放化療性口腔黏膜炎動物模型的研究進展與比較

陳 晨，于 然，陳冬梅，鄧 超，婁彥妮，賈立群

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

口腔黏膜炎（oral mucositis，OM）是放化療常見的不良反應(yīng)之一。OM 主要表現(xiàn)在口腔黏膜的紅斑、潰瘍并伴隨疼痛，間接導(dǎo)致患者攝入減少而帶來體重下降［1］，OM 顯著降低生存質(zhì)量，影響癌癥治療方案的進行［2］。并且容易繼發(fā)感染，嚴(yán)重者威脅生命。有數(shù)據(jù)顯示頭頸部腫瘤放療患者中80%以上會出現(xiàn)OM［3］，接受同期放化療者超過90%會出現(xiàn)OM［4］。目前針對放化療相關(guān)OM 尚無基于生物學(xué)的常規(guī)預(yù)防或治療方法，當(dāng)前主要集中在減輕疼痛和不適等［5］。因此，找到基于生物學(xué)的防治方法是當(dāng)前迫切需要解決的問題。為進一步研究其發(fā)生機制及防治方法，需要構(gòu)建動物模型。本文檢索了近6 年相關(guān)文獻，對動物選擇及造模方法進行介紹并比較，以期為進一步研究提供參考。

1 造模動物選擇及對比

造模動物包括金黃地鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、小型豬，其中以金黃地鼠、小鼠、大鼠應(yīng)用較廣泛。選用嚙齒類實驗動物優(yōu)點在于其開展實驗成本較低，實驗操作方便，便于開展大樣本實驗，并且已開展的研究中多數(shù)采用嚙齒類動物，模型較成熟。缺點在于：（1）嚙齒類實驗動物口腔結(jié)構(gòu)以及口腔對于放射線的反應(yīng)與人類差異較大。（2）嚙齒類動物因體型較小，放射線照射時難以完全屏蔽顱腦及其余重要臟器，放射線對重要臟器的影響容易致死；并且口腔黏膜體積較小，對口腔黏膜的觀察較困難，取材時難以獲取足量的組織樣本，此類問題以小鼠最常見。（3）嚙齒類動物難以動態(tài)監(jiān)測血液指標(biāo)的變化［6］。選用小型豬優(yōu)點在于其口腔組織結(jié)構(gòu)與人類相似度較高，對于放射線的反應(yīng)與人類更接近。并且由于體型較大，便于放射線放射區(qū)域的限定，便于多次采集血液樣本、觀察口腔黏膜及采集組織進行檢測。但由于成本較高，難以大樣本開展，并且采用的研究較少，模型較不成熟。

嚙齒類動物中，金黃地鼠的優(yōu)點在于：口腔頰囊大，易于對口腔黏膜進行操作及觀察。但其缺點在于：（1）頰囊結(jié)構(gòu)特殊，缺乏組織相容性抗原，屬于免疫豁免區(qū)，不具有典型代表性；（2）動物品系不全面，難以滿足某些特定的品系需求。大鼠、小鼠的優(yōu)點在于種純、品系豐富等，缺點在于口腔黏膜觀察及操作較困難。豚鼠則有價格較高、品系不全面等問題，并且應(yīng)用的研究較少。

2 造模方法選擇

2.1 化療模型

2.1.1 化療聯(lián)用局部刺激

2.1.1.1 化療聯(lián)用局部機械刺激 化療聯(lián)用局部機械刺激模型應(yīng)用較廣泛，多數(shù)采用金黃地鼠?；煼椒楦骨蛔⑸?-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-fu）。5-fu 廣泛應(yīng)用于臨床，治療結(jié)腸癌、乳腺癌及胃癌等。這種造模方法最初由Sonis 等［7］提出，該研究采用金黃地鼠為模型動物，在實驗的第0、5、10 天以每次60 mg/kg 的劑量腹腔注射5-fu（該研究注明，該劑量保證了造模的成功，并且造成的全身性疾病發(fā)病率及死亡率最低），并且每日將頰囊外翻，用18 號針頭水平淺表地刮擦兩次以刺激頰囊黏膜，直到頰囊出現(xiàn)紅斑改變?yōu)橹?。大多?shù)動物機械刺激2 次即達到目的。對照組僅進行連續(xù)3 d 的相同機械刺激。在第10 天注射5-fu 后，試驗組表現(xiàn)出較明顯黏膜炎，其組織學(xué)特征是上皮破壞和表面壞死，并在實驗第16 天黏膜愈合。對照組在機械損傷后僅出現(xiàn)局部黏膜損傷及局部膿腫，并在24～48 h 內(nèi)快速自發(fā)愈合。

此后有多個研究采用這種化療聯(lián)用機械刺激的造模方法，改進了動物選擇或模型構(gòu)建方案。有研究采用金黃地鼠與BALB/c 小鼠兩種動物［8］，兩種動物分別分為化療+機械刺激組及化療組，并對比組間的差異。金黃地鼠的機械刺激部位為頰囊黏膜，小鼠為舌黏膜。結(jié)果顯示，與單用化療組相比，5-fu+機械刺激組表現(xiàn)出嚴(yán)重的口腔潰瘍，OM評分顯著提高，并且體重顯著降低（P＜0.01）。該實驗表明5-fu+機械刺激的造模效果優(yōu)于單用5-fu。Usumez 等［9］采用wistar 大鼠，實驗第1 天及第3 天分別向腹腔內(nèi)注射100、65 mg/kg 的5-fu，第3 天及第5天用18 號針尖對左側(cè)頰囊黏膜進行刺激。Antunes等［10］、Barbosa 等［11］、Barbosa 等［12］、Medeiros 等［13］參考了Sonis 等［14］的造模方法，均采用金黃地鼠，在第1、2 天分別以60 mg/kg 及40 mg/kg 的劑量腹腔注射5-fu，第4 天機械刺激黏膜，炎癥高峰期在實驗第10 天出現(xiàn)。其余造模方法包括對金黃地鼠，在第0、2、4 天腹腔注射60 mg/kg 5-FU，1、2、4 天進行機械刺激［15］。因金黃地鼠特殊的口腔頰囊結(jié)構(gòu)，化療聯(lián)用局部機械刺激的模型多數(shù)采用金黃地鼠為實驗動物。

2.1.1.2 化療聯(lián)用局部化學(xué)刺激 化學(xué)刺激主要為高濃度乙酸局部刺激口腔黏膜。該方法最初于1998 年由日本學(xué)者藤澤健司提出，該研究在家兔口腔黏膜局部應(yīng)用乙酸而產(chǎn)生潰瘍。后經(jīng)逐步完善，將之與化療相結(jié)合，用于研究化療所致OM 的動物模型構(gòu)建中。Takeuchi 等［16］選擇ICR 小鼠造模，探索造模方案。實驗分為5-fu 組及5-fu+乙酸組。5-fu 組分別在不同實驗時間腹腔注射相應(yīng)劑量的5-fu后，未發(fā)現(xiàn)口腔潰瘍的產(chǎn)生。其中60 mg/kg 劑量組產(chǎn)生較高死亡率。對于5-fu+乙酸組，在5-fu 的基礎(chǔ)上，第0 天對一側(cè)頰黏膜分別注射不同劑量的20%乙酸，觀察到口腔潰瘍的產(chǎn)生。該研究最終選擇最佳劑量為50 mg/kg 的5-fu 聯(lián)用15 μL 的20%乙酸注射。Takeuchi 等［17］同樣進行劑量對比，采用wistar 大鼠，在實驗開展前5、3、1 d 腹腔注射5-fu，實驗第0 天對右側(cè)頰囊注射25 μL 乙酸溶液。最終確定了每次40 mg/kg 的5-fu 劑量，及25%的乙酸溶液濃度。除此之外，有學(xué)者采用wistar 大鼠，腹腔注射5-fu 聯(lián)合浸泡濃乙酸的濾紙貼敷口腔黏膜的方法，同樣可有效造成口腔潰瘍［18，19］。2.1.2 單用化療模型

2.1.2.1 腹腔注射化療藥物 單純腹腔注射化療藥

物可以誘發(fā)OM，但不能誘發(fā)口腔潰瘍。Ahmed等［20］選用Wistar 大鼠，腹腔內(nèi)單次注射甲氨蝶呤（劑量為20 mg/kg）造模，注射4 d 后處死。結(jié)果表明，注射甲氨蝶呤可誘發(fā)OM，組織學(xué)特征符合初始的炎癥/血管期，不能誘發(fā)口腔潰瘍。Al-Azri等［21］的研究，對Agouti大鼠進行單劑量伊利替康（200 mg/kg）腹腔注射，72 h 內(nèi)對大鼠進行處死，僅發(fā)現(xiàn)口腔黏膜上皮厚度減少，未發(fā)現(xiàn)潰瘍。原因是大鼠口腔黏膜與人的口腔黏膜組織學(xué)有差異，大鼠單純應(yīng)用化療藥物不能誘發(fā)口腔潰瘍。但由于該研究觀察時間過短，可能OM 炎癥高峰期尚未到達，因此結(jié)論不夠嚴(yán)謹(jǐn)。2.1.2.2 靜脈注射化療藥物 通過靜脈注射化療藥物的研究較少。Bertolini 等［22］采用C57/BL6 小鼠，每48 小時以50 mg/kg 的劑量尾靜脈注射5-fu，持續(xù)13 d，并于第14 天處死。并設(shè)立腹腔注射的對照組，以每日100 mg/kg 5-fu 的劑量注射4 d，并在第5天處死。結(jié)果顯示：腹腔注射組迅速產(chǎn)生體重下降及腸炎，但未見口腔炎性改變，無炎性介質(zhì)表達的變化。而靜脈注射組產(chǎn)生了口腔及食管上皮的萎縮和細(xì)胞增殖減少、凋亡增加，伴有炎性介質(zhì)的變化，并可見外周血中性粒細(xì)胞的減少及口腔黏膜局部中性粒細(xì)胞的浸潤，伴隨著口腔黏膜連接蛋白（ecadherin protein）水平的降低。通過對比，該研究認(rèn)為腹腔注射化療藥物不能誘發(fā)OM，并且靜脈注射比腹腔注射的優(yōu)勢在于：（1）能在口腔上皮中觸發(fā)顯著的炎癥反應(yīng)，并且不會嚴(yán)重喪失腸功能；（2）更好地模擬目前大多數(shù)人類應(yīng)用5-fu 的方案。該研究對于腹腔注射組的結(jié)論與其他文獻不同，可能與該研究對于腹腔注射組的觀察時間過短，并未達到炎癥高峰期相關(guān)。

2.2 放療模型

2.2.1 單用放療模型 許多研究采用放射線照射的方法造模，不同研究采用的照射方法不同，包括單劑量照射及低劑量分割照射。照射劑量及照射位置也有所不同，位置包括吻部、單側(cè)頰黏膜、牽引出口腔外的舌頭等位置。根據(jù)Han 等［23］所述，給予小鼠每天8 Gy，連續(xù)3 d 的輻射模擬了臨床低劑量分割放射，并且是誘發(fā)OM 的最小劑量，小鼠在照射開始第9 天出現(xiàn)口腔潰瘍。Kowaliuk 等［24］及Sylvia等［25］對小鼠每天采用3 Gy，1 周內(nèi)連續(xù)照射5 d，共照射2 周的造模方法。Hu等［26］采用小型豬，在進行了多劑量對比研究后，最終確定了以每天6 Gy，連續(xù)5 d 的劑量，既能誘發(fā)顯著OM，并且動物體重及口腔黏膜得以恢復(fù)。部分研究對單劑量照射及分割照射進行對比。有研究采用C57BL/6J 小鼠，對小鼠頭頸部使用16.5 Gy 的單劑量照射或每天8 Gy，連續(xù)3 d的分次照射［27］。結(jié)果顯示：單劑量16.5 Gy 照射能使所有小鼠產(chǎn)生舌黏膜潰瘍，小鼠體重較初始體重均下降45%以上，并且所有小鼠在15 d 內(nèi)死亡。表明大劑量單次照射的致死率較高。Tao 等［28］采用C57/BL6 小鼠，對頭頸部進行放射，該研究選擇25 Gy 作為快速誘導(dǎo)放射性黏膜炎的最佳劑量。而Muhammad 等［29］采用BALB/c 小鼠，則認(rèn)為18 Gy 的劑量為最佳，在保證潰瘍持續(xù)時間足夠長的同時，可以保證100%的存活率。Kowaliuk 等［30］對C3H/Neu小鼠設(shè)立單劑量照射及分割照射分組研究。單劑量照射舌頭誘發(fā)黏膜潰瘍ED50劑量為（18.3±4.3）Gy，誘發(fā)潰瘍的平均潛伏期為（10.8±0.6）d，平均潰瘍持續(xù)時間為（3.5±0.8）d。分次照射（3 Gy/d×5 d/周×2 周）的ED50為（9.3±1.8）Gy，平均潛伏期為（7.9±0.6）d，潰瘍持續(xù)時間為（4.6±1.1）d。Li 等［31］對平均體重為300 g 的豚鼠進行單劑量30 Gy的劑量照射造模。近5年的研究中，對小鼠采用單劑量照射劑量為16～25 Gy［28，32］，對大鼠的單劑量為15～20 Gy［33.34］，不同研究得出的最佳造模劑量有所差異。對于金黃地鼠，Watanabe 等［35］采用劑量分別為20、30、40、50 Gy 的單劑量照射，最終得出：OM 的嚴(yán)重程度隨放射劑量增大而增大，但在放射劑量達40 Gy 時OM 已達最嚴(yán)重程度，不再與劑量相關(guān)。

2.2.2 放療聯(lián)用局部刺激模型 Shen［36］采用放療聯(lián)合化學(xué)刺激的方法，對C57 小鼠進行單劑量16 Gy 照射口腔，配合浸泡濃乙酸的濾紙貼敷口腔黏膜以誘發(fā)OM。有研究認(rèn)為單純應(yīng)用放射線照射僅能引起輕微病變，因此該研究加用了機械刺激。該研究對金黃地鼠采用單次35 Gy 的Co-60 照射，配合照射3 天后機械刺激，可誘發(fā)嚴(yán)重OM［37］。

2.3 放化療聯(lián)用模型

Choi 等［38］采用Balb/c 小鼠，在實驗的第0 天，以100 mg/kg 的劑量腹腔注射5-fu，注射30 min 后，給予20 Gy 的放射線照射，照射分兩次進行，每次10 Gy，中間間隔5 min。在實驗第9 天處死并取舌頭進行組織分析，證實可以誘發(fā)OM，并且試驗期間無實驗動物死亡。

3 造模方法對比

3.1 化療模型

注射化療藥物包括腹腔注射及靜脈注射，腹腔注射操作簡便，但對腸功能影響較大。靜脈注射能更好地模擬人類化療方案且不影響腸功能，但其操作相對于腹腔注射難度較大，且采用該方法的研究較少。

3.1.1 化療聯(lián)用局部刺激模型 局部刺激模擬臨床的慢性刺激過程，意義在于誘發(fā)局部口腔黏膜的嚴(yán)重OM，便于觀察及檢測。優(yōu)點：能準(zhǔn)確誘發(fā)嚴(yán)重OM 及口腔潰瘍。缺點：（1）刺激難以定量及標(biāo)準(zhǔn)化，機械刺激需保證對不同動物刺激量相同，但卻難以定量；（2）不符合臨床實際，尤其是化學(xué)刺激，模擬臨床的相似度較低；（3）操作難度較大，尤其是機械刺激，要求在口腔黏膜淺表刺激，不能造成黏膜破潰，對操作者要求較高。

3.1.2 單用化療模型 優(yōu)點：操作步驟較少。缺點：難以誘發(fā)嚴(yán)重OM 及口腔潰瘍，效果不確切。

3.2 放療模型

放射線照射需要屏蔽其余部位，若屏蔽不完全，容易損傷顱腦及其余重要臟器而致死。放射線照射分為大劑量單次照射及小劑量分割照射兩種，照射位置包括吻部、單側(cè)頰黏膜、舌頭等。大劑量單次照射誘發(fā)OM 效果較好，但致死率較高，并且與臨床應(yīng)用不同。小劑量分割照射致死率較低，較符合臨床，但誘發(fā)嚴(yán)重OM 效果相對較差，并且需要多次麻醉，對實驗動物影響較大。

3.2.1 單用放療模型 優(yōu)點：操作較簡單。缺點：誘發(fā)嚴(yán)重OM 及口腔潰瘍的效果不確切。

3.2.2 放療聯(lián)用局部刺激模型 優(yōu)點：能準(zhǔn)確誘發(fā)嚴(yán)重OM 及口腔潰瘍。缺點：黏膜刺激難以定量及標(biāo)準(zhǔn)化、操作難度大、不符合臨床實際。

3.3 放化療聯(lián)用模型

對于動物整體狀況影響較大；誘發(fā)嚴(yán)重OM 及口腔潰瘍的效果不確切。

除此之外，還有兩個問題值得關(guān)注：（1）觀察口腔黏膜需要對動物多次麻醉，多次麻醉對于動物本身的影響。為避免多次麻醉，部分研究如Mangoni等［39］采用Parkins 等［40］建立的嘴唇評分系統(tǒng)來評價OM，這類評價系統(tǒng)是否可行。（2）聯(lián)用頰黏膜局部刺激的研究觀察的是頰囊黏膜，不聯(lián)用局部刺激的研究多數(shù)觀察舌背黏膜的變化，頰囊黏膜與舌背黏膜對于放化療的反應(yīng)或?qū)τ谒幬锏姆磻?yīng)有所不同。

4 小結(jié)

目前各種放化療性O(shè)M 動物模型構(gòu)建方法都存在其不足。模型動物包括金黃地鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、小型豬，以前3 種應(yīng)用較廣泛。金黃地鼠便于進行口腔的觀察及操作，大鼠、小鼠種純、價廉、品系豐富。造模方法包括化療聯(lián)用局部刺激、單用放療、單用化療、放療聯(lián)用局部刺激、放化療聯(lián)用，以前兩種造模方法應(yīng)用較廣泛。放化療難以準(zhǔn)確誘發(fā)嚴(yán)重OM 及口腔潰瘍，往往需配合局部刺激才能保證其成功率，但局部刺激難以定量及標(biāo)準(zhǔn)化，難以保證其臨床模擬程度?，F(xiàn)有各種方法都難以達到操作簡便、符合臨床實際、并且能準(zhǔn)確誘發(fā)嚴(yán)重OM 的目標(biāo)。

5 展望

放化療性O(shè)M 機理尚未完全明確，并且無基于生物學(xué)的防治方法。構(gòu)建完善的動物模型對于研究其形成機制及防治方法有很大必要性。因此亟需完善動物模型的構(gòu)建方法。對上述幾種造模方法的橫向?qū)Ρ鹊难芯康拈_展，存在重要意義。

作者貢獻度說明：

陳晨：文獻檢索、整理、論文書寫；于然：文獻檢索、整理；陳冬梅：模型對比分析指導(dǎo)；鄧超：動物模型分析指導(dǎo)；婁彥妮：文章思路整理；賈立群：把握文章整體思路，指導(dǎo)論文修改。