2型糖尿病伴慢性牙周炎患者血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平及臨床研究

劉昭娜，高惠紅,武鴻毅，方 曉△

北京市隆福醫(yī)院:1.口腔科;2.檢驗(yàn)科，北京 100010

糖尿病屬于自身免疫性代謝性疾病，其中2型糖尿病發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)為胰島素抵抗，進(jìn)一步研究顯示，免疫調(diào)節(jié)異?？赡茉?型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。牙周疾病與糖尿病存在著密切的聯(lián)系，二者間的雙向作用是近些年學(xué)者們研究熱點(diǎn)[3]。研究表明，糖尿病患者較非糖尿病患者更容易出現(xiàn)牙周炎[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA MIR155宿主基因(LncRNA MIR155HG)是miR-155的宿主基因，長(zhǎng)度為1 500 bp，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[5]。唐敏等[6]研究顯示，LncRNA MIR155HG在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中高表達(dá)，且與其疾病活動(dòng)度有關(guān)，可能誘發(fā)炎癥。為明確LncRNA MIR155HG、miR-155與慢性牙周炎(CP)及2型糖尿病伴慢性牙周炎(DMCP)的關(guān)系，本研究擬探討血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平與CP相關(guān)臨床指標(biāo)的相關(guān)性，以及二者對(duì)DMCP的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2020年1月至2021年10月收治的42例DMCP患者為DMCP組，年齡36～72歲；選取46例單純CP患者作為CP組，年齡33～74歲；選取48例同期健康志愿者作為正常對(duì)照(NC)組，年齡34～72歲。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①2型糖尿病患者均符合《2型糖尿病基層診療指南(實(shí)踐版·2019)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，CP患者符合《牙周病學(xué)》(第四版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②入組前未進(jìn)行過CP相關(guān)治療；③近期體質(zhì)量穩(wěn)定，且無酗酒、吸煙等不良嗜好。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①有重要臟器功能障礙及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病或代謝疾??；②侵襲性牙周炎；③有過敏史；④處于哺乳期或妊娠期女性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有研究對(duì)象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集 收集所有研究對(duì)象性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、空腹血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、探診深度、附著喪失、牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)等資料。

1.2.2標(biāo)本采集 血清標(biāo)本采集：研究對(duì)象空腹12 h后，抽取次日晨起外周靜脈血，以3 000 r/min離心10 min后收集上層血清，凍存于—80 ℃冰箱中待測(cè)。齦溝液標(biāo)本采集：將濾紙條放入干凈、無菌的離心管內(nèi)并分別編號(hào)，用電子天平將帶有編號(hào)的離心管稱重并記錄重量；取樣前囑患者清水漱口，無菌干棉球嚴(yán)格隔濕取樣位點(diǎn)，探針掛出牙面菌斑，使用氣槍吹干牙齒表面，將稱重后的濾紙條輕輕插入牙齦下，停留30 s后取出，檢查濾紙條(帶血或被唾液污染者棄去)，浸泡于鹽酸緩沖液中，30 min后3 000 r/min離心10 min，洗脫液為齦溝液標(biāo)本，凍存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.2.3血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平檢測(cè) 采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取血清及齦溝液總RNA，測(cè)定純度及濃度后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR，CFX384型qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司)檢測(cè)血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平。根據(jù)目的基因LncRNA MIR155HG、miR-155設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)引物(大連寶生物工程有限公司合成)，三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、U6作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。所有待測(cè)標(biāo)本均設(shè)置3個(gè)平行標(biāo)本，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.13組基線資料及臨床指標(biāo)比較 DMCP組、CP組和NC組性別、年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DMCP組空腹血糖、HbA1c、附著喪失高于CP組、NC組，探診深度、牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CP組探診深度、附著喪失、牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.23組血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平比較 DMCP組血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平明顯高于CP組、NC組，CP組血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 3組基線資料及臨床指標(biāo)比較[n(%)或

表3 3組血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平比較

2.3DMCP患者血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DMCP患者血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平與空腹血糖、HbA1c、探診深度、附著喪失、牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4、5。

2.4血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平影響DMCP的Logistic回歸分析 以是否發(fā)生DMCP作為因變量，以血清LncRNA MIR155HG、miR-155及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平升高是DMCP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表6。

表4 DMCP患者血清LncRNA MIR155HG、miR-155 水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

表5 DMCP患者齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155 水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

表6 血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平影響DMCP的Logistic回歸分析

3 討 論

牙周炎是一種慢性炎癥性破壞性疾病，主要發(fā)生于牙周支持組織，是成年人牙齒脫落的重要原因[9]。作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分，炎癥反應(yīng)及相關(guān)細(xì)胞因子在DMCP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[10]。如糖尿病患者血糖控制不佳，會(huì)加重牙周局部炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，致使免疫細(xì)胞功能受損，進(jìn)一步加重牙周組織破壞，削弱牙周損傷組織的修復(fù)能力，進(jìn)而形成惡性循環(huán)[11]。

LncRNA是一類存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的長(zhǎng)度大于200 nt的功能性非編碼RNA分子，在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生普遍轉(zhuǎn)錄[12]。近年來，許多學(xué)者對(duì)LncRNA的功能模式開展了大量研究，其與復(fù)雜疾病間的關(guān)系也受到廣泛關(guān)注[13]。LncRNA MIR155HG是人染色體9p21上的一個(gè)LncRNA，位于INK4基因座，因其為miR-155的宿主基因而得名[14-15]。miR-155可參與巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的活化，在B細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中扮演著重要角色[16]。WU等[17]研究顯示，miR-155在牙周炎患者唾液中高表達(dá)，且與牙周炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。RADOVIC等[18]研究表明，CP患者及DMCP患者miR-155表達(dá)水平上調(diào)，miR-155被認(rèn)為是非糖尿病和2型糖尿病患者牙周炎的新生物標(biāo)志物。

目前，對(duì)LncRNA MIR155HG、miR-155與DMCP患者臨床指標(biāo)及病理發(fā)展的關(guān)系也不明確。本研究結(jié)果顯示，DMCP患者血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平高于單純CP患者，而單純CP患者血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平高于健康志愿者，其中miR-155表達(dá)趨勢(shì)與趙華等[19]研究結(jié)果一致。推測(cè)2型糖尿病患者體內(nèi)血糖異常及體內(nèi)免疫應(yīng)答異常，造成感染的牙周組織周圍炎癥因子聚集，同時(shí)產(chǎn)生許多炎癥介質(zhì)釋放入循環(huán)系統(tǒng)，此時(shí)LncRNA MIR155HG表達(dá)水平升高，LncRNA MIR155HG作為宿主基因可能通過促進(jìn)miR-155表達(dá)上調(diào)，從而在病原體侵犯、破壞機(jī)體牙周組織時(shí)做出快速反應(yīng)，然而其作用機(jī)制及功能仍需進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。此外，本研究結(jié)果顯示，血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155表達(dá)水平與空腹血糖、HbA1c、探診深度、附著喪失、牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)均呈正相關(guān)，與WU等[17]研究結(jié)果部分一致。進(jìn)一步提示LncRNA MIR155HG、miR-155在2型糖尿病患者CP的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要促進(jìn)作用。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平升高是DMCP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。RADOVIC等[18]的研究顯示，miR-155水平升高與牙周炎發(fā)生關(guān)系密切。齦溝液而非血清LncRNA MIR155HG、miR-155升高是DMCP獨(dú)立危險(xiǎn)因素的可能原因?yàn)檠乐芙M織發(fā)生炎癥時(shí)，齦溝液從微小血管滲出，其分泌量立即增加。

綜上所述，DMCP患者血清及齦溝液LncRNA MIR155HG、miR-155水平高于單純CP患者，且二者水平與DMCP患者臨床指標(biāo)有關(guān)。提示LncRNA MIR155HG、miR-155水平與2型糖尿病患者牙周疾病的發(fā)展有關(guān)，臨床中在治療2型糖尿病患者的過程中，要注意控制牙周疾病的發(fā)展。