鼻咽癌患者癌組織中HDAC1、HDAC7表達(dá)與臨床、病理特征及預(yù)后的關(guān)系

王淑云，盧雅艷，李 佳

中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心耳鼻喉科，北京 100161

鼻咽癌是源于咽部上部區(qū)域的惡性腫瘤，全球每年約有10萬(wàn)例鼻咽癌確診病例，其中大部分病例發(fā)生在我國(guó)，以及南亞、北非和北極地區(qū)[1-2]。鼻咽癌發(fā)病是多因素作用的結(jié)果，包括EB病毒感染、遺傳易感性、不健康的生活方式和環(huán)境危害(如吸煙和接觸灰塵污染)等[3-4]。盡管近年來(lái)對(duì)鼻咽癌的治療取得了較大進(jìn)步，然而大多數(shù)鼻咽癌患者因癥狀無(wú)特異性，往往被診斷時(shí)已至中晚期，已出現(xiàn)腫瘤侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[5]。因此，探索能夠診治鼻咽癌的有效生物標(biāo)志物對(duì)提高患者早期診斷率、改善患者預(yù)后意義重大。組蛋白去乙?；?HDAC)是一類細(xì)胞內(nèi)的金屬蛋白酶，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用，可影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[6]。在雌激素受體(ER)陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系中沉默HDAC1會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[7]。HDAC1在卵巢癌患者的血清中明顯升高，建議將HDAC1作為診斷卵巢癌的血清生物標(biāo)志物[8]。HDAC7在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等[9]。目前，在肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤中觀察到HDAC1、HDAC7的異常表達(dá)[10]。然而，目前鮮有關(guān)于HDAC1、HDAC7在鼻咽癌患者中表達(dá)的研究報(bào)道。因此，本研究擬探討鼻咽癌患者癌組織中HDAC1、HDAC7表達(dá)水平及其與臨床、病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為鼻咽癌的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月本院收治的鼻咽癌患者102例為研究對(duì)象，其中男50例，女52例；年齡38～72歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理檢查確診為鼻咽癌；(2)所有鼻咽癌患者在最初活檢時(shí)未接受過(guò)放療或化療；(3)臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床信息不完整；(2)隨訪失敗或死亡原因不明；(3)合并其他腫瘤；(4)合并嚴(yán)重心血管疾??；(5)妊娠期女性。對(duì)102例鼻咽癌患者均連續(xù)隨訪至2021年1月。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的鼻咽癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，所有患者都具有明確的鼻咽癌組織學(xué)診斷依據(jù)。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)第8版鼻咽癌TNM分期系統(tǒng)(2017)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行分期?；颊呒凹覍倭私獗狙芯?，并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集所有研究對(duì)象癌組織及癌旁組織，分別納入鼻咽癌組與癌旁組。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HDAC1、HDAC7表達(dá) 通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌患者癌組織及癌旁組織中HDAC1、HDAC7的表達(dá)水平。石蠟切片脫蠟(10 min)，乙醇脫水(濃度順序依次為100%、95%和75%)，并用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。將組織與3%H2O2一起孵育(20 min，室溫)以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，蒸餾水洗滌(5 min)。將切片置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值為6)中進(jìn)行抗原修復(fù)，95～100 ℃下加熱10 min，然后用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(5 min)。將切片在室溫下轉(zhuǎn)移到抗原中修復(fù)10 min，采用聚丁二酸丁二醇酯(3 min)洗滌。在室溫下與10%牛血清清蛋白孵育(20～30 min)后，將組織與50 μL小鼠抗人HDAC1、HDAC7抗體(1∶5 000、1∶2 000，Boster，中國(guó)，批號(hào)：652414、741659)在4 ℃下孵育過(guò)夜。用聚丁二酸丁二醇酯作為陰性對(duì)照，然后在37 ℃下復(fù)溫30 min，用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。每張切片用50 μL生物素偶聯(lián)的二抗在37 ℃下孵育30 min，然后用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。將鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶加入切片，在37 ℃下孵育30 min，并用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(4 min)。組織在室溫下用二氨基聯(lián)苯胺溶液染色，然后在控制染色時(shí)間的顯微鏡下觀察。隨后，用蒸餾水終止相應(yīng)的反應(yīng)。蘇木精用于復(fù)染，然后用蒸餾水洗滌切片。用稀鹽酸清洗染色切片表面，用自來(lái)水沖洗3 min。脫水后依次進(jìn)行二甲苯透明和中性膠封片，顯微鏡下觀察切片。

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)師采用雙盲法確認(rèn)。HDAC1、HDAC7的表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞質(zhì)中，鼻咽癌組織細(xì)胞HDAC1、HDAC7免疫組織化學(xué)法染色后細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)褐色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。從染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比兩個(gè)方面判定染色指數(shù)(SI)。染色強(qiáng)度：無(wú)明顯染色計(jì)0分，有淡黃色染色計(jì)1分，有棕黃色染色計(jì)2分，有棕褐色染色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞占比<34%計(jì)1分，34%～<68%計(jì)2分，≥68%計(jì)3分。SI：SI=染色強(qiáng)度得分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分，SI≥5分為陽(yáng)性表達(dá)，SI<5分為陰性表達(dá)。

1.2.3隨訪 術(shù)后每3個(gè)月通過(guò)電話和問(wèn)卷調(diào)查信對(duì)患者進(jìn)行隨訪。從最初的手術(shù)日期到死亡日期為總生存期。通過(guò)家庭報(bào)告確定患者的死亡，并通過(guò)查閱公共記錄進(jìn)行核實(shí)。所有患者出院后均隨訪3年或直至患者死亡。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，HDAC1、HDAC7在組織中的表達(dá)采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用多因素Cox回歸模型探討影響鼻咽癌預(yù)后的相關(guān)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1癌旁組、鼻咽癌組中HDAC1、HDAC7表達(dá)情況比較 鼻咽癌組HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率高于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2不同特征鼻咽癌患者的 HDAC1、HDAC7表達(dá)情況比較 不同性別、年齡鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率明顯高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3鼻咽癌患者預(yù)后情況 102例鼻咽癌患者出院至隨訪結(jié)束，3年生存率為60.8%(62/102)。HDAC1陽(yáng)性和陰性患者3年總生存率分別為45.7%(32/70)和93.8%(30/32)，而HDAC7陽(yáng)性和陰性患者3年總生存率分別為51.4%(38/74)和85.7%(24/28)；HDAC1、HDAC7陽(yáng)性的鼻咽癌患者3年生存率均明顯低于HDAC1、HDAC7陰性的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 癌旁組、鼻咽癌組中HDAC1、HDAC7表達(dá)情況比較[n(%),n=102]

表2 HDAC1、HDAC7表達(dá)與鼻咽癌臨床、病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4影響鼻咽癌患者預(yù)后的單因素分析 腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者3年生存率明顯低于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5影響鼻咽癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、分化程度低、HDAC1陽(yáng)性、HDAC7陽(yáng)性是鼻咽癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 影響鼻咽癌患者預(yù)后的單因素分析[n(%)]

表4 影響鼻咽癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)耳鼻咽喉科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其治療失敗的主要因素。早期預(yù)測(cè)鼻咽癌預(yù)后需要一種特異度及靈敏度高，且成本效益高的新型血清蛋白生物標(biāo)志物，以減少鼻咽癌治療失敗。由BRLF1編碼的Rta蛋白(一種轉(zhuǎn)錄激活因子)是EB病毒早期裂解的產(chǎn)物，是調(diào)節(jié)EB病毒感染從潛伏期到裂解階段變化的關(guān)鍵因素，因此被提出作為診斷鼻咽癌的分子生物標(biāo)志物。此外，微小RNA(miR)-10b和miR-34也是用于鼻咽癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在新型核酸標(biāo)志物。然而，這些標(biāo)志物不能用于預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

HDAC1、HDAC7在許多生理、病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞分化、基因表達(dá)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老、程序性細(xì)胞死亡和致癌過(guò)程。GUO等[11]的研究證實(shí)HDAC1、HDAC7參與致癌、血管生成、細(xì)胞增殖和侵襲過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。另外，ISHIKAWA等[12]也證實(shí)腫瘤的許多生理、病理過(guò)程與HDAC1、HDAC7相關(guān)，如腫瘤的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、耐藥性等，并且HDAC1、HDAC7還參與癌基因激活和抑癌基因失活。另有研究已在各種腫瘤中檢測(cè)到HDAC1、HDAC7的異常表達(dá)，包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和食管癌[13]。既往研究表明，HDAC1、HDAC7的表達(dá)升高可抑制細(xì)胞凋亡，與星形細(xì)胞瘤患者預(yù)后不良關(guān)系密切[14]。HDAC1、HDAC7陽(yáng)性表達(dá)與ER/孕激素受體表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可預(yù)測(cè)浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌的不良預(yù)后[15]。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌組HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率高于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率明顯高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明HDAC1、HDAC7與鼻咽癌臨床、病理特征有關(guān)。

HDAC1、HDAC7是反映癌癥發(fā)生和某些癌癥侵襲性的生物標(biāo)志物。據(jù)報(bào)道，與正常大腸黏膜組織相比，大腸腺癌組織中HDAC1、HDAC7過(guò)度表達(dá)，HDAC1、HDAC7在上皮和固有層中均被發(fā)現(xiàn)，HDAC1、HDAC7也被證實(shí)與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[16]。在機(jī)制方面，HDAC1、HDAC7可以增加抗凋亡Bcl-xl和Bcl-2的表達(dá)豐度，并降低促凋亡Bax蛋白水平[17]。HDAC1、HDAC7還被證明在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，可能作為預(yù)后不良的標(biāo)志物，靶向降低HDAC1、HDAC7表達(dá)水平可能是腫瘤的一種治療方法[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1、HDAC7陽(yáng)性的鼻咽癌患者3年生存率均明顯降低(P<0.05)。且鼻咽癌患者預(yù)后的單因素分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者3年生存率明顯低于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HDAC1、HDAC7陽(yáng)性是鼻咽癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。臨床研究表明，HDAC1、HDAC7結(jié)合癌胚抗原和糖類抗原19-9可用于結(jié)直腸癌早期診斷[20]，本研究未探討HDAC1、HDAC7對(duì)鼻咽癌的診斷效能，這將在后續(xù)研究中進(jìn)行。

綜上所述，鼻咽癌患者癌組織中HDAC1、HDAC7高表達(dá)，其與臨床、病理特征有關(guān)，HDAC1、HDAC7陽(yáng)性是鼻咽癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。