張 蒙,陳大寶,李靜雅,趙春春,王 艷,2,蔡 標,2,3,周 鵬,2,3
(1. 安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院,安徽合肥 230012;2. 安徽省中醫(yī)藥科學院中西醫(yī)結(jié)合研究所,安徽合肥 230012;3. 中藥復方安徽省重點實驗室,安徽合肥 230012)
阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是以進行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的中樞退行性疾病,其主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙、記憶障礙及人格精神異常等[1],主要病理特征為β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)在神經(jīng)組織中沉積形成的老年斑(senile plaque,SP)、tau 蛋白在細胞內(nèi)異常磷酸化聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neuro fibrillary tangles,NFTs)以及廣泛的海馬神經(jīng)元丟失[2]。研究證明,在各類型炎癥中,NLRP3 炎癥小體是神經(jīng)退行性疾病中最具特征的,特別是在AD 中[3]。NLRP3 炎性小體的激活導致小膠質(zhì)細胞中Caspase-1 介導的白介素IL-1β 和IL-18 的生成,可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥作為治療AD 的關(guān)鍵性分子靶標[4]。NLRP3 信號通路作為AD 炎癥反應中重要的信號通路,其下游Caspase-1 和GSDMD 信號通路同樣可能與AD 的發(fā)生有一定聯(lián)系[5]。
大黃為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的根莖,別名黃良、火參、膚如、將軍等,具有攻積滯、清濕熱、瀉火、活血、祛瘀、解毒等功效[6,7]。其主要成分包括大黃酚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷等,重要的活性成分是蒽醌類化合物及其衍生物[8]。中醫(yī)認為,AD 屬“癡呆”范疇,主要病位在腦,其病因?qū)俦咎摌藢?,本虛多為腎精虧虛、腦髓失充,標實多涉及痰濁、瘀血,其治療原則可考慮以補腎填精為本兼以活血、化瘀、祛痰[9]。因此,大黃所具備活血、祛瘀的功效能針對AD 中“腦髓失養(yǎng)、痰濁瘀血”的病機,從而改善AD患者的認知功能。
現(xiàn)代藥理學研究表明,大黃具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、保護腦及心臟等活性,同時還可以改善大腦記憶功能[10,11],其有效成分可以通過產(chǎn)生抗炎、抗凋亡、抗氧化應激等作用起到治療AD 的效果,為后續(xù)臨床治療AD 提供理論依據(jù)[12]。然而,大黃治療AD 的作用機制尚不明確,因此,深入探討大黃的作用靶點,采用分子對接的方法來探討大黃的主要活性成分是否能通過NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路作用于AD,并尋找其潛在活性成分,為后期臨床研究和開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。
分子對接技術(shù)主要針對一個或多個與靶向疾病相關(guān)的靶蛋白,利用相關(guān)軟件對中藥復方庫進行虛擬篩選,根據(jù)對接后的Vina 評分結(jié)果,尋找與疾病靶蛋白特異性結(jié)合的候選化合物,從中篩選出具有活性的化合物。該方法提高了化學活性評價的效率,為中藥資源的進一步研究提供了新方向[13]。本研究借助分子對接技術(shù),將大黃中的主要活性化合物與NLRP3/Caspase-1/GSDMD 炎癥信號通路中的關(guān)鍵靶點進行分子對接,探討大黃治療AD 的相關(guān)作用機制,為今后中藥防治AD 的研究提供方向和思路。
通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[14],以“大黃”為關(guān)鍵詞,檢索大黃的所有化學成分,根據(jù)藥動學特征(ADME)對化學成分的口服利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug likeness,DL)進行篩選,并設置OB≥30%及DL≥18%作為活性分子的篩選條件,篩選出大黃的活性成分有16 個。結(jié)合相關(guān)文獻研究,增加大黃酚(MOL001729)[15,16]、大 黃 素(MOL000472)[17,18]、大 黃 素 甲 醚(MOL000476)、大黃酚葡萄糖苷(MOL002244)、大黃素蒽酮(MOL003353)、覆盆子酮(MOL002287)6個活性化合物[19,20],共22 個有效成分,下載化合物的MOL 格式的結(jié)構(gòu)(表1)。
表1 大黃的主要化學成分Tab 1 The main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei
以“NLRP3”、“Caspase-1”“GSDMD”為關(guān)鍵詞,從蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(http://www1.rcsb.org/)[21]檢索出AD 相關(guān)蛋白靶點,并結(jié)合相關(guān)文獻確定最佳靶點為6npy[22]、1rwx[23]、5wqt[24],并下載其pdb 格式三維結(jié)構(gòu)。
以根據(jù)條件篩選出的大黃活性成分為配體,通過PDB 數(shù)據(jù)庫查找的蛋白靶點為受體,通過CBDOCK 網(wǎng)站(http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php)進行分子對接[25]。分別得到每個化合物與3 個靶點的對接得分值(Vina score),Vina score 是用Vina 程序以相應的口袋參數(shù)對受體和配體進行分子對接所得到復合物的得分,得分值越低,配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。另外,考慮到結(jié)合位點盡量一致,以NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的抑制劑MCC950、ML132、LDC7559 與相應的靶點對接結(jié)果為陽性參照,篩選出對接結(jié)果。
分子對接結(jié)果顯示,大黃的主要化學成分均與NLRP3、Caspase-1、GSDMD 靶點具有較好結(jié)合。其中,大黃化學成分與NLRP3 蛋白靶點結(jié)合親和力較高的前3 位是β-胡蘿卜素氧化物、β-谷甾醇、大黃素甲醚雙葡萄糖苷。見表2、圖1。
圖1 大黃活性成分與NLRP3 靶點對接示意圖Fig 1 Schematic diagram of active ingredients of Radix et Rhizoma Rhei docking with NLRP3
表2 大黃主要化學成分與NLRP3 蛋白靶點的對接情況Tab 2 The docking results of the main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei with the NLRP3
與Caspase-1 蛋白靶點結(jié)合親和力前3 位為β-胡蘿卜素氧化物、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚雙葡萄糖苷。見表3、圖2。
表3 大黃主要化學成分與Caspase-1 蛋白靶點的對接情況Tab 3 The docking results of the main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei with the Caspase-1
圖2 大黃活性成分與Caspase-1 靶點對接示意圖Fig 2 Schematic diagram of active ingredients of Radix et Rhizoma Rhei docking with Caspase-1
與GSDMD 蛋白靶點結(jié)合親和力前3 位為β-胡蘿卜素氧化物、大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。見表4、圖3。
圖3 大黃活性成分與GSDMD 靶點對接示意圖Fig 3 Schematic diagram of active ingredients of Radix et Rhizoma Rhei docking with GSDMD
表4 大黃主要化學成分與GSDMD 蛋白靶點的對接情況Tab 4 The docking results of the main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei with the GSDMD
綜上所述,大黃主要化學成分與AD 相關(guān)NLRP3、Caspase-1、GSDMD 靶點的對接結(jié)果中,均有β-胡蘿卜素氧化物和大黃素甲醚雙葡萄糖苷,說明其可能是潛在活性成分,其中,結(jié)合效果最佳的是β-胡蘿卜素氧化物,與NLRP3、Caspase-1、GSDMD 靶點的Vina 得分最低,分別為-11.9、-9.0、-7.6,結(jié)合效果均優(yōu)于特異性抑制劑。
NLRP3 是一種核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族蛋白,是一種細胞內(nèi)傳感器,可檢測各種微生物基序、內(nèi)源性危險信號和環(huán)境刺激物,從而導致NLRP3 炎性體的形成和激活[26]。在各種類型的炎性小體中,NLRP3 炎性小體在神經(jīng)退行性疾病中,尤其是在AD 中最具特征。有研究發(fā)現(xiàn),在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中沉默Caspase-1 和抑制GSDMD 的表達后,小鼠皮層和海馬中Caspase-1 表達降低,細胞焦亡減少,同時改善了小鼠的認知功能,提示NLRP3/caspase-1 途徑介導的細胞焦亡與AD 的發(fā)病有關(guān);同時在體外實驗中發(fā)現(xiàn)Aβ 誘導的皮層神經(jīng)元中NLRP3/caspase-1 途徑表達的增加會使皮層神經(jīng)元發(fā)生細胞焦亡。Aβ 的沉積和錯誤折疊蛋白的聚集會激活NLRP3-ASC-pro-Caspase-1 炎性小體,繼而激活Caspase-1,促進炎癥因子IL-1β 和IL-18的分泌,引發(fā)細胞焦亡,進而導致細胞死亡,致使神經(jīng)元丟失,最終引發(fā)AD[27-30]。因此,通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥,NLRP3 炎性體可能是AD 的關(guān)鍵治療分子靶標。
目前,中藥因具有作用平穩(wěn)、毒副作用小、耐受性高、多組分、多靶點、多途徑起效的特點,尤其是在慢性炎癥方面發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢。但是由于受到各方面條件的限制,關(guān)于抗炎藥物及其作用機制方面的研究面臨困難。分子對接技術(shù)在中藥活性成分的虛擬篩選和確定作用靶標等方面已成功運用。通過對接中藥活性成分與信號通路相關(guān)靶點,篩選出與特定靶點結(jié)合緊密的活性成分,從而構(gòu)建了藥物-疾病-靶點之間的關(guān)系[31]。然而,分子對接技術(shù)在中藥領域的研究思路和方法仍存在一定的局限性,對接得分最低的化合物也未必是最佳的配體,需要與其他方法相結(jié)合,或者進行進一步的體內(nèi)外實驗驗證。
本研究運用分子對接進行分析,借助TCMSP可知中藥大黃中22 種主要活性成分,對NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號通路中的關(guān)鍵靶點具有較好的結(jié)合,體現(xiàn)了中藥復方“多成分-多靶點”的作用特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃中的主要活性成分中,其與NLRP3 蛋白靶點結(jié)合親和力較強的10 個化合物中,最優(yōu)化合物是β-胡蘿卜素氧化物,其次是蒽醌類化合物,主要包含7 個蒽醌化合物,分別為大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚葡萄糖苷、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素蒽酮。與Caspase-1 蛋白靶點結(jié)合親和力最強的是β-胡蘿卜素氧化物,其他排名靠前的蒽醌類化合物有大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素、大黃素蒽酮、番瀉苷E_qt、番瀉苷D_qt 和大黃酸。與GSDMD 蛋白靶點結(jié)合親和力最強為β-胡蘿卜素氧化物,其他化合物以蒽醌類化合物為主,主要有大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚、番瀉苷E_qt 和大黃素。由此說明,大黃可能通過作用于NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號通路發(fā)揮抗炎作用,為揭示大黃防治AD 的抗炎作用機制提供理論依據(jù)。除此之外,大黃中與NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號通路中的三個靶點結(jié)合最強的化合物是β-胡蘿卜素氧化物,其次是蒽醌類化合物為主,說明β-胡蘿卜素氧化物和蒽醌類化合物有望作為單體或者先導化合物進行結(jié)構(gòu)修飾后參與AD 的治療,為后期進一步進行體內(nèi)外實驗驗證以及深入研究大黃防治AD的抗炎機制提供科學假設和理論依據(jù)。
作者貢獻度說明:
張蒙:課題實施及撰寫全文;陳大寶:課題實施,圖片編輯;李靜雅:課題實施,圖片編輯;趙春春:課題實施,圖片編輯;王艷:修改論文;蔡標:修改論文、課題來源;周鵬:課題設計、修改論文、課題來源。