miR-21-5p改善阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性及其作用機(jī)制

趙 佩，安慧仙，陳蕊蕊，周海佳，紀(jì)兆樂，劉鵬云*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710038；2西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心臟內(nèi)科；*通訊作者,E-mail:pengyltdyy@126.com)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類高效化療藥物，廣泛應(yīng)用于癌癥的臨床治療。但其長(zhǎng)期使用所導(dǎo)致的急慢性心臟毒性反應(yīng)也引起了越來越多的關(guān)注，包括心動(dòng)過速、心律失常、低血壓、左室功能低下，甚至難治性遲發(fā)性心肌病[1,2]。同樣，在小鼠模型中累積劑量的DOX也可誘導(dǎo)出心臟毒性，心臟癥狀類似于擴(kuò)張型心肌病，即心室擴(kuò)張，心室射血分?jǐn)?shù)和收縮功能明顯降低。此外，DOX誘導(dǎo)的心臟毒性會(huì)隨著DOX劑量的增加而加重[3]。近年來，大量研究表明DOX誘導(dǎo)的心肌損傷涉及氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、線粒體損傷、炎癥、凋亡和自噬等多個(gè)生物學(xué)過程[4,5]。其中，氧化應(yīng)激和炎癥是DOX致心肌損傷的關(guān)鍵過程。因此，有必要找到有效的方法來預(yù)防DOX在癌癥化療中產(chǎn)生的心臟毒性。

微小RNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約為20個(gè)核苷酸的非編碼小RNA。它們通過靶向特定的mRNA序列，作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，導(dǎo)致mRNA降解和翻譯抑制，并通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞功能相關(guān)的各種蛋白質(zhì)編碼基因來調(diào)節(jié)復(fù)雜的病理生理過程[6,7]。近年來發(fā)現(xiàn)miR-21與心血管系統(tǒng)關(guān)系密切，參與了心臟發(fā)育和重構(gòu)、心律失常、血管生成和血管病變等過程[8]。有研究證實(shí)，與表達(dá)miR-21-5p的BMSCs共培養(yǎng)可恢復(fù)缺血/再灌注損傷后H9C2細(xì)胞中miR-21-5p的表達(dá)，并進(jìn)一步減少缺血/再灌注誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡[9]。此外史東東等[10]觀察到miR-21-5p通過靶向下調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，促進(jìn)大鼠H9C2心肌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。然而miR-21-5p對(duì)DOX引起的心臟毒性的影響及潛在的作用機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究采用小鼠阿霉素心肌損傷模型，從基因調(diào)控層面來探索miR-21-5p減輕DOX心臟毒性的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠，8周齡，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2007-007號(hào)。阿霉素(doxorubicin，DOX)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium, DHE)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche Biochemicals公司。miRNA agomir NC、miR-21-5p agomir、miRNA antagomir NC和miR-21-5p antagomir載體購(gòu)自蘇州Ribo-Bio公司。MicroRNAs定量PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物科技有限公司。NF-κB p-p65、NF-κB p65抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。miR-21-5p agomir序列為5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；miRNA激動(dòng)劑陰性對(duì)照(NC agomir)序列為：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。miR-21-5p antagomir序列為：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′；miRNA拮抗劑陰性對(duì)照(NC antagomir)序列為：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組

為探究心肌miR-21-5p改變對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的影響，腹腔注射DOX構(gòu)建小鼠阿霉素心臟毒性模型[11]。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Con組)、阿霉素組(DOX組)、NC agomir處理組(DOX+ago NC組)、miR-21-5p agomir處理組(DOX+ago-miR-21-5p組)、NC antagomir處理組(DOX+anta NC組)和miR-21-5p antagomir處理組(DOX+anta-miR-21-5p組)，每組8只。DOX組小鼠接受單劑量DOX(15 mg/kg，腹腔注射)，對(duì)照組小鼠注射同等體積的生理鹽水。DOX+ago NC組、DOX+ago-miR-21-5p組、DOX+anta NC組和DOX+anta-miR-21-5p組小鼠在注射DOX前3 d分別經(jīng)尾靜脈注射10 nmol/L的miRNA agomir NC、miR-21-5p agomir(一種特殊標(biāo)記和化學(xué)修飾的雙鏈miRs，可上調(diào)靶基因的生物學(xué)功能)、miRNA antagomir NC和miR-21-5p antagomir(一種特殊標(biāo)記和化學(xué)修飾的雙鏈miRs，可下調(diào)靶基因的生物學(xué)功能)載體。注射DOX后14 d，進(jìn)行超聲心動(dòng)圖測(cè)量，處死小鼠后取出心臟。分別檢測(cè)各組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達(dá)水平、心肌組織微觀病理改變、心肌損傷標(biāo)志物的表達(dá)及心臟功能。

為探究miR-21-5p改善阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的作用機(jī)制，將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為Con組、DOX組、DOX+ago NC組和DOX+ago-miR-21-5p組，每組8只。各組小鼠處理同上。分別檢測(cè)各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率和凋亡蛋白表達(dá)、心肌組織氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)水平。

1.2.1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖采用M型標(biāo)準(zhǔn)二維超聲心動(dòng)圖和15 MHz線性陣列換能器檢查。用異氟醚輕度麻醉小鼠后，采用胸骨旁長(zhǎng)軸位M型圖像測(cè)量常規(guī)超聲心動(dòng)圖參數(shù)，包括左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic dimension，LVESD)。用左室線性測(cè)量值(LVEDD和LVESD)計(jì)算出左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)，以評(píng)價(jià)左室心臟功能。

1.2.2 CK-MB、LDH、MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平測(cè)定 注射DOX后14 d，處死小鼠，分離頸動(dòng)脈并抽取約1 ml血液，靜置后留取上層血清。按照說明書使用試劑盒檢測(cè)血清中CK-MB和LDH水平。另外，將心臟組織置于冷鹽水中(質(zhì)量體積比為1 ∶10)，然后用勻漿機(jī)勻漿。3 000 r/min離心取上清，檢測(cè)心臟組織MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平。

1.2.3 心肌組織HE染色 心臟組織在4%的多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋后將石蠟塊切片至5 μm。石蠟切片在100%二甲苯和二甲苯與酒精(1 ∶1)的混合溶液中浸泡15 min，脫蠟，分別在100%，95%和75%的酒精溶液中浸泡1 min，然后用生理鹽水清洗。蘇木素染色30 min，加入0.02%伊紅，光鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將1.2.3制備好的石蠟切片經(jīng)脫蠟水合后，用蛋白酶K工作液打孔30 min。按照TUNEL試劑盒說明書配置TUNEL反應(yīng)混合物。切片與提前預(yù)混的TUNEL反應(yīng)混合物避光孵育1 h，PBS溶液洗滌后DAPI染液染色細(xì)胞核。切片在激光共聚焦顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核顯示綠色熒光。

1.2.5 心肌組織ROS生成檢測(cè) 心肌組織經(jīng)液氮速凍后迅速切成冰凍切片，按照DHE檢測(cè)試劑盒說明書避光滴加DHE反應(yīng)液，PBS溶液洗片后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image J軟件對(duì)切片熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.2.6 心肌組織NF-κB免疫熒光染色 先用3% H2O2處理復(fù)水石蠟切片30 min，然后在室溫下用Immuno-Block試劑孵育30 min。使用抗NF-κB抗體在4 ℃加水浴箱中過夜，然后與Alexa熒光素標(biāo)記的二抗在37 ℃孵育1 h。最后切片用DAPI染色細(xì)胞核并在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行成像。

1.2.7 qRT-PCR測(cè)定miR-21-5p及相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平 用RNA提取試劑盒提取總RNA，并使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由上海生工生物科技有限公司合成(見表1)。qRT-PCR使用TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)條件為94 ℃、5 min后，94 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。U6是miR-21-5p的內(nèi)部參比，GAPDH作為其余分子的內(nèi)部參照。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qRT-PCR分析引物序列

1.2.8 心肌組織蛋白表達(dá)測(cè)定 用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液將心臟組織樣品勻漿。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品的蛋白濃度。含量測(cè)定后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(PVDF)上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，在4 ℃下用p-p65(1 ∶1 000)、p65(1 ∶1 000)一抗孵育過夜。在室溫下加入二抗2 h后，分別使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)和生物光譜凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)膜上的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性小鼠心肌組織中miR-21-5p的表達(dá)變化

與Con組相比，DOX組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達(dá)顯著下降(P<0.05)。與DOX組相比，DOX+anta-miR-21-5p組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達(dá)進(jìn)一步減低(P<0.05)；而與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達(dá)顯著提高(P<0.05)。與DOX組相比，DOX+ago NC和DOX+anta NC組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。

與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖1 阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性小鼠心肌組織miR-21-5p的表達(dá)變化Figure 1 Expression of miR-21-5p in the myocardium of doxorubicin-induced cardiotoxicity mice

2.2 提高心肌miR-21-5p表達(dá)可顯著改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷

心肌組織HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，DOX組小鼠心肌組織發(fā)生顯著的空泡化變性，且心肌纖維排列紊亂、斷裂明顯，表明心肌組織損傷顯著。與DOX組相比，DOX+anta-miR-21-5p組小鼠心肌組織空泡化變性進(jìn)一步加重，心肌損傷進(jìn)一步加劇；而與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠心肌組織空泡化變性顯著改善，心肌損傷明顯減輕(見圖2A)。

通過檢測(cè)心肌損傷血清標(biāo)志物L(fēng)DH及CK-MB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，DOX組小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB水平顯著上升(P<0.05，見圖2B)。與DOX組相比，DOX+anta-miR-21-5p組小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB的水平進(jìn)一步增加(P<0.05)；而與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB的水平顯著降低(P<0.05，見圖2B)。與DOX組相比，DOX+ago NC和DOX+anta NC組小鼠上述心肌損傷指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖2B)。

B.血清內(nèi)LDH及CK-MB檢測(cè)結(jié)果與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖2 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的影響Figure 2 Effect of miR-21-5p on doxorubicin-induced myocardial injury

2.3 提高心肌miR-21-5p表達(dá)可顯著改善阿霉素誘導(dǎo)的心功能障礙

阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷最終會(huì)導(dǎo)致心臟功能的改變，心臟超聲檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組相比，DOX組小鼠LVEDD和LVESD值明顯增加(P<0.05)；與DOX組相比，DOX+anta-miR-21-5p組小鼠LVEDD和LVESD值進(jìn)一步增加(P<0.05)；而與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠LVEDD和LVESD值顯著降低(P<0.05)；與DOX組相比，DOX+ago NC和DOX+anta NC組小鼠上述心肌超聲檢測(cè)指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

計(jì)算得出的反映心臟收縮功能指標(biāo)LVEF和LVFS結(jié)果顯示，與Con組相比，DOX組小鼠LVEF和LVFS值顯著下降(P<0.05)；與DOX組相比，DOX+anta-miR-21-5p組小鼠LVEF和LVFS值進(jìn)一步減低(P<0.05)；而與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠LVEF和LVFS值明顯提高(P<0.05)；與DOX組相比，DOX+ago NC和DOX+anta NC組小鼠上述心肌收縮功能指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖3 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心功能障礙的影響Figure 3 Effect of miR-21-5p on doxorubicin-induced cardiac dysfunction

2.4 提高心肌miR-21-5p表達(dá)可顯著抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

通過TUNEL染色結(jié)果顯示，與Con組相比，DOX組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，且促凋亡Bax mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上升，抗凋亡Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降(均P<0.05)。與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，同時(shí)Bax mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(均P<0.05)；與DOX組相比，DOX+ago NC組小鼠上述心肌細(xì)胞凋亡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖4，5)。

綠色熒光代表凋亡細(xì)胞核染色，藍(lán)色熒光代表所有細(xì)胞核染色與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖4 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響 (TUNEL,×400)Figure 4 Effect of miR-21-5p on apoptosis rate of cardiomyocytes induced by doxorubicin (TUNEL,×400)

與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖5 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of miR-21-5p on expression of apoptosis-related proteins induced by doxorubicin

2.5 提高心肌miR-21-5p表達(dá)可顯著減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌組織氧化應(yīng)激損傷

通過分析心肌組織切片二氫乙錠(DHE)紅色熒光強(qiáng)度以表示ROS生成量，并通過檢測(cè)試劑盒結(jié)果顯示，與Con組相比，DOX組小鼠心肌組織MDA含量及ROS生成量顯著增加，NOX2和NOX4 mRNA表達(dá)顯著上升，而SOD、GSH和GSH-Px的含量則明顯下降(均P<0.05，見圖6，7)。與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠心肌組織MDA及ROS的生成顯著降低，NOX2和NOX4 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)SOD、GSH和GSH-Px的合成明顯增加(均P<0.05)。與DOX組相比，DOX+ago NC組小鼠上述心肌組織氧化應(yīng)激的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖6，7)。

與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖6 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激血清學(xué)指標(biāo)的影響Figure 6 Effect of miR-21-5p on serum indexes of myocardial oxidative stress induced by doxorubicin

2.6 提高心肌miR-21-5p表達(dá)可顯著抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌組織炎癥反應(yīng)

通過檢測(cè)心肌組織炎癥反應(yīng)結(jié)果顯示，與Con相比，DOX組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6、MCP-1及TNF-α mRNA表達(dá)顯著上升，且心肌組織中NF-κB蛋白的熒光表達(dá)及其磷酸化程度明顯增強(qiáng)(均P<0.05，見圖8，9)。與DOX組相比，DOX+ago-miR-21-5p組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6、MCP-1及TNF-α的mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)心肌組織中NF-κB蛋白的熒光表達(dá)及其磷酸化程度明顯被抑制(均P<0.05，見圖8，9)。與DOX組相比，DOX+ago NC組小鼠上述心肌組織炎癥的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖8，9)。

與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖7 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌ROS及氧化應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的影響 (DHE染色，×400)Figure 7 Effect of miR-21-5p on the expression of ROS and oxidative stress-related molecules in myocardium of mice induced by doxorubicin (DHE，×400)

與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖8 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌炎癥相關(guān)分子表達(dá)的影響Figure 8 Effect of miR-21-5p on the expression of molecules related to myocardial inflammation in myocardium of mice induced by doxorubicin

與Con組相比，*P<0.05；與DOX組相比，#P<0.05圖9 miR-21-5p對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌組織NF-κB分子表達(dá)的影響 (×400)Figure 9 Effect of miR-21-5p on NF-κB expression in myocardial tissue induced by doxorubicin (×400)

3 討論

DOX自20世紀(jì)60年代末以來在抗癌治療方面取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。然而，在臨床情況下，DOX誘導(dǎo)的心臟毒性在接受化學(xué)療法的腫瘤患者中卻是非常令人關(guān)注的副作用之一，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)行性心肌病，甚至進(jìn)展成充血性心力衰竭[12,13]。有研究表明，當(dāng)DOX累積劑量達(dá)到700 mg/m2時(shí)，心力衰竭的發(fā)生率將增加到48%[14]。盡管DOX具有強(qiáng)大的抗腫瘤功能，但其應(yīng)用往往受到其心臟毒副作用的限制。因此，有必要尋找有效的治療措施，以對(duì)抗DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。

微小RNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA，通過與靶mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)。越來越多的證據(jù)顯示，miRNAs參與心臟功能的調(diào)節(jié)，包括凋亡、電信號(hào)和心臟發(fā)育，可以被認(rèn)為是治療心肌損傷的潛在藥物靶點(diǎn)[15,16]。其中微小RNA-21(miR-21)可通過多個(gè)作用靶點(diǎn)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等參與心血管疾病的進(jìn)程[8]。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)miR-21-5p的BMSCs共培養(yǎng)可恢復(fù)缺血/再灌注損傷后H9C2細(xì)胞中miR-21-5p的表達(dá)，并進(jìn)一步減少缺血/再灌注誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡。史東東等[10]觀察到，miR-21-5p通過靶向下調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，促進(jìn)大鼠H9C2心肌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。Li等[17]報(bào)道，miR-21-5p通過PTEN/Akt通路促進(jìn)血管生成和心肌細(xì)胞存活，從而促進(jìn)外泌體介導(dǎo)的心臟修復(fù)。然而miR-21-5p對(duì)DOX引起的心臟毒性的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，DOX組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達(dá)顯著下降，心肌組織發(fā)生顯著的空泡化變性，心肌纖維排列紊亂、斷裂明顯，且心臟收縮功能明顯下降，表明心肌組織損傷顯著。提高心肌組織miR-21-5p的表達(dá)后，可顯著改善小鼠心肌組織空泡化變性，降低血清中LDH及CK-MB的水平，改善心臟收縮功能，減輕了心肌損傷。然而進(jìn)一步抑制心肌組織miR-21-5p的表達(dá)后，則進(jìn)一步加重小鼠心肌組織空泡化變性，進(jìn)一步增加小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB的水平，進(jìn)一步加重心臟收縮功能障礙，加劇了心肌損傷。因此，以上結(jié)果表明miR-21-5p治療對(duì)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性的保護(hù)作用有望獲得較大的臨床價(jià)值，并可能成為防治腫瘤患者化療期間心臟毒性的重要策略。

大量研究證明DOX誘導(dǎo)的心臟毒性機(jī)制與心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激密切相關(guān)[18]。DOX產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基(·O2)和活性氧(ROS)，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體功能障礙和細(xì)胞損傷。此外一些重要的抗氧化酶(GSH、GSH-Px和SOD)消耗的增加也降低了細(xì)胞處理過氧化物的水平，導(dǎo)致細(xì)胞生存能力下降[19,20]。炎癥反應(yīng)在DOX誘導(dǎo)心臟毒性的發(fā)生發(fā)展中也起到了關(guān)鍵的作用[21]。促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、MCP-1及TNF-α的表達(dá)增加介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)是DOX誘導(dǎo)心臟毒性的另一個(gè)主要因素[22]。同時(shí)DOX刺激NF-κB的活化和磷酸化，已被證實(shí)可調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致不可逆的炎癥損傷[23]。最近的研究也揭示了凋亡增加在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中的重要性，且DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡加速與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)關(guān)系密切[24,25]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，DOX組小鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，Bax表達(dá)顯著上升，Bcl-2表達(dá)顯著下降。心肌組織MDA含量及ROS生成量顯著增加，NOX2和NOX4表達(dá)顯著上升，而SOD、GSH和GSH-Px的含量則明顯減少。且心肌組織IL-1β、IL-6、MCP-1及TNF-α表達(dá)顯著上調(diào)，NF-κB蛋白的熒光表達(dá)及磷酸化程度明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果表明抑制炎癥和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的一種有前途的方法。

miR-21-5p可通過多種途徑參與氧化應(yīng)激和炎癥的病理生理過程，發(fā)揮保護(hù)作用。Lv等[26]報(bào)道m(xù)iR-21-5p可能通過PI3K/AKT通路減少大鼠脊髓組織的凋亡和炎癥反應(yīng)。Xue等[27]發(fā)現(xiàn)miR-21-5p通過調(diào)節(jié)PDCD4抑制脂多糖處理的H9C2細(xì)胞的炎癥損傷。Nasci等[28]的結(jié)果表明，過表達(dá)miR-21-5p可以降低H9C2細(xì)胞的脂質(zhì)含量和脂質(zhì)過氧化，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)糖酵解和脂肪酸氧化途徑的依賴發(fā)揮減輕氧化應(yīng)激的作用。Yuan等[29]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-21-5p通過抑制自噬進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞凋亡。然而，miR-21-5p在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中是否同樣發(fā)揮了抗氧化及抗炎作用有待進(jìn)一步探究。我們的結(jié)果證實(shí)，與DOX組相比，高表達(dá)miR-21-5p處理可顯著抑制心肌組織MDA及ROS的生成，顯著下調(diào)NOX2和NOX4的表達(dá)，同時(shí)明顯促進(jìn)SOD、GSH和GSH-Px的合成。此外，心肌組織IL-1β、IL-6、MCP-1及TNF-α的表達(dá)也顯著下降，NF-κB蛋白的熒光表達(dá)及磷酸化程度也明顯被抑制，進(jìn)而顯著降低了心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究首次證實(shí)，miR-21-5p可通過抑制心肌氧化應(yīng)激和炎癥發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)而改善心臟功能，從而減輕了阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性?；诒狙芯拷Y(jié)果，或可通過藥物或miR-21-5p類似物調(diào)控靶基因的表達(dá)，作為潛在的臨床治療候選藥物加以開發(fā)，以期為防治DOX治療的患者發(fā)生心臟毒性提供新的可能。