自噬在多種因素所致急性肺損傷中的研究進展

李秋呈，李 琪，2，3，賈盼紅，李少寧，熊曉嫚，周向東，2，3

（1. 海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南?？?570102；2. 急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室，海南?？?571199；3. 中國醫(yī)學科學院海島急救醫(yī)學創(chuàng)新單元 2019RU013，海南?？?571199）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由各種因素引起的以肺泡、毛細血管通透性增加為基礎(chǔ)，導致肺泡水腫伴大量炎癥細胞浸潤，繼而出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合癥的一組綜合征，其病死率可高達50%［1］。ALI 病因復雜，包括感染因素（如細菌、病毒）和非感染因素（如急性胰腺炎、吸入有害氣體），ALI 目前發(fā)病機制尚不明確，所以探究ALI 發(fā)病機制迫在眉睫。目前主要治療方案包括糖皮質(zhì)激素抗炎、機械通氣改善氧飽和度等。自噬在動物細胞中扮演著不同的生理及病理作用［2］。研究表明調(diào)節(jié)自噬可以減輕ALI，提示自噬可能成為ALI 治療新靶點［3］，但自噬在不同病因引起ALI 中的作用不盡相同。

1 自噬及其相關(guān)機制

自噬是細胞分解代謝過程中，通過溶酶體介導清除胞質(zhì)中缺陷、受損細胞器、變性蛋白質(zhì)及病原體等，有利于細胞正常功能的運行及穩(wěn)態(tài)的維持，亦是機體的防御、應激調(diào)控機制［4］。自噬根據(jù)溶酶體進入途徑不同分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導的自噬3 種類型［3］。巨自噬也稱自噬，與ALI 關(guān)系最為密切。自噬主要包含5 個部分［5］：（1）自噬過程的啟動（吞噬細胞膜誘導）；（2）吞噬泡形成；（3）自噬體延伸、成熟；（4）吞噬-溶酶體復合體的融合；（5）吞噬物的降解，以上過程是由自噬相關(guān)基因（ATG）調(diào)控形成自噬相關(guān)蛋白家族（ATGs）介導完成。目前在酵母遺傳學中發(fā)現(xiàn)有超過30 種自噬相關(guān)基因，在哺乳動物中鑒定出11 個相關(guān)基因［6］。Mercer 等［7］通過分子角度對自噬的變化過程進行了詳細闡釋。與自噬調(diào)控過程明顯相關(guān)的ATGs 主要分為4 大類［8，9］：（1）Atg1/unc-51 樣激酶起始復合物（ULK1），包括ULK1、ATG1（酵母）和Atg101，哺乳動物中通過ULK1 作用于雷帕霉素靶蛋白（mTOR）調(diào)節(jié)自噬啟動；（2）Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶成核復合物，包括Atg18/Atg2 復合物、PI3KC3、Vps34、Beclin-1 和Atg6，其參與吞噬泡核心的形成；（3）微管相關(guān)蛋白輕鏈3 和兩種泛素類復合物（LC3/ATG8、Atg5-Atg16L1-ATG12），參與自噬體延伸；（4）跨膜相關(guān)蛋白（ATG9、Atg18、WIPI-1 和VMP1）調(diào)控自噬體成熟。形成的自噬體與溶酶體融合，結(jié)合產(chǎn)生自噬溶酶體復合物，通過蛋白水解酶分解包繞的物質(zhì)，有效成分再次重吸收利用。自噬的激活依賴于mTOR 與ULK1 復合物解離。自噬調(diào)控途徑包含以下3 個途徑：（1）mTOR 途徑：該途徑通過mTOR抑制Atg1 募集Atg13、Atg17 從而抑制自噬，mTOR是自噬誘導的主要調(diào)節(jié)靶點，雷帕霉素是常用的mTOR 抑制劑，通過抑制mTOR 位點的激活，可調(diào)控自噬強度［10，11］；（2）由Atg6/Beclin-1 介導途徑：其與Ⅲ類PI3K Vps34 形成復合物，Vps34 是3-甲基腺嘌呤藥物抑制劑靶點，同時Beclin-1 是自噬和細胞凋亡途徑之間的重要接口，抗凋亡蛋白Bcl-2 及Bcl-XL 結(jié)合Beclin-1 可抑制自噬［12］；（3）兩個泛素樣結(jié)合過程途徑：Atg7 和Atg10 介導Atg12 與Atg5/19的結(jié)合，隨后與Atg16/20 相互作用，第2 個關(guān)鍵的共軛反應涉及Atg8 或微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）［13］。

2 自噬在感染性因素所致ALI 中的作用

2.1 銅綠假單胞菌（PA）感染所致的ALI

PA 是一種機會致病性革蘭陰性桿菌，且是細胞外病原體。膜聯(lián)蛋白家族成員Annexin A2（AnxA2）在多種細胞（如內(nèi)皮細胞，單核細胞，巨噬細胞）中表達，AnxA2 在非小細胞肺癌，慢性阻塞性肺疾?。–OPD）和慢性炎性疾病等肺部疾病中發(fā)揮多種作用，同時參與多種細胞的功能表達；抑制AnxA2 活性，腹膜巨噬細胞的吞噬能力降低，提示AnxA2 參與巨噬細胞的內(nèi)吞作用和EGFR 介導的信號轉(zhuǎn)導［14，15］。使用野生型小鼠與AnxA2-/-小鼠比較發(fā)現(xiàn)，PA 感染后AnxA2-/-小鼠的存活率降低，炎癥反應更加明顯，肺實質(zhì)損傷更加嚴重［16］。IFNγ 與銅綠假單胞菌感染相關(guān)，通過使用IFN-γ 預處理細胞可以增強自噬，導致細菌存活率降低，但當敲除Beclin-1 的表達后，細菌清除率減少，提示抑制自噬可減弱肺巨噬細胞（AMs）殺傷功能［17］。PA 誘導的自噬作用由AnxA2-Akt1-mTOR-ULK1/2 和Beclin-1-ATG7-ATG5 信號通路介導［17，18］。近年研究示，PA 激活Toll 樣受體2（TLR2）通過Src 激酶Lyn 介導AMs 的異種吞噬降解，同時Wnt5A-Rac1-Disheveled 通路也被用于誘導AMs 的異種吞噬［19，20］。由此可知，PA 感染引起ALI 時，上調(diào)自噬有利于細菌清除，減輕肺部炎癥反應，對機體有保護性作用，AnxA2基因表達、Beclin-1-ATG7-ATG信號通路活化、TLR2 激活等參與了PA 感染啟動自噬的過程。

2.2 H1N1 病毒感染所致的ALI

研究報道H1N1 病毒感染會促進circular RNA GATA Zinc Finger Do-main Containing 2A（circ-GATAD2A）的表達，circ-GATAD2A 的形成通過抑制自噬促進病毒復制；敲除Vps34基因，抑制Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶成核復合物的形成，亦可促進病毒復制，加重肺損傷［21］。上皮細胞感染甲型流感病毒后，人肺上皮細胞中Atg8/LC3-Ⅱ自噬標記物明顯增加，流感病毒感染抑制自噬體與酸化LAMP1溶酶體的融合，從而阻止了自噬底物的降解；病毒M2 蛋白以Atg6/Beclin-1 為靶點，干擾Atg6/Beclin-1 和PI-3 激酶復合物結(jié)合，并通過與LC3 之間的相互作用抑制自噬體與溶酶體融合，阻斷自噬體的降解，自噬下調(diào)導致病毒感染的肺組織細胞死亡和病毒釋放增加［22］。現(xiàn)今治療藥物如奧司他韋等，研究表明［23］奧司他韋可通過誘導H1N1 病毒自噬，達到清除病毒目的。以上提示H1N1 感染引起ALI 機制與自噬功能減弱相關(guān)，上調(diào)自噬表達可提高機體對病毒清除能力，減少病毒釋放，達到治療H1N1 引起ALI 的作用。

2.3 H5N1 病毒感染所致的ALI

H5N1 通過TAK1-MKK4 途徑誘導JNK 磷酸化，進一步磷酸化Bcl-2 后促進Bcl-2-Beclin1 復合體解離，JNK 信號通路的激活可上調(diào)自噬水平，促進病毒復制［24］。研究發(fā)現(xiàn)，H5N1 病毒亦可通過活化Akt-TSC2-mTOR 信號通路調(diào)節(jié)自噬，感染病毒時人肺A549 細胞自噬標志分子LC3-Ⅱ表達增多，使用3-MA 和Atg5siRNA 抑制細胞自噬時，可提高A549 細胞活力，減輕肺損傷［25］。禽流感病毒可導致肺上皮細胞自噬性死亡，其誘導自噬死亡可能通過激酶AKT、腫瘤抑制蛋白TSC2 和mTOR 靶點等途徑，通過特異性的自噬抑制劑能夠緩解H5N1 引起的細胞自噬性死亡以及小鼠的急性肺損傷［25，26］。上述研究提示自噬水平與病毒復制呈正相關(guān)關(guān)系，過度自噬與ALI 密切相關(guān)，下調(diào)自噬表達可抑制病毒復制，減輕肺損傷。但部分研究表明特定方式誘導自噬能夠抑制甲型流感病毒復制，如Tu 延伸因子（TUFM）可以作為抑制禽流感病毒在人體細胞中復制的宿主限制因子，與NLRX1 相互作用增強自噬，通過介導自噬作用阻止禽流感病毒在人體細胞中的復制［27］。

2.4 新型冠狀病毒（COVID-19）感染所致的ALI

新型冠狀病毒屬βCoV，新型冠狀病毒引起ALI 的形成是患者死亡的主要原因。研究證實βCoV 通過NSP6（非結(jié)構(gòu)蛋白6）在感染細胞中誘導ATG5 依賴性自噬體的形成，并通過自噬體的雙膜囊泡（DMV）進行復制［28，29］。對COVID-19 基因組序列進行分析，發(fā)現(xiàn)NSP6基因突變，其作為一種多通路跨膜蛋白，表面有多個苯丙氨酸殘基，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜相結(jié)合，破壞自噬體對病毒的降解，同時NSP6基因表達對自噬體的形成有誘導作用［30］。在病毒感染時，未折疊蛋白（UPR）可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累被激活，其作為病毒蛋白來源，參與雙膜囊泡形成并協(xié)助病毒復制，此外UPR 和自噬相互關(guān)聯(lián)，誘導UPR 可促進自噬，因此COVID-19 感染可能通過UPR 誘導細胞自噬［31，32］。自噬抑制劑阻止自噬體與溶酶體融合，抑制自噬通量進而上調(diào)自噬體的積累，自噬體可誘導病毒感染細胞的凋亡，并擾亂病毒復制周期，當病毒感染期間存在自噬抑制劑時，多個過程的干擾可對病毒的復制進行遏制；結(jié)合氯喹作為抗病毒藥物的作用機制，表明這些自噬抑制劑可能會中斷病毒生命周期的早期步驟，即病毒與溶酶體的融合，從而減少病毒復制并保護細胞免受病毒誘導的細胞死亡［33］。綜上，新型冠狀病毒上調(diào)自噬為其復制提供基礎(chǔ)，加速細胞死亡，加重肺組織細胞損傷，抑制自噬可能作為治療新型冠狀病毒的方案之一，不過還需要更多的研究來闡明這些自噬抑制劑與COVID-19 的確切作用機制以及在病毒生命周期不同階段的影響。

2.5 脂多糖（LPS）所致的ALI

LPS 是一種病原體相關(guān)分子模式（PAMP），能夠識別細菌入侵并激活先天免疫系統(tǒng)。LPS 刺激可調(diào)節(jié)肺上皮細胞、肺內(nèi)皮細胞和AMs 的自噬，Atg4b 缺乏小鼠，經(jīng)LPS 刺激后ATF3 活性減弱，肺對LPS 介導的損傷敏感性增加；LPS 可增加肺微血管內(nèi)皮細胞的通透性，加重炎癥滲出，這是引起ALI臨床表現(xiàn)的原因之一，使用siATG5、siATG7 或氯喹抑制自噬后，可顯著增加肺微血管內(nèi)皮細胞通透性，加重LPS 誘導的小鼠肺損傷，提示自噬在LPS誘導的肺損傷中具有保護作用［34，35］。研究報道TLR4或MYD88基因敲除小鼠，可有效地降低LPS誘導的MTOR 激活，并增強自噬相關(guān)標志物LC3B，且研表明MTOR 正調(diào)控細胞NF-κB 的激活，提示LPS 可通過激活TLR4/MYD88-MTORNF-κB 信號通路抑制自噬，并調(diào)節(jié)炎癥因子釋放［36］。同時AMPK 是mTOR 的抑制劑和自噬激活劑，AMPK 通過磷酸化TSC2（mTOR 抑制劑）抑制mTOR 的激活，從而阻止ULK1 的抑制性磷酸化并促進自噬表達，LPS 誘導AMPK 失活從而導致mTOR 活化增強、ULK1 活性降低，使自噬受到抑制［37］。

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（CaMK）是一個對細胞內(nèi)鈣離子濃度敏感的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，CaMKKβ 可作為AMP 激酶的上游激酶，并通過Bcl-2 上調(diào)細胞內(nèi)鈣離子濃度從而調(diào)節(jié)自噬；激活的CaMKIα 可磷酸化AMPK，形成CaMKIα-AMPKATG7 復合物，該信號通路介導的自噬顯著減弱了LPS 誘導的肺中性粒細胞炎癥［38］。脂毒素（Lipoxins，LXs）是由免疫細胞（如巨噬細胞和中性粒細胞）合成的內(nèi)源性脂質(zhì)，具有抗炎和促分解作用，肺微環(huán)境中LXs 的增加促進中性粒細胞凋亡，同時增強巨噬細胞對凋亡中性粒細胞的吞噬/清除，具有抗炎和促分解雙重作用；研究發(fā)現(xiàn)BML-111（脂蛋白A4 受體激動劑）通過MAPK 刺激AMs 的自噬并抑制凋亡，減輕ALI 相關(guān)的炎癥和組織損傷［39］。綜上所述，在LPS 引起的ALI 中，自噬作為一種防御、應激機制，有利于維持肺微血管內(nèi)皮細胞通透性，減輕炎癥反應，改善肺水腫癥狀，延長存活時間。適度增加自噬可作為LPS 誘導ALI 的一個潛在治療靶點。

不過在部分研究中利用3-MA 抑制自噬后LPS誘導的小鼠肺部炎癥反應被顯著抑制；LPS 激發(fā)自噬促進肌動蛋白細胞骨架重排和VE 鈣黏蛋白裂解進而破壞肺血屏障功能，抑制自噬可阻止VE 鈣黏蛋白的分解而減輕屏障功能障礙，并改善LPS 作用后的肺血管損傷；研究證實敲除Atg5基因小鼠可通過減弱LPS 對中性粒細胞顆粒內(nèi)容物的釋放誘導，減輕炎性因子對肺內(nèi)皮細胞屏障破壞以及炎癥反應，從而減輕ALI［40］。研究表明通過抑制p38 MAPK 活化及TLR4/NF-κB 信號通過激活，可下調(diào)自噬作用并減輕炎性因子水平，改善肺功能［41，42］。分析其原因為LPS 可促進中性粒細胞過度自噬，刺激顆粒內(nèi)容物釋放，增加肺微血管通透性，使用3-MA 處理能抑制TLR4/NF-κB、p38 MAPK 激活，減輕ALI，表明過度自噬亦是LPS 引起ALI 的機制之一。

2.6 膿毒血癥所致的ALI

在盲腸結(jié)扎穿刺誘導的膿毒血癥小鼠模型中，膿毒血癥小鼠肺部的LC3-Ⅱ、ATG5 和ATG7 水平下調(diào)，這表明膿毒血癥可能抑制自噬；使用雷帕霉素或活化蛋白C（APC）刺激自噬可減少炎癥和減輕肺損傷，提示上調(diào)APC 自噬可成為治療膿毒血癥的潛在靶點［43］。研究發(fā)現(xiàn)低生理劑量的一氧化碳（CO）可通過增強肺上皮細胞中Beclin-1 依賴的自噬過程，從而提高膿毒血癥小鼠的存活率，而敲除Beclin-1基因小鼠CO 對膿毒血癥保護作用減弱［44］。部分研究發(fā)現(xiàn)膿毒血癥小鼠肺部的LC3-Ⅱ水平顯著升高；與野生型小鼠比較，高表達LC3基因的小鼠表現(xiàn)出加速自噬體與溶酶體的融合，并在CLP 后存活時間延長，研究得出自噬在膿毒血癥中的作用可能與自噬通量有關(guān)：自噬通量的保存對膿毒癥有細胞保護作用，而自噬通量受損導致的自噬體積累可能是膿毒血癥晚期肺損傷的原因之一［45］。綜上，自噬在膿毒血癥引起的ALI 中起保護作用，適當調(diào)節(jié)自噬可有效減輕膿毒血癥性肺損傷。

2.7 炎癥小體與自噬

炎癥小體是一類由細胞內(nèi)的模式識別受體（PRRs）即NOD 樣受體（NLRs），包括危險相關(guān)分子模式（DAMPs）和致病原相關(guān)分子模式（PAMPs），集合成的大分子復合物［46］。在細菌、病毒、真菌等微生物感染及二氧化硅、石棉等微小有毒顆粒的刺激下可激活NLRP3［47］。NLRP3 被啟動激活后，裝配完成的NLRP3 炎癥小體可以分裂無活性的caspase-1 成有活性的caspase-1，激活的caspase-1 可以將pro-IL-1β 及pro-IL-18 剪切成有活性的IL-1β 和IL-18，并釋放到細胞外［48］。IL-1β 及IL-18 可刺激炎癥因子產(chǎn)生、調(diào)控巨噬細胞和中性粒細胞積聚，并引發(fā)炎癥的“瀑布效應”損傷肺泡上皮細胞，導致肺泡通透性增加增加肺水腫發(fā)生率。

病原體感染及其相關(guān)產(chǎn)物可引起體內(nèi)炎癥小體的激活，失控的炎癥反應與急性肺損傷密切相關(guān)。LPS、膿毒血癥致ALI 血漿中高表達caspase-1、IL-1β 及IL-18，提示LPS/膿毒血癥可引起依賴caspase-1 的炎癥小體途徑被激活，而且循環(huán)中IL-18 的增加與疾病嚴重程度和死亡率相關(guān)；同時LPS 可通過NF-κB 信號通路上調(diào)巨噬細胞表面的IL-1RI 的表達，導致肺泡巨噬細胞的焦亡并加重肺部炎癥［49，50］。NLRP3 炎癥小體一方面可刺激炎性因子釋放、另一方面可激活巨噬細胞加重肺損傷。在LPS 誘導ALI 發(fā)生中，自噬缺陷小鼠巨噬細胞內(nèi)大量異常線粒體聚集，激活NLRP3 炎癥小體，小鼠死亡率增加；Atg7基因敲除小鼠及自噬蛋白Atg16l1缺陷小鼠與野生型小鼠比較，其體內(nèi)NLRP3 炎癥小體被激活，IL-1β、IL-18 表達增加，提示自噬可通過調(diào)節(jié)炎癥小體活性，減少炎性因子釋放［51］。受損線粒體DNA 是激活炎癥小體主要因素之一，lc3b-/-或Beclinl+/-巨噬細胞易聚集生理異常的線粒體，并產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），在LPS 作用后線粒體容易發(fā)生更嚴重的結(jié)構(gòu)紊亂和功能障礙，刺激炎癥小體激活及炎性介質(zhì)釋放，提示自噬通過清除誘導炎癥小體活化成分而抑制其激活［52］。由此可見，病原體感染可引起炎癥小體活化，促進炎癥因子釋放甚至引發(fā)“炎癥瀑布效應”，增強自噬可清除激活炎癥小體活化成分，減輕炎癥反應對肺組織細胞損害。

3 自噬在非感染性因素所致ALI 中的作用

3.1 氯氣（Cl2）所致的ALI

Cl2暴露于肺上皮細胞可導致線粒體功能障礙和ROS 積聚，這可能是肺損傷的主要原因［53］。研究顯示Cl2可促進線粒體超氧化物形成，進而影響線粒體耗氧量、膜電位和糖酵解，并抑制線粒體轉(zhuǎn)運鏈中的復合物活性；Cl2干預細胞后其自噬標志物LC3。

BII 水平升高，p62 蛋白水平降低，p62 水平的降低被認為是自噬的表現(xiàn)，使用自噬激活劑（海藻糖）干預Cl2暴露后的細胞發(fā)現(xiàn)其線粒體呼吸功能得到改善；相反利用3-MA 處理暴露Cl2后的細胞可進一步出現(xiàn)生物功能障礙［54］。這些結(jié)果表明，Cl2暴露導致自噬增加，而自噬在Cl2誘導的肺損傷中具有保護作用，適當增強自噬對Cl2引起的ALI 起到保護作用，其機制可能是通過誘導自噬防止線粒體損傷、減少炎癥和改善Cl2毒性。

3.2 急性胰腺炎（AP）所致的ALI

AP 通過激活TLR4/NF-κB 信號通路，誘導TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子釋放，進一步募集炎癥細胞及促進炎癥反應的發(fā)生，全身炎癥反應是急性胰腺炎病理特征，亦是導致ALI 的主要原因［55］。Diakopoulos 等［56］通過Atg5基因缺失小鼠發(fā)現(xiàn)，正常自噬在維持胰腺穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用；異常自噬是引起AP 病理損傷的關(guān)鍵點，AP 期間會導致自噬通量受損，大量自噬小體聚集活化胰蛋白酶原，提示AP 與自噬通量受損密切相關(guān)［57］。AP 期間產(chǎn)生的大量炎性介質(zhì)及細胞因子作用于Toll 樣受體，活化NF-κB 信號通路，級聯(lián)產(chǎn)生大量炎癥因子，導致局部或全身爆發(fā)性炎癥反應；自噬功能受損，對炎性介質(zhì)清除能力顯著減弱，并進一步激活炎癥小體加重炎癥反應損害組織細胞；敲除Beclin-1 的小鼠NF-κB 活化程度和TNF-α 生成均較野生型小鼠增加［58］。同時自噬受損時p62 得不到及時降解，p62可進一步引起NF-κB 活化，釋放大量炎癥因子，加重組織損傷。綜上，急性胰腺炎與異常自噬息息相關(guān)，并通過激活TLR4/NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應加重肺組織損傷，但自噬功能受損與AP 之間的因果關(guān)系尚未明確，提示可能通過調(diào)節(jié)異常自噬，進而抑制NF-κB 通路激活達到治療AP 致ALI 的目的。

4 展望

目前關(guān)于自噬在ALI 中作用的研究已取得較大進展，且在不同模式ALI 中自噬發(fā)揮不同的作用，但其具體分子機制仍需進一步探索。ALI 起病迅速，病情兇險，目前尚缺乏針對ALI 的確切有效療法，以抑制或激活自噬為治療手段對多種因素致ALI 起到積極作用，同時抑制自噬可能為有效治療新型冠狀病毒提供新思路。目前關(guān)于自噬研究大多基于細胞或動物實驗，將上述治療手段轉(zhuǎn)化到臨床應用尚需漫長探索。未來研究需探索自噬在人體表達程度的特異標志物，為實現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬表達達到治療疾病目的提供基礎(chǔ)。

作者貢獻度說明

李秋呈：收集相關(guān)文獻及論文書寫；周向東：文章項目構(gòu)思及審核；其余作者參與文獻收集、分析。