ABCG2過表達促進HDAC泛抑制劑帕比司他治療抵抗

竇永海，高曉麗

（1.天津市永久醫(yī)院，天津 300450；2.天津市第五中心醫(yī)院，天津 300450）

表觀遺傳修飾可在不改變脫氧核糖核酸（DNA）序列的情況下調(diào)節(jié)基因表達方面起著重要作用［1］。最近，許多證據(jù)表明，組蛋白的功能由各種類型的可逆修飾（如甲基化和乙?；┱{(diào)節(jié)，在遺傳信息傳遞和腫瘤進展中至關重要。在這些修飾中，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC）動態(tài)調(diào)控的組蛋白乙?；揎棻徽J為是腫瘤治療的有效靶點［2］。若干HDAC抑制劑已投入臨床使用或正在開發(fā)中，其對HDAC同工酶的親和力各不相同［3］。帕比司他是一種口服的泛HDAC抑制劑，在多種惡性腫瘤中顯示出強大的活性，是目前已知的最強效HDAC抑制劑，目前已被FDA批準用于復發(fā)和難治性多發(fā)性骨髓瘤［4］。

臨床證據(jù)表明，抗腫瘤藥物的效力受到多藥耐藥性（MDR）的限制［5］。藥效學和/或藥代動力學耐藥性可以進一步限制細胞毒性和靶向藥物的效力［6］。分布在某些細胞的脂質(zhì)筏中的ATP結合盒（ABC）轉(zhuǎn)運體，可通過介導抗腫瘤藥物外排，以減少藥物在細胞內(nèi)的蓄積而介導MDR的發(fā)生和發(fā)展［7］。ABC亞家族G成員Ⅱ（ABCG2，乳腺癌抗性蛋白/BCRP）是介導腫瘤細胞MDR發(fā)生發(fā)展的關鍵蛋白［8］，可介導一系列蛋白激酶抑制劑的外排，并且與急性淋巴細胞白血病（ALL）和急性骨髓性白血?。ˋML）患者的耐藥高度相關［9］。本研究主要探究ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白介導帕比司他在腫瘤細胞中耐藥的機制。

1 資料（材料/對象）與方法

1.1 細胞及試劑 親本細胞（NCI-H460、S1、HEK293/pcDNA3.1）及過表達ABCG2的腫瘤MDR細胞（NCI-H460/MX20、S1-M1-80、HEK293/ABCG2）均由美國St.John’s University的Zhe-Sheng Chen教授贈與。帕比司他（批號S1030）、Ko143（批號S7043）、依魯替尼（批號S2680）、尼羅替尼（批號S5205）、拉帕替尼（批號S2111）、厄洛替尼（批號S1023）、紫杉醇（批號S1150）、阿霉素（批號S1208）以及順鉑（批號S1166）購置于美國Selleck公司。牛血清白蛋白（BSA）（批號37525）、特級胎牛血清（FBS）（批號10099）、二甲基亞砜（批號D5879）、DMEM基礎培養(yǎng)基（批號2323405）、青/鏈霉素（批號30-001-CI）以及胰蛋白酶（批號25-051-CI）購置于美國Corning公司。PVDF膜（批號ISEQ00010）以及綠色熒光標記的Goat-anti-mouse IgG抗體（批號A-11029）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。ABCG2單克隆抗體（批號GTX23380）購置于GeneTex公司，DAPI（批號D9542）、MTT（批號M2128）以及BCA蛋白定量試劑盒（批號71285-M）購置于美國Sigma公司。氚標米托蒽醌（批號301739）購置于美國Moravek公司。

1.2 儀器 細胞恒溫CO2培養(yǎng)箱（HERAA cell 150i）以及超凈工作臺（C1112B）購置于美國Sigma公司。全自動酶標儀（I Mark）以及SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳-轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購買于美國Bio-Rad公司。低溫冷凍離心機（5418R）購置于美國Eppendorf公司。倒置熒光顯微鏡（DMI 3000B）購置于瑞士Leica公司。液體閃爍分析儀（Tri Carb 2100TR）購置于美國Packard公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 本研究利用的全部細胞均在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并于含有5%濃度的CO2培養(yǎng)箱以37℃的潮濕溫度培養(yǎng)。NCI-H460/MX20（人非小細胞肺癌耐藥細胞）以及S1-M1-80（人結直腸癌耐藥細胞）為藥物誘導的耐藥細胞，在使用前需要加入相應的抗腫瘤藥物維持其耐藥性。具體方法為，在NCI-H460/MX20細胞中以20 nmol/L的米托蒽醌培養(yǎng)72 h，在S1-M1-80細胞中以80 μmol/L的米托蒽醌培養(yǎng)72 h，并更換無藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)并正常傳代兩周后使用。HEK293/ABCG2（人腎胚細胞）為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染全長ABCG2編碼區(qū)的帶有G418抗性細胞，使用前采用2 mg/ml的G418篩選穩(wěn)定細胞72 h后，更換無藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)并正常傳代兩周后使用。

1.4 基于MTT法的細胞增殖檢測及逆轉(zhuǎn)實驗 顯微鏡下觀察處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，PBS進行清洗，然后加入0.25%胰酶進行消化（37℃培養(yǎng)箱），消化時間根據(jù)細胞特點有些許差別，消化完成后制備單細胞懸液，并利用血球計數(shù)板計數(shù)，規(guī)定細胞密度為3×104個/ml，根據(jù)細胞實際濃度吸取特定體積的細胞懸液，并加入一定體積的培基，吸管吹打混合均勻，吸取200 μl液體加入到96孔板中，并設置空白對照，即不含細胞懸液的培基，并將邊緣孔用PBS填充，細胞鋪板完成后輕輕拍打培養(yǎng)板使細胞懸液均勻分布在孔中，于倒置光學顯微鏡下觀察細胞鋪板密度和細胞狀態(tài)，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)使細胞貼壁。細胞貼壁后，加入按濃度梯度配置好的PBST，以DMSO處理組為對照組，培養(yǎng)72 h。給藥培養(yǎng)72 h后，給藥組和對照組每個孔加20 μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h。經(jīng)過4 h孵育，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，用負壓泵吸去上清液，移液槍吸取100 μl DMSO加入到孔中，并放置于搖床上震蕩混合，使甲瓚充分溶解，溶液呈透明色即可于酶標儀490 nm處檢測OD值。采用Graphpad 7.00軟件計算藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度。針對逆轉(zhuǎn)實驗，按照上述體系，將特定濃度的逆轉(zhuǎn)藥物加入96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，并按照上述步驟進行后續(xù)處理。

1.5 Western blot法評價ABCG2蛋白表達水平 取對數(shù)生長期的NCI-H460/MX20細胞，消化并計數(shù)，并以2×104個/孔的濃度接種于6孔板，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細胞貼壁后，每孔加入2 μl的帕比司他，使其在NCI-H460/MX20細胞藥物終濃度為100 nmol/L，加藥處理不同時間（24、48以及72 h）。處理完成后，取出細胞培養(yǎng)板，將細胞從培養(yǎng)皿底部刮下來，吸管吸取含有細胞的培養(yǎng)液加入到1.5 ml EP管中，放置于低溫離心機中進行離心，并采用冰PBS洗滌細胞，清洗1~2次。將提前配好的細胞裂解液（RAPA∶Cocktail A∶Cocktail B=100∶1∶1）加入到細胞沉淀中裂解細胞，收集裂解組分于離心管中，以14 000 g轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液為總蛋白提取液。采用BCA法進行蛋白定量，按一定比例混勻蛋白原液和超純水，使上樣蛋白量為20 μg，并加入5×SDS上樣緩沖液。在95℃水浴中孵育樣品10 min使其變性。根據(jù)比例配制凝膠，待膠凝后向孔中加入制備好的蛋白樣品和預染marker，進行電泳。電泳完成后，進行轉(zhuǎn)膜，設置轉(zhuǎn)膜條件：電流200 mA，電轉(zhuǎn)2.5 h。結束后，將PVDF膜放在提前用1×TBST緩沖溶液配置好的5%的脫脂牛奶中，于室溫置于低速搖床1 h。牛奶封閉結束。按照抗體說明書配置適當濃度的一抗（抗ABCG2，1∶1 000；抗GAPDH，1∶1 000）。將膜放入雜交帶中，加入一抗稀釋液，封口機封口。放在4℃搖床上，慢搖孵育過夜。一抗孵育結束后，一抗進行回收，使用TBST緩沖液清洗PVDF膜2~3次，每次5 min。孵育二抗1 h（HRP兔抗，1∶2 000），使用TBST緩沖液清洗PVDF膜2~3次，每次5 min。配置ECL顯影液（A液∶B液=1∶1），將配置好的發(fā)光顯影液（ECL）均勻加到目的蛋白條帶上進行顯影拍照。

1.6 免疫熒光法評價ABCG2質(zhì)膜定位 取處于對數(shù)生長周期的NCI-H460/MX20細胞，消化并計數(shù)，并以2×104個/孔的濃度接種于6孔板，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細胞貼壁后，每孔加入2 μl的帕比司他，使細胞藥物終濃度為100 nmol/L，加藥處理不同時間（24、48以及72 h）。實驗同時設置陰性對照組（親本細胞）和模型組（經(jīng)DMSO處理的耐藥細胞）。作用完成后，采用4%多聚甲醛作為固定液，吸取一定體積加入到孔中，固定時間為30 min。固定結束之后，棄去多聚甲醛溶液，用冰PBS洗滌兩次。然后采用0.25%的Triton X-100溶液進行透化，透化時間為5 min，再用PBS清洗液清洗2次。加入5% BSA，在37℃孵箱中進行封閉，時間為1 h。封閉結束之后，加入一定體積按照抗體說明書使用5% BSA配置的一抗稀釋液（抗ABCG2，1∶1 000），于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h并用PBS進行清洗。然后孵育二抗（綠色熒光標記的Goat-anti-mouse IgG，1∶500）。利用抗熒光猝滅封片劑覆蓋板中細胞，并置于倒置熒光顯微鏡下觀察成像。

1.7 以氚標米托蒽醌為探針評價藥物蓄積水平 取處于對數(shù)生長周期的細胞，消化，計數(shù)，并接種于6孔板中（2×104個/孔），轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細胞貼壁后，每孔加入2 μl的帕比司他，使細胞藥物終濃度分別為3 μmol/L和6 μmol/L，加藥處理不同時間（24、48以及72 h）。實驗同時設置加ABCB2特異性逆轉(zhuǎn)劑（Ko 143）陽性對照組，加藥處理2 h。2 h后，向孔中加入氚標米托蒽醌，使其終濃度為10 μmol/L，繼續(xù)處理2 h，然后使用PBS清洗氚標抗腫瘤藥物。同時進行細胞消化操作，收集細胞轉(zhuǎn)移到液體閃爍計數(shù)瓶中，根據(jù)液體閃爍計數(shù)儀的數(shù)值確定藥物的蓄積能力。

1.8 ATPase活性實驗ATP酶檢測緩沖系統(tǒng)中分別加入經(jīng)過預制的ABCG2膜囊泡［10］（總量為10 μg），其中PC組加入0.3 mmol/L的釩酸酯，調(diào)整反應溫度為37℃，作用時間為4 min。加入Mg-ATP（5 mmol/L）促使反應的開始，調(diào)整帕比司他的濃度，范圍在0~40 μmol/L。調(diào)整反應溫度為37℃，作用時間為25 min，加入5% SDS終止反應液使反應停止。于酶標儀600 nm處測量最大吸收OD值繪制相關酶活曲線，ATP酶反應活性為游離的磷酸。

1.9 計算機輔助分子對接評價PBST與ABCG2的潛在結合位點 利用ChemBioDraw Ultra 14.0和AutodockTools軟件評價PBST與ABCG2底物結合空腔的結合。首先導入PBST的分子結構，使用Chem－Bio3D Ultra 14.0模塊轉(zhuǎn)換結構，使其最終為三維結構，并利用MMFF94將力場優(yōu)化。ABCG2的三維結構（PDB ID：6ETI）從RCSB Protein Data Bank（www.rcsb.org）下載得到。ABCG2和帕比司他均使用Autodock－Tools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。分子對接部分，采用Autodock vina 1.1.2軟件進行。根據(jù)ABCG2原配體的位置，確定ABCG2活性位點的坐標為：X-144.124、Y-137.956、Z-145.139。調(diào)整參數(shù)exhaustiveness的值為20。對接結束后，根據(jù)評分結果選取打分值最高的構象，并利用Free Meastro 11.9對結果進行分析。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料結果以±s表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用LSD-t法進行多重比較，采用用χ2檢驗進行組間比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ABCG2過表達細胞對帕比司他耐藥 首先，利用MTT法評價帕比司他在親本細胞以及過表達ABCG2的腫瘤MDR細胞中的增殖抑制活性差異。如圖1A所示，在親本細胞NCI-H460細胞中，帕比司他的IC50值為0.031 μmol/L，僅為其在過表達ABCG2的NCI-H460/MX20細胞中的1/10；同時，在親本細胞S1以及耐藥細胞S1-M1-80中，帕比司他的抗腫瘤活性同樣存在顯著差異，IC50值分別為0.027以及0.605 μmol/L（圖1B），提示ABCG2可能是介導帕比司他耐藥的關鍵蛋白。為了驗證ABCG2在帕比司他耐藥中的重要作用，本研究評價了過表達外源性ABCG2的HEK293細胞對帕比司他抗腫瘤活性的敏感性變化。結果表明，帕比司他在親本細胞HEK293/pcDNA3.1中的抗腫瘤活性顯著低于過表達外源性ABCG2的HEK293細胞（HEK293/ABCG2），提示ABCG2的過表達可介導帕比司他耐藥（圖1C）。

圖1 帕比司他對親本細胞和ABCG2過表達的腫瘤細胞的增殖抑制活性差異

2.2 已報道的ABCG2逆轉(zhuǎn)藥物可逆轉(zhuǎn)帕比司他耐藥 為了進一步明確ABCG2介導帕比司他耐藥的作用，筆者在過表達ABCG2的腫瘤細胞中以帕比司他聯(lián)合應用已報道的ABCG2逆轉(zhuǎn)藥物，評價腫瘤細胞活力。如圖2A所示，已知的ABCG2逆轉(zhuǎn)藥物Ko143（10 μmol/L）、依魯替尼（5 μmol/L）、尼羅替尼（5 μmol/L）、拉帕替尼（5 μmol/L），以及厄洛替尼（5 μmol/L）可顯著降低帕比司他對NCI-H460/MX20細胞的IC50值（n=3，F(xiàn)=197，P＜0.05），但不顯著影響帕比司他對NCI-H460細胞的敏感性（n=3，F(xiàn)=1.031，P=0.312）；此外，在S1-M1-80細胞（ABCG2過表達）中，Ko143等ABCG2抑制劑亦可逆轉(zhuǎn)帕比司他耐藥（n=3，F(xiàn)=132，P＜0.05），同時不顯著影響帕比司他在親本細胞S1中的抗腫瘤活性（n=3，F(xiàn)=0.823，P=0.292）。

圖2 ABCG2抑制劑可逆轉(zhuǎn)帕比司他耐藥

2.3 帕比司他上調(diào)ABCG2蛋白表達水平，但對其質(zhì)膜定位無影響 在低濃度帕比司他處理NCI-H460/MX20細胞后，NCI-H460/MX20細胞中ABCG2的蛋白表達水平較對照組顯著上調(diào)（圖3A），提示帕比司他極有可能是通過上調(diào)ABCG2蛋白表達水平從而增強藥物外排作用的。然而，如圖3B所示，帕比司他并不明顯改變ABCG2的質(zhì)膜定位水平，提示帕比司他并不是通過改變ABCG2質(zhì)膜定位協(xié)同增強其耐藥作用。

圖3 帕比司他上調(diào)ABCG2蛋白表達但不改變質(zhì)膜定位

2.4 帕比司他上調(diào)化療藥物在ABCG2過表達腫瘤細胞中的蓄積水平 本階段研究以氚標抗腫瘤藥物［3H］-米托蒽醌為探針，評價帕比司他對［3H］-米托蒽醌在親本細胞及ABCG2過表達的耐藥細胞中蓄積水平的差異。結果表明，不同濃度的帕比司他并不顯著改變［3H］-米托蒽醌在親本細胞NCI-H460中的蓄積水平（圖4A）；然而，在過表達ABCG2的耐藥細胞NCI-H460/MX20中，帕比司他可顯著上調(diào)［3H］-米托蒽醌的胞內(nèi)蓄積水平，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性特征，且上調(diào)程度接近于陽性對照-ABCG2抑制劑ko143（圖4B）。本結果提示帕比司他極有可能通過與米托蒽醌競爭性結合ABCG2的底物結合活性位點，從而競爭性抑制米托蒽醌的外排，即帕比司他可能呈現(xiàn)為ABCG2的特異性底物特征，從而可被過表達ABCG2的腫瘤細胞逆濃度梯度外排至胞外。

圖4 帕比司他上調(diào)過表達ABCG2的耐藥細胞中氚標米托蒽醌的蓄積水平

2.5 帕比司他上調(diào)ABCG2的ATP酶活性，并與ABCG2底物結合口袋的氨基酸殘基發(fā)生相互作用ATP水解過程可為ABCG2轉(zhuǎn)運體提供能量，以運輸各種內(nèi)源配體和外源藥物。為了進一步評估帕比司他對ABCG2功能的影響，在不同濃度的帕比司他作用下，筆者對從轉(zhuǎn)運體高表達昆蟲細胞獲得的膜蛋白中ABCG2的釩酸鹽敏感ATP酶活性進行評價。結果表明，帕比司他在10 μmol/L范圍內(nèi)對ABCG2轉(zhuǎn)運體顯示出濃度依賴性的激活作用（圖5）。為了進一步探究帕比司他與人源ABCG2蛋白質(zhì)底物結合空腔的潛在相互作用，筆者利用計算機分子對接技術模擬帕比司他與ABCG2的對接情況。ABCG2（PDB ID1：6ETI）與帕比司他的結合位點之間的整體相互作用如圖6A和6B所示。結果表明，帕比司他與ABCG2獲得了較好的結合得分，結合能力為-10.3 kcal/mol。此外，帕比司他通過氫鍵和π-π相互作用在ABCG2的底物結合口袋內(nèi)的氨基酸殘基ASN436、THR436以及PHE439形成相互作用。上述結果表明，帕比司他可以底物形式與ABCG2的底物結合空腔發(fā)生相互作用。

圖5 帕比司他上調(diào)ABCG2的ATP酶活性

圖6 帕比司他和ABCG2底物結合口袋的部分氨基酸發(fā)生相互作用

3 討論

HDAC活性失調(diào)是包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的重要表觀遺傳學特征之一［11］，HDAC也因此被認為是惡性腫瘤的重要表觀遺傳學靶點。近年來，開發(fā)針對HDAC活性的新型抑制劑是靶向藥物開發(fā)的一個重要領域［12］。帕比司他是一種非選擇性口服組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑，是目前已知的體外活性最強的HDAC抑制分子。2015年，F(xiàn)DA批準帕比司他用于復發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤［13］。與此同時，帕比司他也在多種血液和實體腫瘤的聯(lián)合治療中表現(xiàn)出較好的應用前景，大量的臨床試驗相繼開展，如帕比司他與比卡魯胺聯(lián)合可緩解趨勢抵抗前列腺癌對比卡魯胺的耐藥［14］；帕比司他聯(lián)合利妥昔單抗可使部分彌漫性大B淋巴瘤患者臨床獲益等［15］。盡管如此，但臨床上針對帕比司他的潛在治療抵抗機制尚未充分闡明，這給帕比司他的進一步單藥臨床應用帶來了巨大的挑戰(zhàn)。有研究表明，在外周T細胞淋巴瘤中，腫瘤細胞固有凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑在介導帕比司他耐藥方面扮演重要角色，通過與抗凋亡因子的抑制作用相結合，可進一步提高腫瘤細胞對帕比司他治療的敏感性［16］。此外，骨髓瘤細胞中mTOR-CXCR4途徑的過度活化可促進其對帕比司他的治療抵抗，而帕比司他與依維莫司聯(lián)合引用將極大程度上緩解骨髓瘤細胞對帕比司他的耐藥［17］。遺憾的是，迄今為止尚無相關研究明確ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族在帕比司他耐藥過程中扮演的關鍵角色。

作為一種膜蛋白，ABC轉(zhuǎn)運蛋白可以利用ATP水解產(chǎn)生的能量將多種化學物質(zhì)（包括大部分藥物）從胞內(nèi)逆濃度梯度泵出胞外。因此，一種或多種ABC轉(zhuǎn)運蛋白在腫瘤細胞中的過度表達可以顯著降低功能和結構不相關的化療藥物的療效，導致腫瘤細胞出現(xiàn)多藥耐藥（MDR）表型。在眾多與腫瘤MDR表型相關的ABC轉(zhuǎn)運蛋白亞型中，ABCB1和ABCG2是目前有證據(jù)支持其在臨床耐藥性中發(fā)揮作用的兩種ABC轉(zhuǎn)運蛋白。在藥效學角度，ABCB1和ABCG2可以賦予一些最廣泛使用的常規(guī)抗腫瘤藥物以抗性，如蒽環(huán)類藥物、甲氨蝶呤、拓撲替康、SN-38、長春花生物堿以及許多蛋白激酶抑制劑。此外，ABCB1和ABCG2在形成血液-組織屏障部位的細胞中的高表達可以對大多數(shù)藥物在患者體內(nèi)的口服生物利用度、分布、代謝和消除產(chǎn)生重大影響。更重要的是，ABCG2亞型與多發(fā)性骨髓瘤的耐藥高度相關。臨床研究表明，ABCG2在人類骨髓瘤細胞中原發(fā)表達，并且其表達水平可通過其啟動子的甲基化和化療藥物的處理得以強化，進一步促進MDR的發(fā)生［18］。此外，也有大量研究表明，諸如部分microRNA和部分信號轉(zhuǎn)導通路參與到ABCG2的蛋白表達中，促進多發(fā)性骨髓瘤的治療抵抗［19］。因此，闡明ABCG2對于抗多發(fā)性骨髓瘤藥物的影響，對藥物上市后的臨床再評價以及聯(lián)合用藥策略的開發(fā)具有重要意義。

在本研究中，筆者初步發(fā)現(xiàn)帕比司他對過表達ABCG2的腫瘤細胞的增殖抑制活性顯著低于親本細胞，提示ABCG2極有可能是參與帕比司他耐藥的關鍵機制。為了進一步明確ABCG2對于帕比司他耐藥的特異性作用，筆者利用了轉(zhuǎn)染ABCG2全長基因的HEK293細胞驗證上述假設，并且得到了一致結論。迄今已有大量研究報道ABCG2的高效抑制劑，筆者利用無毒性濃度的部分ABCG2抑制劑與帕比司他聯(lián)合應用，評價帕比司他的增殖抑制活性變化。結果表明，包括Ko143在內(nèi)的一系列ABCG2抑制劑均可不同程度上逆轉(zhuǎn)帕比司他在ABCG2過表達腫瘤細胞中的耐藥現(xiàn)象。上述結果明確了ABCG2是介導帕比司他耐藥的關鍵蛋白。

ABCG2在腫瘤細胞中的原發(fā)表達可介導帕比司他耐藥，而帕比司他應用后是否會進一步影響ABCG2的表達水平，進一步誘導耐藥的進展？在以低濃度帕比司他處理NCI-H460/MX20細胞后，ABCG2的蛋白表達水平呈劑量依賴性地上調(diào)，但帕比司他并不影響ABCG2蛋白的質(zhì)膜定位，提示帕比司他是通過提高ABCG2的蛋白表達水平從而推動耐藥的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明，部分化療藥物可刺激ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族啟動子區(qū)域的元件從而誘導ABC轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄激活［20］；此外，部分藥物可能影響泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)的功能，從翻譯后修飾水平抑制ABC轉(zhuǎn)運蛋白的降解，上調(diào)其表達水平［21］。本研究尚未明確帕比司他是否通過上述途徑提高ABCG2的蛋白表達水平，這是本研究的不足之處。

在針對ABCG2介導帕比司他耐藥的機制研究部分，還同時發(fā)現(xiàn)ABCG2可介導帕比司他在腫瘤細胞中的蓄積水平的變化。本部分研究以氚標米托蒽醌為探針，間接探究帕比司他在過表達ABCG2的腫瘤細胞中蓄積水平的改變。結果表明，帕比司他可顯著上調(diào)氚標米托蒽醌在ABCG2高表達腫瘤細胞中的蓄積水平，且與陽性對照藥物Ko143水平相當，提示帕比司他可能為ABCG2的良好底物。此外，帕比司他顯著上調(diào)ABCG2的ATP酶活性，并且在計算機輔助分子對接中，帕比司他分子可以與ABCG2蛋白底物結合空腔的部分氨基酸殘基發(fā)生相互作用，提示ABCG2可以將帕比司他特異性地泵出胞外，促進帕比司他的耐藥發(fā)生和發(fā)展。

帕比司他作為迄今為止最強效的HDAC非選擇性抑制劑，目前已被FDA批準多發(fā)性骨髓瘤的二線用藥，并且在多種血液腫瘤和實體瘤的臨床試驗中表現(xiàn)良好。但其耐藥現(xiàn)象仍是其進一步應用的巨大障礙。本研究明確了ABCG2是介導帕比司他耐藥發(fā)生發(fā)展的關鍵蛋白?；诒狙芯康陌l(fā)現(xiàn)，將為帕比司他的聯(lián)合用藥提供基本的思路，即帕比司他聯(lián)合ABCG2抑制劑（或有ABCG2抑制活性的分子）可能會為帕比司他臨床效果的提高有關鍵作用。誠然，該假設仍需要更多的體內(nèi)和臨床試驗進一步驗證。