基于miR-106b-5p調(diào)控CCND1基因研究幽門螺桿菌促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖的功能機(jī)制

沈曉雯，黃琳玲，蔣林燕，沈紅梅

江蘇省南通市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，早期診斷難度大，容易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，即使接受較為全面的綜合治療，整體預(yù)后仍不佳，很多患者死于局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-2]。食管癌的發(fā)病與遺傳因素、環(huán)境因素、飲食因素等有關(guān)，近些年有學(xué)者提出幽門螺桿菌(Hp)感染可能是食管癌發(fā)病的危險因素，食管癌患者Hp感染率明顯高于慢性食管炎患者及食管不典型增生患者，且Hp感染與食管癌的惡性程度相關(guān)[3-4]。但目前關(guān)于Hp感染是否參與食管癌發(fā)生、發(fā)展尚缺乏細(xì)胞實驗證據(jù)，相關(guān)的分子機(jī)制也不十分清楚。微小核糖核酸(miR)-106b-5p在食管癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，原癌基因細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)是miR-106-5p的潛在靶基因之一[5-7]。一項胃黏膜病變相關(guān)的細(xì)胞實驗證實，Hp脂多糖對miR-106b-5p的表達(dá)具有抑制作用，提示Hp可能削弱miR-106b-5p的抑癌作用，進(jìn)而參與胃癌或食管癌等惡性腫瘤的發(fā)生[8]?；诖?，本研究將以miR-106b-5p/CCND1途徑為切入點，系統(tǒng)探討Hp感染調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，旨在為深入認(rèn)識Hp感染導(dǎo)致食管癌發(fā)病的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年6月至2021年10月在本院手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本46份，標(biāo)本來源患者中男28例，女18例；年齡41～72歲，平均(62.93±11.44)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理檢查診斷為食管癌；(2)按要求留取組織標(biāo)本；(3)未接受過放化療或其他腫瘤相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他惡性腫瘤病史；(2)合并自身免疫性疾病。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，取得患者知情同意。

1.2細(xì)胞株及菌株來源 食管癌TE-1細(xì)胞株(STR鑒定正確，批號C6946)及Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637(批號R4601603)均購自美國菌種保藏中心，Hp菌液的水平為1×108CFU/mL。

1.3儀器與試劑 陰性對照(NC)序列及miR-106b-5p模擬物(序列：5′-TAGACGTGACAGTCGTGAAAT-3′)均購于吉瑪公司(中國)， MTS法細(xì)胞活力檢測試劑盒購于Promega公司(丹麥)，miR提取試劑盒、miR cDNA第一鏈合成試劑盒、miR熒光定量檢測試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司，CCND1、β-actin特異性一抗購于美國CST實業(yè)有限公司。

1.4方法

1.4.1食管癌Hp感染的檢測 取食管癌組織、制作石蠟切片，用快速脲酶法和Warthin-Starry銀染法進(jìn)行Hp檢測，兩種檢測方法均為陽性則判斷為Hp陽性，反之則為Hp陰性。

1.4.2細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) TE-1細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中常規(guī)貼壁培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，擴(kuò)增傳代后進(jìn)行分組干預(yù)，具體如下：對照組用不含菌株和藥物的培養(yǎng)基處理；Hp組在培養(yǎng)基中加入Hp菌液，使細(xì)胞與細(xì)菌比例達(dá)到1∶100；miR-NC組轉(zhuǎn)染NC序列；miR-106b-5p組轉(zhuǎn)染miR-106b-5p模擬物；miR-NC+Hp組轉(zhuǎn)染NC序列的同時在培養(yǎng)基中加入Hp菌液(細(xì)胞與細(xì)菌比例為1∶100)；miR-106b-5p+Hp組轉(zhuǎn)染miR-106b-5p模擬物的同時在培養(yǎng)基中加入Hp菌液(細(xì)胞與細(xì)菌比例為1∶100)。每組均連續(xù)干預(yù)24 h，設(shè)置5次重復(fù)。

1.4.3MTS法檢測細(xì)胞活力 TE-1細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組干預(yù)24 h后采用MTS法進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測，按照試劑盒說明書在每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μL檢測液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在酶標(biāo)儀上檢測吸光度值(A)490。

1.4.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 TE-1細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿內(nèi)，分組干預(yù)24 h后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，取5×105個細(xì)胞與10 μL PI溶液混合，染色后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞周期分析，計算G0/G1期、S期、G2/M期的比例。

1.4.5熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測miR-106b-5p的表達(dá)水平 取食管癌組織及分組干預(yù)24 h后的TE-1細(xì)胞，采用miR提取試劑盒提取組織及細(xì)胞中的miR，采用miR cDNA第一鏈合成試劑盒將miR反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miR熒光定量檢測試劑盒對cDNA中的miR-106b-5p表達(dá)水平進(jìn)行檢測，檢測的體系參照試劑盒進(jìn)行配制，分別使用miR-106b-5p引物(上游引物序列：5′-TATGCGTAGCTTAGCTAT-3′；下游引物為試劑盒內(nèi)通用引物)和U6引物(上游引物序列：5′-ACTATGCTATATGCTAGCT-3′；下游引物序列：5′-TATCGTAGCTAGTATAC-3′)。檢測程序為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃15 s、60 ℃34 s，重復(fù)40個循環(huán)，程序結(jié)束后生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以U6為內(nèi)參，代入2-ΔΔCt計算miR-106b-5p的表達(dá)水平。

1.4.6免疫印跡法檢測CCND1表達(dá)水平 取食管癌組織及分組干預(yù)24 h后的TE-1細(xì)胞，采用免疫印跡法進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測，裂解細(xì)胞得到蛋白后，將蛋白加入到聚丙烯酰胺凝膠中并按照Western blot流程進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗及二抗，最后在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)顯影得到CCND1、β-actin的蛋白條帶，掃描條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算CCND1的表達(dá)水平。

1.4.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-106b-5p靶向CCND1 TE-1細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板內(nèi)，將CCND1的雙熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，然后按照miR-NC組和miR-106b-5p組的干預(yù)方式分別轉(zhuǎn)染NC序列和miR-106b-5p模擬物，48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對細(xì)胞中的螢火蟲熒光活力及海腎熒光活力進(jìn)行檢測，計算報告基因的熒光活力，熒光值=螢火蟲熒光活力/海腎熒光活力。

2 結(jié) 果

2.1Hp陽性及陰性的食管癌組織中miR-106b-5p、CCND1表達(dá)水平的比較 共收集46例食管癌患者食管癌組織，其中Hp陽性33例，Hp陰性13例。Hp陽性患者與Hp陰性患者年齡及性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Hp陽性患者食管癌組織中miR-106b-5p的表達(dá)水平低于Hp陰性患者，CCND1的表達(dá)水平高于Hp陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 Hp陽性及陰性患者一般資料及食管癌組織中miR-106b-5p、CCND1表達(dá)水平比較

圖1 Hp陽性及陰性的食管癌組織中CCND1的

2.2食管癌組織中miR-106b-5p與CCND1表達(dá)水平的相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-106b-5p的表達(dá)水平與CCND1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.414，P=0.004)。

2.3Hp感染對TE-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響 Hp組的A490水平及S期、G2/M期比例高于對照組，G0/G1期比例低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 Hp組與對照組A490與細(xì)胞周期比例比較

注：A為對照組；B為Hp組。

2.4Hp感染對TE-1細(xì)胞中miR-106b-5p、CCND1表達(dá)水平的影響 Hp組TE-1細(xì)胞中miR-106b-5p的表達(dá)水平低于對照組，CCND1的表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 Hp組與對照組TE-1細(xì)胞中miR-106b-5p、CCND1表達(dá)水平比較

圖3 Hp組與對照組TE-1細(xì)胞中CCND1的免疫印跡圖

2.5TE-1細(xì)胞中miR-106b-5p靶向CCND1 miR-106b-5p組TE-1細(xì)胞中野生型CCND1報告基因的熒光值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-106b-5p組TE-1細(xì)胞中突變型CCND1報告基因的熒光值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 miR-106b-5p組與對照組CCND1報告基因熒光值比較

2.6過表達(dá)miR-106b-5p對Hp感染TE-1細(xì)胞中CCND1表達(dá)的影響 miR-NC+Hp組TE-1細(xì)胞中miR-106b-5p的表達(dá)水平低于miR-NC組，CCND1的表達(dá)水平高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-106b-5p+Hp組TE-1細(xì)胞中miR-106b-5p的表達(dá)水平高于miR-NC+Hp組，CCND1的表達(dá)水平低于miR-NC+Hp組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、 圖4。

表5 miR-NC+Hp組、miR-NC組和miR-106b-5p+Hp組 miR-106b-5p、CCND1表達(dá)水平比較

圖4 miR-NC+Hp組、miR-NC組和miR-106b-5p+Hp組CCND1的免疫印跡圖

2.7過表達(dá)miR-106b-5p對Hp感染TE-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響 miR-NC+Hp組TE-1細(xì)胞的A490水平及S期、G2/M期比例高于miR-NC組，G0/G1期比例低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-106b-5p+Hp組TE-1細(xì)胞的A490水平及S期、G2/M期比例低于miR-NC+Hp組，G0/G1期比例高于miR-NC+Hp組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6、圖5。

表6 miR-NC+Hp組、miR-NC組和miR-106b-5p+Hp組A490及細(xì)胞周期比例比較

注：A為miR-NC組;B為miR-NC+Hp組；C為miR-106b-5p+Hp組。

3 討 論

Hp是一種在胃黏膜內(nèi)定植的微需氧革蘭陰性菌，國內(nèi)姜紅梅等[4]和陶茂淮等[3]通過橫斷面研究證實食管癌組織中Hp的感染率高于食管炎組織、食管不典型增生組織，且Hp感染與食管癌的惡性程度有關(guān)。POLYZOS 等[9]及LV等[10]的研究結(jié)果表明Hp感染是食管癌發(fā)病的危險因素之一。DOORAKKERS等[11]通過隊列研究證實根除Hp能明顯降低食管癌的發(fā)病風(fēng)險。以上結(jié)果表明Hp感染與食管癌發(fā)病有關(guān)，但尚缺乏Hp感染促進(jìn)食管癌發(fā)生、發(fā)展的直接細(xì)胞實驗證據(jù)。

胃癌相關(guān)的細(xì)胞實驗研究結(jié)果表明， Hp感染胃癌細(xì)胞或Hp脂多糖刺激胃癌細(xì)胞均可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、加速胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程[12-13]。本研究進(jìn)行了Hp感染食管癌TE-1細(xì)胞的實驗，與未感染Hp的對照組TE-1細(xì)胞比較，Hp組TE-1細(xì)胞的增殖增強(qiáng)，細(xì)胞周期S期、G2/M期比例增加，表明Hp感染促進(jìn)了食管癌細(xì)胞的增殖，同時加速了細(xì)胞周期進(jìn)入S期和G2/M期。在此基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)深入探討Hp感染促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

CCND1是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白，在食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌等消化道惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，且與腫瘤的病理進(jìn)展、預(yù)后不良有關(guān)[14-16]。目前，研究認(rèn)為具有抑癌作用的miR-106b-5p是CCND1潛在的上游調(diào)控分子，食管癌中miR-106b-5p表達(dá)降低會削弱其靶向抑制CCND1表達(dá)的作用，進(jìn)而使CCND1表達(dá)增加、細(xì)胞周期加速、細(xì)胞增殖增強(qiáng)[15]。本研究在手術(shù)切除的食管癌組織中檢測了miR-106b-5p、CCND1的表達(dá)及Hp的感染情況，與Hp陰性食管癌組織比較，Hp陽性食管癌組織中miR-106b-5p的表達(dá)水平降低，CCND1表達(dá)水平增加，且miR-106b-5p與CCND1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明Hp感染可能通過調(diào)控miR-106b-5p/CCND1途徑參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。因此，本研究在細(xì)胞實驗中進(jìn)一步以miR-106b-5p靶向調(diào)控CCND1為基礎(chǔ)，探討Hp感染促進(jìn)食管癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，在Hp感染的食管癌TE-1細(xì)胞中miR-106b-5p的表達(dá)水平降低、CCND1表達(dá)水平增加，與Hp感染的食管癌組織中miR-106b-5p及CCND1的變化趨勢一致。同時本研究還通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-106b-5p組野生型CCND1報告基因的熒光值降低，表明miR-106b-5p直接靶向調(diào)控CCND1，與食管癌組織中miR-106b-5p表達(dá)與CCND1呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果吻合。miR-106b-5p的抑癌作用已經(jīng)在多種惡性腫瘤細(xì)胞中得到證實[17-18]，本研究進(jìn)一步探討了miR-106b-5p在Hp感染促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程中的作用。在Hp感染的同時轉(zhuǎn)染miR-106b-5p的模擬物，逆轉(zhuǎn)Hp抑制miR-106b-5p表達(dá)的作用后，CCND1的表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖減弱，細(xì)胞周期G0/G1期的比例增加，表明過表達(dá)miR-106b-5p削弱了Hp對食管癌細(xì)胞的調(diào)控作用，抑制了細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期并下調(diào)CCND1的表達(dá)水平。這也提示Hp感染對食管癌細(xì)胞的調(diào)控作用與其調(diào)節(jié)miR-106b-5p及CCND1的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，Hp感染食管癌細(xì)胞后促進(jìn)細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞周期，這一作用與調(diào)控miR-106b-5p/CCND1途徑有關(guān)。Hp感染能夠抑制miR-106b-5p表達(dá)，削弱miR-106b-5p對CCND1的靶向抑制作用，進(jìn)而使CCND1表達(dá)增加、細(xì)胞周期加速。