青蒿琥酯通過下調(diào)TRAF6抑制LPS誘導(dǎo)心肌細胞炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的實驗研究

翟曉芳,秦國慶,梁曉清

心肌炎是臨床常見心肌疾病,其癥狀主要有心律失常、急性心功能不全等。研究認為,心肌損傷如心肌細胞過度炎癥反應(yīng)及心肌細胞凋亡等與心肌炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1],抑制心肌損傷對心肌炎的治療尤為重要。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。研究顯示,青蒿琥酯可通過抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)/p65信號通路減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人結(jié)腸上皮細胞炎性損傷,并促進細胞增殖,有望成為治療結(jié)腸炎的藥物[3];青蒿琥酯可通過激活黏附斑激酶/磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(FAK/PI3K/AKT)信號通路對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡發(fā)揮抑制作用,其是治療心肌缺血再灌注的替代藥物[4]。但是,還鮮見青蒿琥酯影響膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷的相關(guān)報道。TRAF6是腫瘤壞死因子受體超家族和白細胞介素-1(IL-1)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵銜接分子,其可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路參與調(diào)控細胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等過程[5]。既往研究顯示,TRAF6參與心肌損傷的發(fā)展進程,過表達miR-506-3p可通過下調(diào)TRAF6抑制心肌組織炎癥反應(yīng)及心肌細胞凋亡,減輕心肌炎性損傷[6]。本研究建立LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞H9c2損傷模型,觀察青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的影響及其能否通過調(diào)控TRAF6發(fā)揮作用,以期為膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

H9c2細胞,上海通派生物科技有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;青蒿琥酯,純度>98%,陜西藤邁生物科技有限責(zé)任公司;DMEM培養(yǎng)液、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白檢測試劑盒和V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;蛋白質(zhì)印跡實驗所需抗體,中國Abcam公司;白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司;TRAF6過表達載體(pcDNA-TRAF6)和空載體(pcDNA),上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

用完全培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9c2細胞。

1.2.2 細胞增殖與活性檢測(CCK-8)法檢測細胞存活率

于96孔板中接種0.2 mL H9c2細胞(5.0×104個/mL),培養(yǎng)4 h。1)分別用含0、0.1、0.2、0.4 mmol/L青蒿琥酯的培養(yǎng)液孵育24 h[3];2)加含1 μg/mL LPS[7]的培養(yǎng)液誘導(dǎo)細胞2 h,并依次記為LPS組、LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組,同時設(shè)置對照組(Con組)常規(guī)培養(yǎng),既不用青蒿琥酯孵育,也不用LPS誘導(dǎo)。各組培養(yǎng)結(jié)束后,向每孔中加10 μL CCK-8,孵育2 h,用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度(A)值。存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細胞(5.0×104個/mL),培養(yǎng)4 h后,按照上述1.2.2中的2)分組處理。各組培養(yǎng)結(jié)束后,收集細胞,用PBS清洗。加500 μL結(jié)合緩沖液,重懸細胞。加10 μL Annexin V-FITC,避光孵育15 min。再加5 μL PI,避光孵育5 min,利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細胞(5.0×104個/mL),培養(yǎng)4 h后,按照上述1.2.2中的2)進行分組處理。各組培養(yǎng)結(jié)束后,收集細胞上清液,3 500 r/min離心10 min。取上清,分別利用IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測其水平。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測TRAF6蛋白表達

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細胞(5.0×104個/mL),培養(yǎng)4 h后,按照上述1.2.2中的2)進行分組處理。各組培養(yǎng)結(jié)束后,將細胞中總蛋白用RIPA試劑提取出來,并檢測蛋白濃度(BCA法)。用SDS-PAGE實驗對總蛋白進行分離,并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4 ℃冰箱中分別用稀釋的TRAF6和GAPDH(內(nèi)參)一抗孵育過夜,稀釋度均為1∶1 000。洗膜,用山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。加顯影液顯影,曝光拍照,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細胞(5.0×104個/mL),培養(yǎng)24 h后,利用LipofectamineTM 2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-TRAF6,轉(zhuǎn)染時間為12 h,蛋白質(zhì)印跡法檢測TRAF6蛋白表達驗證轉(zhuǎn)染效果。于6孔板中接種2.5 mL 轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-TRAF6的H9c2細胞(5.0×104個/mL),按照LPS組處理,記為LPS+pcDNA組、LPS+pcDNA-TRAF6組;按照LPS+高青蒿琥酯劑量組處理,記為LPS+青蒿琥酯+pcDNA組、LPS+青蒿琥酯+pcDNA-TRAF6組。各組細胞處理后,按照上述1.2.3至1.2.5中方法檢測細胞凋亡、炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達及TRAF6蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 青蒿琥酯對心肌細胞H9c2增殖活性的影響

不同劑量(0、0.1、0.2、0.4 mmol/L)青蒿琥酯組H9c2細胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(99.02±1.64)%、(98.78±1.12)%、(99.67±0.33)%,4組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.835,P=0.054)。與0 mmol/L青蒿琥酯組比較,不同劑量(0.1、0.2、0.4 mmol/L)青蒿琥酯組H9c2細胞存活率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明此濃度范圍內(nèi)的青蒿琥酯對H9c2細胞無毒性。

2.2 青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2增殖活性的影響

Con組、LPS組、LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(62.14±1.70)%、(71.75±2.96)%、(80.13±1.69)%、(89.34±2.14)%,組間存活率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=519.352,P<0.05)。LPS組H9c2細胞存活率低于Con組(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細胞存活率均高于LPS組(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細胞存活率兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2凋亡及炎性因子的影響

LPS組H9c2細胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均高于Con組(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均低于LPS組(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組各檢測指標兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

表1 青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡及炎性因子表達的影響(±s)

圖1 青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2凋亡的影響

2.4 青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2中TRAF6蛋白表達的影響

Con組、LPS組、LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細胞中TRAF6蛋白表達量分別為0.12±0.01、0.74±0.06、0.54±0.04、0.34±0.03、0.24±0.02,5組間TRAF6蛋白表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=413.727,P<0.05)。LPS組H9c2細胞中TRAF6蛋白表達量高于Con組(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細胞中TRAF6蛋白表達量均低于LPS組(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細胞中TRAF6蛋白表達量兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞中TRAF6蛋白表達的影響

2.5 TRAF6轉(zhuǎn)染效率

TRAF6蛋白在轉(zhuǎn)染pcDNA-TRAF6的H9c2細胞中的表達量為0.56±0.05,較轉(zhuǎn)染pcDNA的H9c2細胞中的表達量0.14±0.02升高(t=-23.398,P<0.05),說明轉(zhuǎn)染pcDNA-TRAF6的H9c2細胞中TRAF6較轉(zhuǎn)染pcDNA的細胞上調(diào)。詳見圖3。

圖3 TRAF6蛋白表達的檢測

2.6 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2凋亡及炎性因子表達的影響

LPS+pcDNA-TRAF6組H9c2細胞中TRAF6蛋白表達、細胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均高于LPS+pcDNA組(P<0.05)。LPS+青蒿琥酯+pcDNA-TRAF6組H9c2細胞中TRAF6蛋白表達、細胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均高于LPS+青蒿琥酯+pcDNA組(P<0.05)。詳見圖4、圖5及表2。

表2 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)H9c2細胞凋亡及炎性因子表達的影響比較(±s)

圖4 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡的影響

圖5 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)蛋白表達的影響

3 討 論

心肌炎發(fā)生發(fā)展與感染、自身免疫性疾病、物理化學(xué)刺激等多種因素有關(guān)。LPS又被稱為內(nèi)毒素,是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分,其可誘導(dǎo)心肌細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子,產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng),進一步誘導(dǎo)心肌細胞壞死或凋亡,引發(fā)心肌炎[8]。本研究結(jié)果顯示,大鼠心肌細胞H9c2經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量明顯增加,且凋亡率升高,說明LPS誘導(dǎo)H9c2細胞產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)及細胞凋亡,模型建立成功。

青蒿琥酯具有多種藥理活性。研究顯示,青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細胞炎性因子釋放具有顯著抑制作用,這與其抑制細胞中Toll樣受體4(TLR4)通路的活化有關(guān)[9];青蒿琥酯通過激活A(yù)KT/血紅素氧合酶(HO-1)信號通路抑制過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡,提示其具有減輕白內(nèi)障的作用[10];青蒿琥酯可抑制腎缺血再灌注引起的炎性因子釋放及細胞焦亡,減輕腎缺血再灌注損傷[11];青蒿琥酯可抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞炎癥、鐵蓄積和脂質(zhì)過氧化,減輕心肌細胞鐵死亡,并增強細胞活力,緩解細胞損傷,提示青蒿琥酯具有心肌保護作用[12]。本實驗首先觀察到一定濃度范圍的青蒿琥酯對心肌細胞H9c2無毒性,且青蒿琥酯可提高LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞增殖活性,抑制細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子,同時減少細胞凋亡,這一結(jié)果與洪莉莉等[12]研究結(jié)果基本一致,說明青蒿琥酯可抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞炎癥反應(yīng)及細胞凋亡,提示其具有減輕或治療膿毒癥心肌損傷的作用,對心肌損傷具有保護作用。

有研究證實,TRAF6與心肌炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。下調(diào)TRAF6可通過抑制NF-κB通路誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化,從而減輕病毒性心肌炎[14];miR-146a可通過靶向抑制TRAF6并阻礙NF-κB信號通路的激活改善心肌炎[15]。本研究顯示,心肌細胞H9c2經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,細胞中TRAF6蛋白表達增加,而過表達TRAF6促進LPS誘導(dǎo)的心肌細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子,促進細胞凋亡,這提示TRAF6對心肌炎發(fā)生發(fā)展起促進作用。為了探究青蒿琥酯能否通過調(diào)控TRAF6影響LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞炎性因子表達和細胞凋亡,本研究檢測了其對LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞中TRAF6蛋白表達的影響,結(jié)果顯示,青蒿琥酯呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞中TRAF6蛋白表達;同時恢復(fù)實驗結(jié)果顯示,過表達TRAF6逆轉(zhuǎn)了青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞炎性因子及細胞凋亡的抑制作用,這提示青蒿琥酯通過下調(diào)TRAF6來抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞炎性因子表達及細胞凋亡,進而發(fā)揮心肌保護作用。

綜上所述,一定劑量的青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞炎性因子表達及細胞凋亡具有抑制作用,這可能與其下調(diào)了細胞中TRAF6蛋白表達有關(guān),具有治療心肌炎的潛在價值。