶橫斷 前交叉韌帶的主要作用是屈膝時(shí)防止脛骨前移，伸膝時(shí)阻止膝關(guān)節(jié)過伸，并輔助控制膝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)。前交叉韌帶橫斷術(shù)（ACLT）是通過改變膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性加速軟骨磨損而形成，因其重復(fù)性高和OA 進(jìn)展迅速而成為最常用于 誘 發(fā)KOA 的 方 法 之 一［16］。錢 潔 等［17］研 究 發(fā) 現(xiàn)ACLT 的病理改變首先發(fā)生在軟骨表面，表現(xiàn)在軟骨失去光澤、軟化和纖維化等，但其造模時(shí)間較長(zhǎng)，6 周 才 為KOA 早 期。Tawonsawatruk 等［18］對(duì) 比 了ACLT 模型和軟骨損傷模型，發(fā)現(xiàn)ACLT 模型隨時(shí)間推移呈現(xiàn)漸進(jìn)性退行性改變并伴有持續(xù)性疼痛，說明ACLT 更符合KOA 疾病發(fā)展特點(diǎn)。

2.3.2 半月板切除 半月板作為關(guān)節(jié)的填充物，起到減輕股骨和脛骨摩擦，緩沖關(guān)節(jié)囊和滑膜撞擊的作用。半月板切除術(shù)（MMT）通過破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)造成應(yīng)力失衡而形成KOA 病理表現(xiàn)。Steinbrück等［19］通過切除單側(cè)大鼠內(nèi)側(cè)半月板并將健側(cè)肢體固定于腹部的方法，觀察到術(shù)后第4、6、10 周的病理改變均符合典型KOA 特征。

2.3.3 Hulth 法 Hulth 法分為傳統(tǒng)和改良兩種。傳 統(tǒng)Hulth 法 于1970 年 由Hulth 等［20］提 出，是 最 經(jīng)典的KOA 手術(shù)造模法，其通過切除前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板造成關(guān)節(jié)失穩(wěn)形成。Phetsangouane［21］通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)Hulth 法建立的動(dòng)物模型病理表現(xiàn)局限于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室，接近于人類早期OA 表現(xiàn)。該方法所引起的膝關(guān)節(jié)損傷較大，出血較多，若術(shù)后感染控制不佳則影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。所以很多研究者通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)出多種改良Hulth 法，包括單純切除內(nèi)側(cè)半月板和前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板、前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶。王云峰等［22］通過切除兔前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板方法造模，發(fā)現(xiàn)2 周即可出現(xiàn)滑膜充血和炎癥滲出等早期KOA 表現(xiàn)，14 周出現(xiàn)股骨內(nèi)髁和脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨缺失骨質(zhì)暴露及周圍明顯骨質(zhì)增生的晚期KOA 表現(xiàn)。改良Hulth 法相比于傳統(tǒng)方法操作簡(jiǎn)單，造模周期縮短，模型死亡率降低。

2.3.4 軟骨劃痕 軟骨劃痕法是手術(shù)誘導(dǎo)眾多方法中損傷最小的一種，其可以通過軟骨缺損觀察KOA 發(fā) 展 和 修 復(fù) 進(jìn) 程。Marijnissen 等［23］比 較 軟 骨劃痕誘導(dǎo)與ACLT 誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)軟骨劃痕法可以誘導(dǎo)早期KOA 模型，且軟骨的生化分析顯示了蛋白多糖含量和膠原損傷等均符合KOA 特征。其缺點(diǎn)是在誘導(dǎo)過程中可能刺激關(guān)節(jié)滑膜組織，從而影響對(duì)軟骨病變的觀察。

2.3.5 卵巢切除 卵巢切除誘導(dǎo)法是所有手術(shù)誘導(dǎo)方法中唯一不通過作用膝關(guān)節(jié)本身而造模的方法，其通過切除卵巢致雌激素缺乏而誘導(dǎo)KOA 發(fā)生，大鼠為最常用動(dòng)物模型。其模擬對(duì)象主要是絕經(jīng)后女性，而恰好這一年齡階段的女性是KOA 高發(fā)人群，所以可以作為特殊模型進(jìn)行相關(guān)研究。同時(shí)也可適用于雌激素及其類似物對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨作用機(jī)制的研究［24］。Fontinele 等［25］將6 月齡雌性Wistar 大鼠隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組不做卵巢切除和運(yùn)動(dòng)；久坐組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除+不運(yùn)動(dòng)；訓(xùn)練組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除+運(yùn)動(dòng)3 個(gè)月。所有大鼠在9 個(gè)月大時(shí)被安樂死，組織學(xué)切片采用蘇木精和伊紅染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素水平的降低使Wistar 大鼠的脛骨軟骨淺表層發(fā)生了重要的變化。手術(shù)操作難度大和實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格是卵巢切除誘導(dǎo)的缺點(diǎn)。

2.3.6 血循阻斷 良好的血液供養(yǎng)是維系膝關(guān)節(jié)軟骨和滑膜等組織正常工作的基礎(chǔ)。血循阻斷誘導(dǎo)主要通過切斷或結(jié)扎關(guān)節(jié)外主要供血血管，減少骨內(nèi)動(dòng)脈灌注，影響靜脈回流，造成膝關(guān)節(jié)內(nèi)組織壓力升高，誘發(fā)軟骨退變，也稱為骨內(nèi)高壓法。該方法可用于KOA 血液循環(huán)和代謝組學(xué)相關(guān)研究。戴七一等［26］在無菌條件下結(jié)扎和切斷新西蘭兔右側(cè)臀部的臀下靜脈，右下腹部的股靜脈和大隱靜脈，術(shù)后8 周處死所有動(dòng)物后取右膝內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨組織，通過大體觀察及蘇木精-伊紅染色、光鏡觀察軟骨組織的結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)形成早中期KOA 動(dòng)物模型。

2.3.7 關(guān)節(jié)應(yīng)力改變 膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定需要各組成骨、軟骨、軟骨下骨、半月板、內(nèi)外側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶以及周圍各肌肉組織的協(xié)同和拮抗作用共同維持，一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，就會(huì)造成膝關(guān)節(jié)應(yīng)力改變，從而在炎癥因子和激素等共同作用下，形成KOA。所以包括以上通過改變膝關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)在內(nèi)的手術(shù)方法，均是通過改變膝關(guān)節(jié)應(yīng)力而建立模型的。劉靜等［27］通過切斷Sprague-Dawley 雄性大鼠前后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶得出結(jié)論，關(guān)節(jié)不穩(wěn)所致的機(jī)械應(yīng)力失衡是導(dǎo)致創(chuàng)傷性KOA 的重要因素。

2.4 非手術(shù)誘發(fā)模型

2.4.1 飲食 流行病學(xué)研究表明肥胖是KOA 發(fā)生和進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素。所以可以通過高脂飲食喂養(yǎng)等方法建立肥胖模型，以深入研究肥胖與KOA的關(guān)系。Poulami 等［28］通過對(duì)比高脂飲食和低脂飲食的小鼠，發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性年齡相關(guān)的OA 樣改變，即使恢復(fù)正常飲食，也表現(xiàn)為磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿等血漿代謝指標(biāo)的增高。

2.4.2 藥物注射 藥物注射誘發(fā)是指采用多種化合物注入膝關(guān)節(jié)，引起軟骨、滑膜、細(xì)胞外基質(zhì)等產(chǎn)生炎性病變，引起代謝異常，從而形成KOA 模型。（1）木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，降解軟骨中的蛋白聚糖，從而從基質(zhì)中釋放硫酸軟骨素。其關(guān)節(jié)腔注射造模是除手術(shù)誘發(fā)方法外應(yīng)用最廣的造模方法，也是公認(rèn)安全高效的方法之一。有研究采用Mankin 評(píng)分初步證實(shí)木瓜蛋白酶注射4 周可以形成早期膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型［29］。張鎮(zhèn)等［30］將72 只雌性大鼠按照0.1 mL/kg 劑量膝關(guān)節(jié)腔注射2%、5%、10%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L 的L-半胱氨酸混合液，兩周后得到了不同損傷程度的膝骨關(guān)節(jié)炎模型，其中注射10%木瓜蛋白酶可以得到重度KOA 模型。（2）碘乙酸鹽 碘乙酸鹽是一種代謝抑制劑，可以破壞細(xì)胞有氧糖酵解途徑，通過抑制軟骨細(xì)胞中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。關(guān)節(jié)內(nèi)注射MIA 導(dǎo)致軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，其關(guān)節(jié)的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)改變類似于人類骨關(guān)節(jié)炎的改變。Ma 等［31］研究發(fā)現(xiàn)1 mg 碘乙酸鹽可使大鼠產(chǎn)生穩(wěn)定的疼痛行為和進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷，適合電針治療KOA 評(píng)價(jià)。王明建等［32］通過對(duì)比木瓜蛋白酶、碘乙酸鈉和Ⅱ型膠原蛋白酶造模對(duì)大鼠行為學(xué)、細(xì)胞因子和病理的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無顯著差異，碘乙酸鈉模型病理特征更為顯著。（3）膠原蛋白酶膠原酶破壞含有Ⅰ型膠原的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，破壞膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致KOA。Ad?es 等［33］通過觀察瞬時(shí)受體電位香草酸1 在同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)情況，認(rèn)為在大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射500 U 膠原酶可作為研究骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)痛覺的替代模型。Utomo等［34］用10 U 膠原酶誘導(dǎo)33 只雄性C57BL/6 小鼠膝關(guān)節(jié)并于第1、3、7、14、28 和56 天后處死，取膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠模型在早期出現(xiàn)半月板擠壓，并同時(shí)發(fā)生半月板損傷和關(guān)節(jié)軟骨損傷，說明可以應(yīng)用膠原酶誘導(dǎo)模型研究半月板損傷與KOA 的關(guān)系。（4）其他尿激酶型纖溶酶原激活物是滑膜液中纖維蛋白溶解的重要調(diào)節(jié)因子，Tao等［35］將尿激酶型纖溶酶原激活物直接注入膝關(guān)節(jié)腔，發(fā)現(xiàn)其通過蛋白水解和細(xì)胞因子觸發(fā)引起滑膜炎癥和軟骨破壞。有研究采用瘦素誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型檢測(cè)其病理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)其中部分差異表達(dá)基因與瘦素誘導(dǎo)OA 表型相關(guān)［36］。這些基因包括MMPs 相關(guān)基因、炎癥因子、生長(zhǎng)因子、凋亡基因和成骨基因。雌二醇、菲律賓素、腎上腺皮質(zhì)激素等注入膝關(guān)節(jié)也可誘導(dǎo)KOA 模型［37，38］，但近年應(yīng)用較少。

2.4.3 關(guān)節(jié)制動(dòng) 關(guān)節(jié)制動(dòng)是骨科常用治療手段，其通過外固定材料和裝置制約關(guān)節(jié)的主動(dòng)活動(dòng)而起到緩解疼痛和加速組織愈合的作用。將正常的膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期制動(dòng)會(huì)使其周圍肌肉萎縮、韌帶松弛，從而建立與自然形成的KOA 相同臨床表現(xiàn)的動(dòng)物模型。這種方法避免了因手術(shù)或藥物注射所造成的肢體損傷。孫銀鐵等［39］就采用普通石膏和高分子材料結(jié)合的方法伸直位固定兔膝關(guān)節(jié)建立動(dòng)物模 型，研 究NOD2、NLRP3 表 達(dá) 水 平 和KOA 的 關(guān)系，證明此種模型建立方法安全穩(wěn)定。余兆澤［40］采用Ilizarov 環(huán)形外固定支架持續(xù)牽伸兔膝關(guān)節(jié)，并采用鉸鏈關(guān)節(jié)器使膝關(guān)節(jié)保持一定活動(dòng)范圍，這種方法一是可以模擬有利于軟骨再生的生理環(huán)境而促進(jìn)軟骨自身修復(fù)，二是保證膝關(guān)節(jié)有一定活動(dòng)范圍而不會(huì)因?yàn)榻┲倍鴵p傷軟骨。

2.4.4 寒冷刺激 寒冷刺激通過影響膝關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境而誘發(fā)KOA，其中包括滑膜組織的通透性改變、細(xì)胞凋亡、炎癥因子的異常表達(dá)、細(xì)胞基質(zhì)的降解等［41］。同時(shí)，寒冷是KOA 發(fā)病誘因之一，所以寒冷刺激誘發(fā)和關(guān)節(jié)制動(dòng)誘發(fā)一樣，可以建立更接近人類病史的KOA 動(dòng)物模型，體現(xiàn)KOA 退行性變的本質(zhì)。劉媛等［42］將健康蛋雞的膝關(guān)節(jié)每日2 h 冰浴，持續(xù)30 d，通過電鏡掃面軟骨，發(fā)現(xiàn)軟骨表面波浪狀結(jié)構(gòu)低平，拱形結(jié)構(gòu)消失，軟骨表面斷裂，有膠原纖維及軟骨細(xì)胞裸露，且結(jié)構(gòu)明顯疏松。

2.4.5 關(guān)節(jié)撞擊 關(guān)節(jié)撞擊不同于寒冷和關(guān)節(jié)制動(dòng)等誘導(dǎo)的自然退變，它通過外部施加的機(jī)械載荷可以模擬人類因創(chuàng)傷引起的膝關(guān)節(jié)病變。同時(shí)，該方法不需要進(jìn)行韌帶、半月板、軟骨切除等侵入性操作，其屬于非侵入性誘發(fā)方法，避免了侵入性損傷而引起的其他問題。2007 年，F(xiàn)urman 等［43］通過誘發(fā)脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)內(nèi)骨折建立了首個(gè)創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎的小鼠模型。他們將C57BL/6 小鼠放置在定制支架中，下至彎曲90°，通過裝置上的楔形壓頭以20 N/s 的速度對(duì)脛骨近端實(shí)施55 N 的載荷。Mrosek EH 等［44］對(duì)12 只成年比格犬的髕骨股骨關(guān)節(jié)進(jìn)行了跨關(guān)節(jié)撞擊。6 個(gè)月后取樣活組織切片，在固定的福爾馬林切片上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡檢查和Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖非冷凍固定的免疫熒光檢測(cè)。觀察表明，關(guān)節(jié)撞擊在6 個(gè)月后引起早期骨關(guān)節(jié)炎改變，且膠原網(wǎng)絡(luò)破壞導(dǎo)致蛋白聚糖丟失。

2.5 轉(zhuǎn)基因模型

隨著基因技術(shù)的不斷進(jìn)步，通過基因敲除、插入和轉(zhuǎn)染等獲得所需特定基因缺陷和表達(dá)的方法也被應(yīng)用到KOA 基礎(chǔ)研究中。其中基因敲除主要通過調(diào)控軟骨細(xì)胞過度凋亡而導(dǎo)致KOA 形成［45］。于 斐 等［46］成 功 利 用Tamoxifen 誘 導(dǎo)15 月 齡 小 鼠 軟骨組織的SIRT1 基因敲除建立膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型。有研究［47］顯示敲除小鼠Col11a1 基因，可導(dǎo)致Ⅺ型膠原不能合成正常膠原纖維，引起小鼠軟骨發(fā)育不全，從而誘導(dǎo)KOA。還可以通過敲除IL-6 基因、ADAM-15 基 因、α-1 整 合 素 基 因、MMP-14 基因、纖維調(diào)節(jié)素和基膜聚糖基因雙鏈、纖維調(diào)節(jié)素等實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)避免了人為造?？赡艽嬖诘牟僮魇д`，消除了造模過程中因感染和創(chuàng)傷對(duì)動(dòng)物造成的額外損傷，且從倫理學(xué)上減少了動(dòng)物的痛苦，這些都是該技術(shù)應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。但因現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因技術(shù)還沒有完全成熟，基因的敲除、插入等還存在不可控因素，其是否在基因的變化過程中調(diào)控到某些未知蛋白的表達(dá)而影響到體內(nèi)其他生理變化還很難確定。所以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的應(yīng)用還需技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展。

3 中醫(yī)模型

3.1 中醫(yī)病機(jī)和證型分類

KOA 在中醫(yī)屬“痹證”、“骨痹”范疇，《內(nèi)經(jīng)》指出“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹?！薄稄埵厢t(yī)通》：“膝為筋之府，膝痛無有不因肝腎虛者，虛則風(fēng)寒濕氣襲之?！薄峨s癥會(huì)心錄》：“況痹者閉也，乃脈絡(luò)澀而少宣通之機(jī)，氣血凝而少流動(dòng)之勢(shì)?！薄鹅`樞·本神》：“脾氣虛則四肢不用?！庇纱丝梢?，KOA 中醫(yī)病機(jī)以風(fēng)寒濕之邪為標(biāo)，以肝脾腎虧虛、血瘀氣滯為本。《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》將KOA 分為肝腎不足、筋脈瘀滯，脾腎兩虛、濕注骨節(jié)和肝腎虧虛、痰瘀交阻3 個(gè)證型［48］。中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科專業(yè)委員會(huì)2018 年發(fā)布的膝骨關(guān)節(jié)炎中西醫(yī)結(jié)合診療指南［49］將其分為氣滯血瘀證、風(fēng)寒濕痹證、肝腎虧虛證和濕熱蘊(yùn)結(jié)證4 個(gè)證型。中國中醫(yī)藥研究促進(jìn)會(huì)骨傷科分會(huì)發(fā)布的膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療指南（2020 年版）［50］將KOA 分為氣滯 血瘀證、濕熱痹阻證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證5 個(gè)證型。由此可見KOA 中醫(yī)證型劃分尚沒有統(tǒng)一定論，但其發(fā)病不外乎涉及肝、脾、腎三臟，病機(jī)主要涉及寒濕、血瘀、氣滯、痰濁等。

3.2 基于中醫(yī)病機(jī)的模型建立

中醫(yī)理論指導(dǎo)下的模型建立有其特殊性，也有其難點(diǎn)。特殊性在于中醫(yī)證候中的各項(xiàng)臨床癥狀需要體現(xiàn)在動(dòng)物身上，難點(diǎn)在于為了使其特殊性更好的體現(xiàn)則需要在模型設(shè)計(jì)上考慮諸多因素，包括動(dòng)物的體質(zhì)、疾病與證候結(jié)合的緊密度、環(huán)境因素等［51］。

筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)按照中醫(yī)證型建模用于探究中醫(yī)藥治療KOA 機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究較少，檢索到的幾篇文章大部分圍繞腎虛證型開展。劉波等［52］采用高電壓低電流電刺激器刺激日本大耳白兔，通過刺激后沿刺激籠跑跳并轉(zhuǎn)彎的運(yùn)動(dòng)方式建立運(yùn)動(dòng)性疲勞“肝腎虧虛”動(dòng)物模型。劉振峰等［53］通過去卵巢法建立腎虛模型，其依據(jù)是去除卵巢后能降低雌激素水平，而雌激素水平下降是腎虛的主要特征。其團(tuán)隊(duì)又應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素和腎上腺素法建立了血瘀模型，通過觀察舌質(zhì)青紫、瘀斑、出血和血流動(dòng)力學(xué)改變來判斷造模是否成功。荊生龍、侯蕾、李寧等［54-56］均采用切除卵巢的方法建立腎虛型動(dòng)物模型用于探究中藥對(duì)KOA 的作用機(jī)制，其實(shí)驗(yàn)均取得較好的結(jié)果。由此可見，卵巢切除法建立腎虛證動(dòng)物模型是行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的方法。

4 討論

筆者通過收集大量KOA 動(dòng)物模型選擇和建立的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其方法眾多且各有優(yōu)缺點(diǎn)，所以筆者認(rèn)為動(dòng)物建模中只有適合的模型沒有最優(yōu)的模型。一個(gè)合適的動(dòng)物模型是科學(xué)研究順利開展的基礎(chǔ)，也是實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)有效的保障。

在西醫(yī)理論指導(dǎo)下，成熟的模型建立方法相對(duì)較多且分類較細(xì)。自然誘發(fā)模型模擬了KOA 發(fā)病的真實(shí)過程，可以研究軟骨、滑膜、炎癥因子等多方面內(nèi)容，但其實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高。手術(shù)誘發(fā)模型穩(wěn)定性好，成功率高，需要技術(shù)成熟的實(shí)驗(yàn)人員參與全過程，且其誘發(fā)的模型因損傷較大，多為中晚期KOA 表現(xiàn)，不適合對(duì)早期KOA 進(jìn)行研究。藥物注射誘發(fā)方式選擇較多，其操作簡(jiǎn)單易行，造模時(shí)間短，適用于藥物療效和篩選的研究，但其可能引起關(guān)節(jié)內(nèi)其他結(jié)構(gòu)損傷破壞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。關(guān)節(jié)制動(dòng)和寒冷刺激誘發(fā)方式安全、操作簡(jiǎn)單，可以較好的模擬KOA 自然發(fā)病過程，進(jìn)行藥效學(xué)和作用機(jī)制的深入研究，但其同樣存在造模時(shí)間長(zhǎng)、成本高等問題。關(guān)節(jié)撞擊可以模擬各種創(chuàng)傷和運(yùn)動(dòng)損傷而引起的關(guān)節(jié)炎癥，其避免了手術(shù)高感染風(fēng)險(xiǎn)，但撞擊裝置的穩(wěn)定性是造模過程的一大技術(shù)難題，需要精巧的設(shè)計(jì)才能保證其精準(zhǔn)性。轉(zhuǎn)基因模型是科技進(jìn)步的產(chǎn)物，也是未來發(fā)展的方向，解決技術(shù)的穩(wěn)定性并控制其成本是該方法是否能夠廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。

筆者主要從事中醫(yī)藥防治OA 的基礎(chǔ)和臨床工作，并一直認(rèn)為中醫(yī)藥有很多臨床療效佳且值得推廣的治療方法，比如中藥內(nèi)服、針灸、膏藥外敷、中藥熏洗等。但這些中醫(yī)藥瑰寶需要更多的現(xiàn)代科學(xué)數(shù)據(jù)來證實(shí)其療效和作用機(jī)理，所以筆者格外關(guān)注實(shí)驗(yàn)研究中依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論構(gòu)建的動(dòng)物模型。有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有的中醫(yī)證侯模型已有60 多類，涉及130 多種疾病，但這些證候模型還存在很多不足［57］。筆者認(rèn)為，因“同病異治”和“異病同治”理論的存在，依據(jù)中醫(yī)理論構(gòu)建動(dòng)物模型的最高層次就是將疾病和證候有機(jī)結(jié)合，也就是病證結(jié)合模型。病證結(jié)合模型是中醫(yī)辨證論治思想在基礎(chǔ)研究中的折射，該類模型的建立能夠更好的論證中醫(yī)藥治療各類疾病的藥理學(xué)機(jī)制并進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，同時(shí)能夠助力中醫(yī)藥世界推廣，KOA 更是如此。雖然諸如脾虛證、心氣虛證、血虛證等各類動(dòng)物模型已有很多建模方法，但筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這些證候模型的建立主要被應(yīng)用在其他內(nèi)科疾病的研究中，而針對(duì)KOA 病癥結(jié)合模型建立的工作開展很少。同時(shí)，本文所闡述的各方法中，除3 種建立“肝腎虧虛”、腎虛”和“血瘀”模型的方法外，只有寒冷刺激誘發(fā)方式更接近于模擬痹證外感寒邪發(fā)病的條件，其余模型建立的方法與KOA 中醫(yī)病因病機(jī)似乎毫無關(guān)聯(lián)。所以要想深入研究中醫(yī)藥治療KOA 的機(jī)理，需要建立公認(rèn)的動(dòng)物模型用于其基礎(chǔ)研究。

綜上所述，西醫(yī)因?yàn)榫哂泻芏嘣炷７椒ㄔ黾恿似溥x擇難度，而中醫(yī)病證結(jié)合模型的建立是現(xiàn)今KOA 研究中較為缺乏的一部分。筆者認(rèn)為，解決實(shí)驗(yàn)操作、經(jīng)費(fèi)控制、模型穩(wěn)定性等細(xì)節(jié)問題是西醫(yī)方法建模的關(guān)鍵，而如果將更多手術(shù)、藥物注射等較先進(jìn)的西醫(yī)建模方法與中醫(yī)證候結(jié)合，比如通過切除卵巢建立KOA 腎虛模型，可能是促進(jìn)中醫(yī)病證結(jié)合模型建立的好方法。當(dāng)然，無論是根據(jù)西醫(yī)發(fā)病機(jī)制還是中醫(yī)病因病機(jī)建立的模型，都需要標(biāo)準(zhǔn)化量表和評(píng)分體系來評(píng)價(jià)模型的各項(xiàng)指標(biāo)。比如體現(xiàn)西醫(yī)診斷學(xué)的生化指標(biāo)、病理檢查等，體現(xiàn)中醫(yī)四診信息的大小便、體重、毛發(fā)、飲食、睡眠、精神狀態(tài)等［58］。這項(xiàng)工作也是今后動(dòng)物模型選擇和建立的重點(diǎn)和難點(diǎn)。希望更多同道加入到KOA 動(dòng)物模型和評(píng)價(jià)體系建立這項(xiàng)工作中，為KOA 疾病診治的整體發(fā)展貢獻(xiàn)力量。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張師僥：文獻(xiàn)查閱、整理、執(zhí)筆。李寧：動(dòng)物造模技術(shù)指導(dǎo)。楊永菊：文章思路整理。呂世偉：文獻(xiàn)查閱。關(guān)雪峰：統(tǒng)籌設(shè)計(jì)。