新型光觸發(fā)一氧化氮供體的設計與合成*

易靜雯，劉艾文，黃 甜，李贇贇，黃 佩，王 芹，李 玟，張晟瑞

(陜西理工大學化學與環(huán)境科學學院，陜西 漢中 723000)

一氧化氮(NO)是由NO聚合酶內源性的合成，廣泛存在于哺乳動物組織和細胞中，它在心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)中都不可或缺[1]。然而，任何事物都具有兩面性，過量的NO會產生毒副作用，從而導致細胞死亡。因此NO的精準釋放和量的控制對于實現(xiàn)其醫(yī)學、藥理作用非常重要[2]。NO供體是一種在生物體內經(jīng)過簡易酶解或其他作用后釋放出NO的化合物，它在儲存、運輸NO的同時能有效地克服它壽命短、半衰期短等缺點，其能夠自發(fā)地或是在施加合適的刺激(即溫度、pH、光)時從特定的分子和大分子支架中釋放NO。其中，光照是一種無創(chuàng)調控NO釋放的手段，具有時空控制和照射波長/強度可調等優(yōu)點[3]。目前，設計一個可以在活細胞中通過光觸發(fā)來精準釋放NO且具有高NO含量的供體仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

近年來，國內外有關課題組設計合成了多種NO供體。例如，Zhang等[4]開發(fā)了一種由上轉換納米粒子(UCNPs)作為光響應核，介孔二氧化硅作為光敏劑構建的納米平臺，由近紅外光響應，按需釋放NO治療和光動力療法，用于協(xié)同治療難治性角膜炎。該供體在808 nm的近紅外光照射后，核殼結構的納米平臺將近紅外光子轉換為紫外光，以觸發(fā)基于7-氨基-4-甲基香豆素的NO供體釋放NO。Shen等[5]開發(fā)了一種可以在體外根除銅綠假單胞菌生物膜，并在體內治療皮膚膿腫的NO供體。該供體以香豆素為熒光團，在鈀(II)四苯基四苯并卟啉的存在下，可以在630或700 nm的深紅光照射下激活328 nm處具有最大吸光度的NO供體，從而通過光解催化并以8%的光解量子產率釋放NO。Sortino等[6]報道了一種通過可見藍光激活的NO供體。該供體以氨基硝基苯并呋喃為顯色骨架，在溶液中以0.15的量子產率釋放NO，釋放前后發(fā)色部分的熒光發(fā)射的對比大于10，容易實時且定量的釋放NO。Parisi等[7]設計并合成了一種靶向DNA釋放NO的供體。該供體將吖啶橙通過烷基間隔基與N-亞硝基苯胺衍生物共價連接。僅在綠光刺激下釋放NO，在黑暗中停止，并在綠光再次打開時重新開始。其中，吖啶橙部分的通過外部和部分插入方式與DNA結合，這種與生物聚合物的雙模結合作用允許NO在DNA附近以以自由分子類似的效率生成。Shen等[8]合成了一種水溶性的熒光NO供體。568 nm處紅色熒光隨著525 nm的照射而增加，該供體以羅丹明作為熒光團，引入N-亞硝基作為NO釋放單元，親水嗎啉基團不僅提高了NO供體的水溶性，還作為定位基團可靶向定位溶酶體。這為了解溶酶體中NO的生物學效應提供了良好的平臺。

氨基喹啉因為具有獨特的共軛結構以及光學特性，使得大部分氨基喹啉類衍生物的溶液都能表現(xiàn)出比較強的熒光。同時含有氨基和三氟甲基的喹啉具有強的分子內電荷轉移熒光，并具有大的斯托克斯位移?；谝陨?，本文以7-氨基-4-(對甲苯基)-2-(三氟甲基)喹啉為熒光團，設計合成了N-亞硝基化的新型NO供體TQ-NO。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

熒光分光光度計(F-4600)，日本日立公司；紫外分光光度計(UV-2600)，日本島津公司；型手持紫外檢測燈(F-7A)，上海光豪分析儀器有限公司；核磁共振波譜儀(600 MHz)，德國布魯克公司；質譜儀(micrOTOF-QⅡ型)，德國布魯克公司。

4,4,4-三氟-1-(4-甲苯基)-1,3-丁二酮(5 g)，阿拉丁公司，其它化學試劑均為AR試劑。

1.2 供體TQ-NO的合成

圖1 TQ-NO的合成路線Fig.1 Synthesis route of TQ-NO

熒光團AQ的合成[9]：合成路線如圖1所示，取間苯二胺(0.5 g，4.63 mmol)、4,4,4-三氟-1-(4-甲苯基)-1,3-丁二酮(1.0 g，4.63 mmol)溶于15 mL的CHCl3中，80 ℃下冷凝回流36 h后蒸發(fā)濃縮得到粗品。用氯仿重結晶后，用石油醚:乙酸乙酯:甲醇=20:1:1為洗脫劑柱層析分離純化得到黃綠色固體AQ。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ(ppm) 8.04 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.93～7.91 (m, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.35～7.33 (m, 3H), 7.06～7.04 (m, 1H), 4.16 (s, 2H), 2.43 (s, 3H). HRMS:m/zcalcd for C17H13F3N2[M+H]+: 303.11017; found: 303.11036。

TQ的合成[10]：合成路線如圖1所示，取AQ(0.64 g，2.12 mmol)、K2CO3(0.4 g)和NaI(0.04 g)溶于20 mL的無水乙腈中，常溫攪拌15 min后加入7 mL溴乙酸叔丁酯，82 ℃下冷凝回流54 h后使用60 mL乙酸乙酯、水進行萃取/反萃取3次，以石油醚:乙酸乙酯:甲醇=20:1:1為洗脫劑，柱層析法分離純化得到亮黃色固體TQ。1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ(ppm)8.04(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.90(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.34(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.16 (s, 1H), 7.04～7.06(m, 1H), 4.84(s, 1H), 3.97(d,J=4.5 Hz, 2H), 2.44(s, 3H), 1.53 (s, 9H). HRMS:m/zcalcd for C23H23F3N2O2[M+H]+: 417.17847; found: 417.17844。

TQ-NO的合成[11]：合成路線如圖1，取TQ(0.5 g，1.2 mmol)溶于25 mL乙酸中，避光條件下少量多次加入NaNO2固體。在冰水浴中攪拌6 h后加入15 mL蒸餾水，避光條件下抽濾并將沉淀用水洗滌三次，以石油醚:乙酸乙酯:甲醇=100:1:1為洗脫劑，柱層析法分離純化得到亮黃色固體TQ-NO。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ(ppm) 8.24 (d,J=9.11, 1.4 Hz, H), 8.19～8.15 (m, 2H), 8.13～8.07 (m, 3H), 7.41～7.34 (m, 2H), 4.75 (s, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.47 (s, 9H). HRMS:m/zcalcd for C23H22F3N3O3[M+H]+: 445.16477; found: 446.16556。

1.3 實驗方法

將一定量的TQ-NO溶于二甲基亞砜中作儲備液(1 mmol/L)。在10 mL比色管中依次加入500 μL的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)、100 μL儲備液，用水定容至5 mL，搖勻后取部分于比色皿中測定其紫外吸收及熒光發(fā)射(激發(fā)波長為360 nm)。然后用365 nm的便攜式紫外燈照射比色皿，間隔一定時間測量數(shù)次。激發(fā)/發(fā)射狹縫為5.0 nm/5.0 nm。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜的變化

光控NO供體經(jīng)光觸發(fā)后裂解，釋放出NO，熒光恢復。圖2是TQ-NO釋放NO的路徑示意圖。圖3為光誘導TQ-NO釋放NO的熒光發(fā)射譜圖。照射前，熒光信號十分弱，在365 nm紫外燈照射后，431 nm處的熒光信號隨著照射時間增加而逐漸升高(圖3a)，在40 min后趨于穩(wěn)定(圖3b)。

圖2 TQ-NO釋放NO的示意圖Fig.2 Schematic diagram of NO release from TQ-NO

圖3 365 nm 紫外光照射后TQ-NO的熒光發(fā)射(a)及動力學(b)譜圖Fig.3 Fluorescence emission (a) and kinetic(b) spectra of TQ-NO after UV irradiation at 365 nm

2.2 吸收光譜的變化

圖4為TQ-NO釋放NO的紫外吸收譜。供體TQ-NO的最大吸收在285 nm處，隨著365 nm紫外光持續(xù)照射，285 nm以及366 nm處的吸收值都逐漸降低(圖4a)，在40 min左右達到穩(wěn)定(圖4b)，與熒光發(fā)射光譜所得到的結果一致。

圖4 365 nm 紫外光照射后TQ-NO的吸收(a)及動力學(b)譜圖Fig.4 Absorption (a) and kinetic(b) spectra of TQ-NO after UV irradiation at 365 nm

2.3 干擾性能測試

供體TQ-NO溶液中加入不同干擾離子后，熒光強度隨時間的變化，如圖5所示(測量時干擾離子濃度均為0.25 mmol/L)。結果表明，一些還原性物質可以加快供體釋放NO的速率，其中，加入亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉后最為明顯。

圖5 加入不同離子后溶液熒光強度變化圖Fig.5 Fluorescence intensity change diagram of solution with different ions

3 結 論

本文設計合成了一個新型光控NO供體TQ-NO。該供體由7-氨基-4-(對甲苯基)-2-(三氟甲基)喹啉為熒光團，具有良好的熒光性能。TQ-NO本身無熒光信號，在365 nm的紫外光照射下快速釋放出NO，同時熒光信號增強，可通過熒光信號的變化去實時監(jiān)測NO的釋放量。與已有的NO供體相比，TQ-NO具有良好的光控性和抗干擾性等優(yōu)點。