香菇多糖通過(guò)調(diào)控miR-221表達(dá)對(duì)肺結(jié)核大鼠巨噬細(xì)胞凋亡的影響*

沈凌筠，李莉，王戈，曾海燕，駱鵬舉，朱興玉

（1.云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心/昆明市第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650000）

結(jié)核分枝桿菌作為一種寄生菌，在機(jī)體中不能單獨(dú)存活，需寄生在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)侵染肺臟時(shí)，可造成患者胸悶氣短、喘息咳嗽、低熱盜汗、消瘦乏力等癥狀，胸片上可見(jiàn)結(jié)核空洞或斑片狀陰影，極大影響患者正常工作、生活[1-3]。結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入肺臟，寄生在巨噬細(xì)胞中，可導(dǎo)致其凋亡，釋放出寄居的結(jié)核桿菌，增強(qiáng)肺部感染。結(jié)核分枝桿菌還能激活周?chē)幢患纳木奘杉?xì)胞，促進(jìn)氧自由基及多種炎癥因子產(chǎn)生，引發(fā)肺組織炎癥與過(guò)氧化損傷，使巨噬細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增強(qiáng)，加重肺損傷，因而降低巨噬細(xì)胞凋亡對(duì)肺結(jié)核的防治至關(guān)重要[4-5]。香菇多糖是自香菇子實(shí)體中分離出的一種葡聚糖，具有明顯的抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒等作用，能明顯抑制脂多糖刺激的NLRP3炎性信號(hào)激活，下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，緩解腸道損傷，還可顯著降低非小細(xì)胞肺癌合并肺結(jié)核患者血清炎癥因子水平，增強(qiáng)其機(jī)體免疫力，提高療效[6-7]。由此可推測(cè)，香菇多糖可能抑制肺結(jié)核大鼠巨噬細(xì)胞的凋亡。miR-221是診斷結(jié)核病的一種生物標(biāo)志物，參與介導(dǎo)肺結(jié)核、急性肺損傷等肺部疾病的發(fā)病過(guò)程，降低miR-221的表達(dá)，可顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥，抑制肺細(xì)胞凋亡，改善肺組織損傷[8-9]。因此，miR-221可作為緩解肺結(jié)核大鼠巨噬細(xì)胞凋亡的潛在作用靶點(diǎn)。本研究以尾靜脈注射結(jié)核分枝桿菌懸液的方法建立肺結(jié)核大鼠模型，探討香菇多糖通過(guò)調(diào)控miR-221表達(dá)對(duì)肺結(jié)核大鼠巨噬細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量190～210 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003，在通風(fēng)良好的動(dòng)物房中飼養(yǎng)，溫度設(shè)為25 ℃、濕度設(shè)為54%，照明以12 h/12 h明暗交替循環(huán)，大鼠自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵循3R原則。

1.2 藥物與試劑 結(jié)核分枝桿菌H37Rv（批號(hào)：19080311）購(gòu)自中國(guó)藥品與生物制品鑒定所；分枝桿菌即用型液體培養(yǎng)基（批號(hào)：GOMY0019）購(gòu)自上海晶諾生物科技有限公司；香菇多糖（HPLC≥98%，批號(hào)：XY24117）購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；含瓊脂斜面培養(yǎng)基（批號(hào)：SY0498）購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；DMEM（含雙抗）培養(yǎng)基（批號(hào)：12100）、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：CA1410）、ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：CA1020）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：BC0025）、總RNA提取試劑盒（批號(hào)：R1200）、HE染色試劑盒（批號(hào)：G1120）、一步法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（批號(hào)：T2210）、高效RIPA裂解液（批號(hào)：R0010）、大鼠白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：SEKR-0007）、大鼠白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：SEKR-0005）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：PC0020）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔源Anti-Caspase-9一抗（批號(hào)：ab185719）、兔源Anti-GAPDH一抗（批號(hào)：ab181602）、兔源Anti-Bax一抗（批號(hào)：ab32503）、羊抗兔二抗（批號(hào)：ab150077）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 主要儀器 ZX-400型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（杭州澤析生物科技有限公司）；XElx800型酶標(biāo)儀（珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司）；ASP300S型全封閉式組織脫水機(jī)、RM2035型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、EG1160型包埋機(jī)、DCM8型光學(xué)顯微鏡均購(gòu)自德國(guó)Leica公司；ZE5型流式細(xì)胞儀、1659001型蛋白電泳儀、CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Trans-Blot Turbo型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDoc XRS型凝膠成像儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 造模與分組 參照文獻(xiàn)[10]制備肺結(jié)核模型大鼠，將購(gòu)買(mǎi)的結(jié)核分枝桿菌置于0.9%NaCl溶液中，制備細(xì)菌懸液，接種在液體培養(yǎng)基中，于37.5 ℃條件下培養(yǎng)5周，離心得到細(xì)菌沉淀，以0.9%NaCl溶液制備成質(zhì)量濃度5 mg/mL的懸液，尾靜脈注射0.2 mL構(gòu)建肺結(jié)核模型大鼠。病理組織切片觀察肺部組織有明顯的干酪樣壞死、液化灶等病變提示造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組、miR-221 agomir組、香菇多糖組、香菇多糖+miR-221 agomir組，每組12只，另選12只SD大鼠作為對(duì)照組，尾靜脈注射0.9%NaCl溶液0.2 mL。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 香菇多糖溶于0.9%NaCl溶液，配制為5 mg/mL的香菇多糖[11]藥液，香菇多糖+miR-221 agomir組大鼠參照miR-221 agomir說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn)[9]尾靜脈注射2 mg/kg的miR-221 agomir（2次/周），同時(shí)灌胃10 mL/kg的香菇多糖藥液（1次/d）；香菇多糖組大鼠灌胃10 mL/kg的香菇多糖藥液（1次/d），同時(shí)尾靜脈注射（與miR-221 agomir組相同的方法）等量0.9%NaCl溶液（2次/周）；miR-221 agomir組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠分別尾靜脈注射miR-221 agomir、miR-221 agomir陰性對(duì)照，2 mg/kg，2次/周，同時(shí)灌胃10 mL/kg的0.9%NaCl溶液（1次/d）；對(duì)照組、模型組大鼠灌胃10 mL/kg的0.9%NaCl溶液（1次/d），同時(shí)尾靜脈注射（與miR-221 agomir組相同的方法）等量0.9%NaCl溶液（2次/周）。各組大鼠均給藥干預(yù)2周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)及收集標(biāo)本 各組大鼠于給藥結(jié)束后24h，以乙醚氣體進(jìn)行麻醉，從腹主動(dòng)脈吸出血液1.5mL，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，吸出上清，保存在-80 ℃冰箱。各組隨機(jī)選出6只大鼠斷頭處死，開(kāi)腹取出雙肺，以蒸餾水漂洗左肺，進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片后，得到厚約4 μm的肺組織薄片備用；剪下右肺組織1.2 g（分為0.4 g和0.8 g的兩塊），保存在液氮中；再次剪下右肺組織1.0 g，加入適量0.9%NaCl溶液后以硫酸消化，接種在斜面培養(yǎng)基中，37.5 ℃條件下培養(yǎng)5周，采用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)。

1.6.2 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集支氣管肺泡巨噬細(xì)胞：選1只未做處理的大鼠，以乙醚麻醉后切開(kāi)氣管，采用注射器吸取5 mL 0.9%NaCl溶液注入肺組織，收集肺泡灌洗液，重復(fù)3次，得到的灌洗液于4 ℃下800 r/min離心15 min，以PBS緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀3次后，加入適量DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活情況，活細(xì)胞＞90%，表明大鼠肺泡巨噬細(xì)胞收集成功。

肺泡巨噬細(xì)胞凋亡檢測(cè)：按照上述方法收集各組剩余的6只大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，得到細(xì)胞沉淀后，以PBS緩沖液重懸，參照試劑盒說(shuō)明指導(dǎo)步驟，加入適量ArmexinV-FITC與PI，避光孵育10min，上樣到流式細(xì)胞儀中，檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞凋亡情況。

1.6.3 大鼠肺組織病理變化檢測(cè) 取出“1.6.1”中的肺組織切片，做脫蠟、水化處理后，參照試劑盒說(shuō)明指導(dǎo)步驟，進(jìn)行HE染色，以“1.6.1”中方法再次脫水、透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察著色情況，評(píng)測(cè)各組大鼠肺組織病理形態(tài)，任意選出5個(gè)視野，收集其圖像。

1.6.4 大鼠肺組織ROS、MDA水平與血清IL-6、IL-17水平 取“1.6.1”中凍存在液氮中的0.8 g肺組織，剪為小碎塊后置于適量高效RIPA裂解液中，勻漿后4 ℃下3 000 r/min離心25 min，吸出上清，取出0.12 mL，使用試劑盒參照其說(shuō)明指導(dǎo)步驟，測(cè)量其中ROS、MDA水平。

取“1.6.1”中凍存在-80 ℃的血清提前以冰水浴解凍，使用試劑盒參照其說(shuō)明指導(dǎo)步驟，測(cè)量其中IL-6、IL-17水平。

1.6.5 qRT-PCR法測(cè)定各組大鼠肺組織miR-221表達(dá)水平 取“1.6.1”中凍存在液氮中的0.8 g肺組織，剪為小碎塊后，以試劑盒參照其說(shuō)明指導(dǎo)步驟，提取總RNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以U6作為miR-221的內(nèi)參基因，所得Ct值通過(guò)2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析，得到miR-221的相對(duì)表達(dá)量。miR-221、U6基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列

1.6.6 免疫印記法檢測(cè)各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平 取“1.6.4”中剩余的肺組織蛋白樣品液，使用試劑盒通過(guò)BCA法，參照其說(shuō)明指導(dǎo)步驟測(cè)出蛋白濃度后調(diào)至各組相同，電泳（120 V，75 min）分離蛋白，濕轉(zhuǎn)（40 mA，60 min）轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維膜上，將膜置于5%脫脂奶粉溶液中封閉（37 ℃，2 h），剪下目的蛋白條帶，分別以兔源Anti-Caspase-9一抗、兔源Anti-GAPDH一抗、兔源Anti-Bax一抗孵育（4 ℃，11 h），TBST漂洗3次（5 min/次）后，使用羊抗兔二抗孵育（37 ℃，1.5 h），TBST漂洗3次（5 min/次）后，通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白條帶顯色，采用凝膠成像儀拍照后以Image Lab軟件定量其灰度值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后得出各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)比較 與對(duì)照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)比較（）

表2 各組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)改變情況 對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)無(wú)病理變化；模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)大量結(jié)核結(jié)節(jié)，肺間質(zhì)水腫且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡結(jié)構(gòu)變形，可見(jiàn)壞死細(xì)胞脫落；與模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織上述病理?yè)p傷均明顯減輕，miR-221 agomir組大鼠肺組織上述病理?yè)p傷均明顯加重；與模型組比較，miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織上述病理?yè)p傷無(wú)明顯改變。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE，×200）

2.3 各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡情況比較 與對(duì)照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖2、表3）

表3 各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率比較（）

表3 各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

圖2 各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡情況

2.4 各組大鼠肺組織過(guò)氧化水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織ROS、MDA水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織ROS、MDA水平明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺組織ROS、MDA水平明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織ROS、MDA水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表4）

表4 各組大鼠肺組織ROS、MDA 水平比較（）

表4 各組大鼠肺組織ROS、MDA 水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

2.5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠血清IL-6、IL-17水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠血清IL-6、IL-17水平明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠血清IL-6、IL-17水平明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠血清IL-6、IL-17水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表5）

表5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17 水平比較（，pg/mL）

表5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17 水平比較（，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

2.6 各組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對(duì)照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對(duì)照組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖3、表6～7）

圖3 各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表達(dá)Western blotting圖

表6 各組大鼠肺組織miR-221 表達(dá)水平比較（）

表6 各組大鼠肺組織miR-221 表達(dá)水平比較（）

表7 各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表達(dá)水平比較（）

表7 各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表達(dá)水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

3 討論

相比其他眾多感染性疾病，結(jié)核病的致死率更高。近年來(lái)，我國(guó)肺結(jié)核發(fā)病率有所上升，已成為死亡率最高的傳染性疾病之一，是亟需解決的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[12-13]。在肺結(jié)核的發(fā)生及病情進(jìn)展過(guò)程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮著關(guān)鍵作用，巨噬細(xì)胞可識(shí)別結(jié)核分枝桿菌，激活機(jī)體免疫，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行殺滅。寄生感染肺部巨噬細(xì)胞時(shí)，可極大促使巨噬細(xì)胞凋亡，不僅釋放出大量結(jié)核分枝桿菌，造成擴(kuò)散感染，還可進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎癥與過(guò)氧化反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，加重肺組織病理?yè)p傷，因而抑制巨噬細(xì)胞凋亡，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的清除及肺結(jié)核的防治意義重大[4-5,14-15]。本研究通過(guò)尾靜脈注射結(jié)核分枝桿菌懸液誘導(dǎo)建立肺結(jié)核大鼠模型，結(jié)果顯示，大鼠在注射后，其肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)遭到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)大量結(jié)核結(jié)節(jié)，肺間質(zhì)水腫且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡結(jié)構(gòu)變形，可見(jiàn)壞死細(xì)胞脫落。肺組織中結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)、巨噬細(xì)胞凋亡率、肺組織ROS與MDA水平、血清炎癥因子IL-6與IL-17水平、肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平均明顯升高，表明結(jié)核分枝桿菌可在肺臟中大量增殖擴(kuò)散，促使肺組織中巨噬細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)ROS和促炎因子過(guò)量釋放表達(dá)，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥與過(guò)氧化反應(yīng)，造成嚴(yán)重的肺組織損傷。

香菇多糖是一種具有明顯抗菌消炎作用的天然產(chǎn)物，可通過(guò)下調(diào)NLRP3蛋白表達(dá)抑制脂多糖引發(fā)的腸組織細(xì)胞凋亡，保護(hù)腸道功能，減少小細(xì)胞肺癌合并肺結(jié)核患者炎癥因子表達(dá)，改善其臨床癥狀，還可降低弓形蟲(chóng)感染引發(fā)的氧化應(yīng)激水平，減輕嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞增殖和吞噬能力，提升其免疫力，控制感染性疾病進(jìn)展[6-7,16-17]。本研究以香菇多糖處理肺結(jié)核模型大鼠，可明顯減輕其肺組織病理?yè)p傷，降低結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)、巨噬細(xì)胞凋亡率、肺組織ROS與MDA水平、血清炎癥因子IL-6與IL-17水平、肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平，表明香菇多糖可抑制結(jié)核分枝桿菌在肺組織中的增殖，減輕巨噬細(xì)胞凋亡，減弱結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解肺損傷，證實(shí)了香菇多糖可抑制巨噬細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗結(jié)核功能。

miR-221是抑制調(diào)控炎癥的微小RNA，在肺結(jié)核、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、呼吸道感染等肺臟疾病的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起到重要調(diào)控作用。下調(diào)其表達(dá)，可降低炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，控制炎癥發(fā)生發(fā)展，減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺組織損傷，并抑制支氣管上皮細(xì)胞凋亡，改善哮喘癥狀，緩解肺炎支原體引起的肺部感染[8,18-20]，因而，miR-221是防治肺結(jié)核的重要作用靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，miR-221在肺結(jié)核模型大鼠肺組織中過(guò)表達(dá)，以miR-221 agomir上調(diào)其表達(dá)，可加重大鼠肺組織損傷，升高結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)、巨噬細(xì)胞凋亡率、肺組織ROS與MDA水平、血清炎癥因子IL-6與IL-17水平、肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達(dá)水平，表明miR-221能介導(dǎo)肺結(jié)核大鼠發(fā)病過(guò)程，促使其病情進(jìn)展及巨噬細(xì)胞凋亡。miR-221 agomir可幾乎完全抵消香菇多糖的抗巨噬細(xì)胞凋亡作用，并逆轉(zhuǎn)其抗結(jié)核作用，表明香菇多糖能通過(guò)下調(diào)miR-221表達(dá)來(lái)減輕結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的肺組織嚴(yán)重及過(guò)氧化損傷，并抑制巨噬細(xì)胞凋亡。

綜上所述，香菇多糖可減少ROS與致炎細(xì)胞因子釋放，抑制結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的炎癥及過(guò)氧化反應(yīng)，減弱巨噬細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗結(jié)核病功效，且下調(diào)miR-221表達(dá)是其分子機(jī)制之一。本研究為香菇多糖的抗結(jié)核臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為結(jié)核病患者帶來(lái)了更多的治療策略。