青蒿琥酯通過TLR4/NF-κB信號通路抑制人胃癌裸鼠移植瘤生長及對PCNA和ZNF139表達(dá)的影響Δ

劉曉蕾，馬立東，張朵朵

(1.邯鄲市第一醫(yī)院老年病一科，河北 邯鄲 056000； 2.邯鄲市第一醫(yī)院消化一科，河北 邯鄲 056000； 3.河北省優(yōu)撫醫(yī)院內(nèi)一科，石家莊 050062)

胃癌是我國死亡率居前3位的惡性腫瘤，極大地危害患者的生命健康。由于缺乏特殊臨床表現(xiàn)，胃癌早期診斷率低，確診時多為中晚期，該類患者手術(shù)治療效果不佳，化療敏感性低，5年生存率普遍<30%[1]。相較于西醫(yī)治療，中藥可作用于胃癌發(fā)生、發(fā)展多個環(huán)節(jié)，具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，同時不良反應(yīng)小、耐藥性低，是我國治療惡性腫瘤的特色療法。青蒿琥酯是中藥青蒿中分離得到的抗瘧疾有效單體青蒿素的衍生物，具有抗感染、抗瘧、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生物活性[2-3]。增殖、侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌演變過程中的重要步驟，也是造成患者預(yù)后差的主要原因，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)與DNA合成密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖周期中作用關(guān)鍵；鋅指蛋白(ZNF)家族成員對多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)以人胃癌裸鼠移植瘤動物模型為研究對象，分析青蒿琥酯對人胃癌裸鼠移植瘤生長及對PCNA和ZNF139表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞株

SPF級BALB/c裸鼠40只，8周齡，雌雄各半，體重(22±5) g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號為SCXK(粵)2019-0035。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫20～22 ℃，通風(fēng)良好，自由飲水進(jìn)食，12 h明暗交替。人胃癌細(xì)胞株SGC7901購自中科院上海細(xì)胞所。

1.2 儀器

CKX53型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；LF-31DS型瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備(北京龍方科技有限公司)；MQ-PYZ-82型電熱恒溫培養(yǎng)箱[中科美其(北京)科技有限公司]；Fluocycle型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(上海科華生物工程股份有限公司)。

1.3 藥品與試劑

注射用青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H10930195，規(guī)格為60 mg)；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H37021358，規(guī)格為10 mg)；氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20083400，規(guī)格為500 mL∶4.5 g)；10%胎牛血清(FBS，澳大利亞Ausbian公司，貨號為VS100TZ)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher公司，批號為187256)；Trizol Reagent(美國Invitrogen 公司，批號為18572)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞株SGC7901接種于1640培養(yǎng)基(10%FBS)，5%CO2、37 ℃和95%濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞生長匯合時按1∶ 3傳代，每周1～2次。經(jīng)0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液消化后收集對數(shù)生長周期細(xì)胞。

1.4.2 人胃癌裸鼠移植瘤模型建立：將收集的對數(shù)生長周期細(xì)胞按800 r/min離心(離心半徑為13.5 cm)分離4 min，棄置上清液后配制為單細(xì)胞懸液(2×107個/mL)。無菌條件下接種于裸鼠腋下，劑量為0.2 mL/只，繼續(xù)飼養(yǎng)1周觀察狀態(tài)。以裸鼠皮下出現(xiàn)直徑約5 mm的結(jié)節(jié)為模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)，40只裸鼠均建模成功，成瘤率為100%，

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法：將40只建模成功裸鼠隨機(jī)分為模型組、順鉑組、青蒿琥酯組和聯(lián)合組，每組10只。順鉑組給予順鉑4 mg/kg，青蒿琥酯組給予注射用青蒿琥酯100 mg/kg，聯(lián)合組給予順鉑4 mg/kg+注射用青蒿琥酯100 mg/kg，模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液。所有大鼠均瘤體內(nèi)注射給藥，給藥體積為0.01 mL/g，每周給藥2次，持續(xù)4周。

1.4.4 標(biāo)本處理：停藥次日稱重，摘眼球取血，處死裸鼠，取瘤體，剝離中心壞死組織和周圍結(jié)締組織，分為4份，1份采用甲醛固定進(jìn)行病理檢測，2份以液氮快速冰凍后于-80 ℃保存待檢，1份研磨成細(xì)胞懸液進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 一般情況觀察：從藥物干預(yù)開始直至停藥，每日觀察裸鼠食欲、活動度和精神狀態(tài)等情況。

1.5.2 抑瘤作用觀察：取各組裸鼠瘤體稱重，計算抑瘤率=(模型組瘤體平均重量-干預(yù)組瘤體平均重量)/模型組瘤體平均重量×100%。

1.5.3 病理檢測：固定后腫瘤組織常規(guī)石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅染色法觀察病理狀態(tài)。石蠟切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇脫水后進(jìn)行蘇木素染色10 min，自來水沖洗；分化液分化30 s，溫水浸泡5 min，伊紅染色2 min；脫水、透明后封片，由病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下觀察切片病理情況，每張切片選取5張無重復(fù)視野圖像，采用盲式閱片，依據(jù)陽性細(xì)胞比例判定。

1.5.4 噻唑藍(lán)法(MTT)檢測原代細(xì)胞生長：將新鮮瘤體組織加入適量PBS溶液勻漿，移動細(xì)胞懸液至離心管，1 000 r/min離心(離心半徑為13.5 cm)5 min后棄置上清液，以PBS溶液沖洗3次，接種細(xì)胞培養(yǎng)至培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；收集對數(shù)生長細(xì)胞，采用RPMI 1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以5×104/mL濃度接種于96孔板，以實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行分組，設(shè)置4個復(fù)孔，相同條件下培養(yǎng)48 h。完成后加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，培養(yǎng)4 h；吸取各孔上清液后加入二甲基亞砜200 μL，震蕩15 min后采用酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD)值(490 nm)，計算抑制率(IR)=(1-陽性孔均值/對照孔均值)×100%。

1.5.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測PCNA、ZNF139、Toll樣受體(TLR)4、髓樣分化因子(MyD88)和核因子κB(NF-κB)的mRNA表達(dá)水平：-80 ℃條件下取腫瘤標(biāo)本加入研磨器，加入Trizol試劑1 mL，冰上快速充分研磨；轉(zhuǎn)移組織勻漿至EP管，靜置15 min后加入氯仿200 μL，震蕩充分混勻后靜置15 min；4 ℃條件下以10 800 r/min離心(離心半徑為13.5 cm)15 min；棄置上清液后加入75%乙醇洗滌，晾干沉淀后加入無RNA酶水溶解沉淀。取適量RNA和上樣緩沖液混合后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(40 mA，80 V)30 min，紫外透射儀下觀察條帶，檢測RNA完整性；吸取樣品1 μL，使用微量核酸蛋白檢測儀檢測濃度和純度，-80 ℃保存。5 μg為總RNA模板，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄體系，合成cDNA，-20 ℃保存；以cDNA為米板，擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為cDNA和上、下游引物1 μL，DEPC水7 μL，綠色體系10 μL。引物序列及PCR反應(yīng)條件如下，(1)PCNA(326 bp)，上游引物為5′-CGTCTGG GCAGTGCGGCTC-3′，下游引物為5′-TGCTC GCCGCAGTAC TGCT-3′；94 ℃、3 min，90 ℃、30 s，55 ℃、50 s，72 ℃、45 s，35個循環(huán)，72 ℃、5 min。(2)ZNF139(482 bp)，上游引物為5′-CCGTCTGCTA GAGTGCGCATG-3′，下游引物為5′-GCTGACTCA GCGCTGACTCCG-3′；94 ℃、3 min，95 ℃、30 s，58 ℃、40 s，72 ℃、30 s，30個循環(huán)，72 ℃、5 min。(3)β-actin(540 bp)，上游引物為5′-GTCCCCGGGG AGGCTA CCA-3′，下游引物為5′-CTCCGGC TTAAAGTGGCAGCCTTCC-3′；94 ℃、5 min，95 ℃、30 s，58 ℃、40 s，72 ℃、30 s，30個循環(huán)，72 ℃、5 min。獲得PCR產(chǎn)物后進(jìn)行凝膠電泳，條件同上，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件掃描灰度值分析mRNA水平。

1.5.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測PCNA、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB相對蛋白表達(dá)水平：-80 ℃條件下取腫瘤標(biāo)本加入RIPA裂解液，冰上充分裂解，4 ℃條件下以12 000 r/min離心(離心半徑為13.5 cm)20 min；取定量上清液，采用BCA法測定蛋白濃度；總蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，每孔加入樣品電泳后將凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉；稀釋蛋白抗體(1∶ 1 000)4 ℃孵育過夜，第2日用TBST沖洗PVDF膜，每次5 min，共3次；加入二抗后室溫孵育1 h，TBST沖洗，每次5 min，共3次；膜上加入ECL顯示液，凝膠成像系統(tǒng)曝光顯色，記錄內(nèi)參條帶和目的條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參分析蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

藥物干預(yù)期間，各組裸鼠均未出現(xiàn)死亡。模型組裸鼠瘤體長勢明顯，進(jìn)水、進(jìn)食均明顯減少，運(yùn)動量減少，精神狀態(tài)差，有嗜睡情況。順鉑組和青蒿琥酯組裸鼠腫瘤生長速度慢于模型組，食欲較好，運(yùn)動量一般，精神狀態(tài)和反應(yīng)能力影響較小，有輕微嗜睡情況。聯(lián)合組裸鼠腫瘤生長速度最低，食欲、運(yùn)動、精神和反應(yīng)能力未見明顯影響。

2.2 病理結(jié)果比較

模型組胃癌細(xì)胞核細(xì)胞核增大、深染，可見明顯的病理性核分裂象和惡性增殖，細(xì)胞量大、生長旺盛，緊密排列；與模型組比較，順鉑組胃癌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，病理性核分裂象和惡性增殖明顯減少，細(xì)胞排列分散，密度明顯較低，可見明顯空泡；青蒿琥酯組胃癌細(xì)胞病理性核分裂象和惡性增殖較模型組明顯減少，細(xì)胞密度高于順鉑組，排列分散;聯(lián)合組胃癌細(xì)胞病理性核分裂象和密度均低于順鉑組和青蒿琥酯組，見圖1。

A.模型組；B.順鉑組；C.青蒿琥酯組；D.聯(lián)合組A. model group; B. cisplatin group; C. artesunate group; D. combination group圖1 病理結(jié)果比較Fig 1 Comparison of pathological results

2.3 移植瘤瘤重及抑瘤率比較

與模型組比較，順鉑組、青蒿琥酯組和聯(lián)合組平均瘤重明顯降低；與順鉑組比較，青蒿琥酯組平均瘤重升高，抑瘤率降低；聯(lián)合組平均瘤重低于順鉑組和青蒿琥酯組，抑瘤率高于順鉑組和青蒿琥酯組，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 四組裸鼠移植瘤瘤重及抑瘤率比較Tab 1 Comparison of tumor weight and tumor inhibition rate among four groups

圖2 治療4周后的裸鼠移植瘤瘤體Fig 3 Transplanted tumor in nude mice after 4 weeks of treatment

2.4 移植瘤細(xì)胞生長抑制率比較

培養(yǎng)48 h后，順鉑組、青蒿琥酯組和聯(lián)合組的OD值均低于模型組；聯(lián)合組的OD值低于順鉑組和青蒿琥酯組，抑制率高于順鉑組和青蒿琥酯組，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 四組移植瘤細(xì)胞生長抑制率比較Tab 2 Comparison of growth inhibition rate of transplanted tumor cells among four groups

2.5 PCNA、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

與模型組比較，順鉑組、青蒿琥酯組和聯(lián)合組PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達(dá)水平均明顯降低；順鉑組PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平低于青蒿琥酯組；聯(lián)合組PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達(dá)水平低于順鉑組和青蒿琥酯組，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.6 PCNA、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較

與模型組比較，順鉑組、青蒿琥酯組和聯(lián)合組PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯降低；順鉑組PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)水平低于青蒿琥酯組；聯(lián)合組PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)水平低于順鉑組和青蒿琥酯組，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖3。

A.模型組；B.順鉑組；C.青蒿琥酯組；D.聯(lián)合組A. model group; B. cisplatin group; C. artesunate group; D. combination group圖3 蛋白電泳圖Fig 3 Protein electrophoresis

3 討論

作為世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素相關(guān)。很多胃癌患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)錯過最佳治療時期，不適用于內(nèi)鏡或手術(shù)治療，主要采取以化療為主的綜合治療方案。對于晚期胃癌的治療，尤其是多線治療時可選擇的藥物并不多，而且不良反應(yīng)大，療效也欠佳[4]。尋找高效、低毒的藥物治療意義重大。

近年來，多種體外研究結(jié)果表明，青蒿琥酯對胃癌細(xì)胞的抑制和殺傷作用較為明顯[5-6]。本研究通過建立人胃癌細(xì)胞株SGC7901裸鼠移植瘤模型，探討青蒿琥酯對于胃癌裸鼠移植瘤生長的影響，并分析其可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，經(jīng)過青蒿琥酯干預(yù)的裸鼠瘤重明顯減輕，抑瘤率和移植瘤細(xì)胞生長抑制率均明顯提高，雖然效果不及順鉑，但也能證實(shí)青蒿琥酯可抑制裸鼠移植瘤生長。通過青蒿琥酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，相較于順鉑單獨(dú)用藥，聯(lián)合用藥能夠更好地抑制腫瘤生長。

TLR是一類天然免疫受體家族，能特異性地識別病原相關(guān)的分析模式，在激活天然免疫的同時能夠調(diào)節(jié)獲得性免疫，被認(rèn)為是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，其相關(guān)的信號通路在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中具有重要的作用[7-8]。相關(guān)研究結(jié)果證實(shí)，TLR4/NF-κB通路相關(guān)分子在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌惡性行為顯著相關(guān)，猜測該通路是促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[9]。MyD88在TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，其在胃癌組織中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。TLR4能通過MyD88激活下游的NF-κB調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子以及IL-8等炎癥因子的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等過程的調(diào)控。本研究中，青蒿琥酯組裸鼠TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平均低于模型組，證實(shí)青蒿琥酯能夠抑制TLR4/NF-κB通路激活。在干預(yù)的三組中，聯(lián)合組TLR4、MyD88和NF-κB mRNA和相對蛋白表達(dá)水平最低，提示青蒿琥酯能夠增強(qiáng)化療藥的效果，其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB通路激活有關(guān)，是治療胃癌的重要方法。

在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，多種基因發(fā)揮著調(diào)控的作用，ZNF家族與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系[10-11]。相關(guān)研究結(jié)果證實(shí)，ZNF139在胃癌組織高表達(dá)，推測其參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及胃癌多藥耐藥的調(diào)控[12-13]。趙群等[14]的研究結(jié)果顯示，胃癌轉(zhuǎn)移過程中ZNF139促進(jìn)MMP-2、MMP-7的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。李振興[15]將重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染至胃癌移植瘤裸鼠腫瘤中，阻斷其表達(dá)后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯的抑制，說明ZNF139在腫瘤增殖中的地位十分重要。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過藥物干預(yù)，腫瘤組織中的ZNF139表達(dá)明顯降低，證實(shí)通過藥物干預(yù)能夠降低腫瘤組織中ZNF的表達(dá)，從而抑制腫瘤增殖，減緩腫瘤生長速度。作為影響腫瘤進(jìn)展速度的重要因素之一，細(xì)胞增殖的無限性是惡性腫瘤的重要特征[16-17]。PCNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為3.6×104，與細(xì)胞DNA合成密切相關(guān)，且表達(dá)水平與DNA合成量變化呈現(xiàn)一致性[18]。測定細(xì)胞內(nèi)PCNA水平可反映細(xì)胞增殖的水平，可作為評價細(xì)胞生長的重要指標(biāo)[19]。有研究結(jié)果證實(shí)，PCNA在癌旁組織中表達(dá)較低，而在惡性腫瘤組織內(nèi)具有高表達(dá)[20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，各干預(yù)組PCNA mRNA水平明顯降低，提示青蒿琥酯可以抑制PCNA基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，影響腫瘤的生長。從聯(lián)合組PCNA mRNA水平顯著低于青蒿琥酯組(P<0.05)也可以看出，青蒿琥酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同趨勢。

綜上所述，青蒿琥酯可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路激活抑制人胃癌腫瘤細(xì)胞的生長，同時能下調(diào)PCNA和ZNF139的表達(dá)，影響腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。