黃芪甲苷對膿毒癥小鼠急性腎損傷的保護作用及機制

張玉明，亢德強，徐臣年，唐賽男，羅明華，李 婕，喬 銳*

(1聯(lián)勤保障部隊第967醫(yī)院心腎內科，大連 116021；2武警四川省總隊醫(yī)院泌尿外科；3北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院干部病房一科；*通訊作者,E-mail:2981703671@qq.com)

流行病學研究揭示了重癥監(jiān)護患者急性腎損傷和膿毒癥之間不可避免的聯(lián)系。繼發(fā)于膿毒性損傷的腎功能障礙的發(fā)生通常會對住院患者的預后產生極其不利的影響[1,2]。不幸的是，除了持續(xù)腎臟替代療法或腎臟移植之外，還沒有有效的方法應用于治療膿毒癥誘導的腎損傷的臨床試驗[3]。膿毒癥誘導的腎損傷的病理生理機制是復雜的，尚未完全闡明。越來越多的證據表明，膿毒癥引起的促炎因子和抗炎因子水平的變化會導致炎癥反應，從而導致急性腎損傷[4,5]。此外，來自實驗模型和臨床研究的數據也支持氧化應激和活性氧增加在膿毒癥誘導的急性腎損傷進展中的關鍵作用。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是從中藥黃芪中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎癥、降低血糖等多重藥理作用[6]。值得注意的是，黃芪甲苷在多種損傷因素所致的腎臟疾病尤其是對糖尿病腎病的保護作用被越來越廣泛地報道[7-9]。然而黃芪甲苷能否減輕膿毒癥小鼠急性腎損傷及其治療機制尚未完全清楚，因此，本研究通過構建膿毒癥小鼠模型，以初步觀察黃芪甲苷對膿毒癥小鼠急性腎損傷的保護作用，并探討其潛在的分子機制，為其在腎病防治中的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物

無特定病原體(SPF)雄性C57BL/6J小鼠40只，8周齡。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)購于美國Sigma-Aldrich公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione,GSH)檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒購于美國Roche公司。超氧化物陰離子熒光檢測探針購于美國ThermoFisher公司。SIRT1抗體和β-actin抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。多功能酶標儀購于美國Thermo公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 C57BL/6J小鼠被隨機分為4組：假手術組(sham)、黃芪甲苷組(sham+AS-Ⅳ)、模型組(CLP)和模型+黃芪甲苷處理組(CLP+AS-Ⅳ)。應用盲腸結扎穿孔手術建立膿毒癥模型。所有動物在手術前12 h禁食，可自由飲水。通過腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠。在腹部中線切開1 cm以暴露盲腸。用絲縫線在回盲瓣下方的底部將盲腸緊緊結扎，用20G的穿刺針在盲腸上扎穿兩次后，輕輕擠出少量糞便。此后，將盲腸放回腹膜腔，用無菌縫線縫合腹部。sham組小鼠進行與CLP組相同的剖腹手術，但不結扎和穿刺盲腸。sham+AS-Ⅳ組和CLP+AS-Ⅳ組小鼠術后腹腔注射黃芪甲苷(100 mg/kg)治療，sham組和CLP組小鼠術后給予腹腔注射等體積生理鹽水處理。術后處理24 h采集血、尿等樣本并處死小鼠。

1.2.2 腎功能指標測定 使用酶標儀收集血樣以測量血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)水平。根據各個ELISA試劑盒提供的說明，收集尿樣以測量腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)和尿白蛋白/肌酐(urinary albumin/creatinine，UAlb/Cr)的表達水平。

1.2.3 腎臟組織染色 小鼠腎臟經多聚甲醛固定和石蠟包埋后切成3 μm厚的切片。然后進行蘇木精-伊紅(HE)染色以觀察腎組織的形態(tài)學變化。用倒置顯微鏡捕捉每個切片中隨機選擇的5個高倍視野。使用以下參數對腎組織的損傷量化進行分級：細胞水腫、細胞凋亡、壞死細胞增多、炎性細胞浸潤和出血。采用半定量量表對腎臟損傷進行評分，并進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 SIRT1,腎組織促炎因子及凋亡指標表達測定 使用TRIzol試劑從腎組織中提取總RNA。此后，使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒按照說明書的方案合成cDNA。CFX96 RT-PCR系統(tǒng)用于qRT-PCR程序。靶基因的相對水平用2-ΔΔCt方法計算。引物序列見表1。

表1 相關引物序列

1.2.5 腎組織MDA含量、SOD和GSH活性測定 根據試劑盒說明書，采用ELISA方法測定腎組織中MDA含量、SOD和GSH活性，使用SpectraMax M5裝置對結果進行分光光度分析。

1.2.6 腎組織ROS生成測定 腎臟在液氮中快速冷凍，并切成3 μm厚的切片。冷凍組織切片在黑暗潮濕的小室中用二氫乙錠(ethidium dihydrochloride，DHE)反應混合物染色。使用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡檢查每個樣品。使用ImageJ軟件測定切片中二氫乙錠的熒光強度，以評估腎組織中ROS的產生。

1.2.7 腎組織細胞凋亡檢測 小鼠腎臟經多聚甲醛固定和石蠟包埋后切成3 μm厚的切片。經脫蠟水化和PBS液浸洗后，用Proteinase K進行細胞通透處理。按照試劑盒說明書制備TUNEL反應混合液，滴加于標本上，加蓋玻片在37 ℃暗濕盒中反應1 h。PBS洗滌后加入DAPI染色液1 ∶2 000室溫孵育5 min。使用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察每個樣品，其中藍色熒光表示總細胞核，綠色熒光表示凋亡細胞核，以發(fā)綠色熒光細胞數占藍色熒光細胞數的百分比(%)表示細胞的凋亡率。

1.2.8 SIRT1蛋白表達及脫乙酰酶活性檢測 從腎組織中提取總蛋白，并使用BCA試劑盒進行定量。通過SDS-PAGE分離蛋白樣品，然后轉移至聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜在SIRT1(1 ∶1 000)、和β-actin(1 ∶5 000)的一抗中4 ℃孵育過夜。經漂洗后再將膜與相應的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗一起孵育，并使用Image Lab分析蛋白條帶。

SIRT1脫乙酰酶活性根據制造商的說明書通過熒光測定法進行測量。向每個孔中加入顯色劑Ⅱ后，將反應混合物在37 ℃下使用SpectraMax M5儀器讀取熒光，激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為460 nm。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎功能損傷

與sham組相比，CLP組小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr水平均明顯升高(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr均顯著降低(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ小鼠上述腎功能指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖1)，提示黃芪甲苷能夠減輕膿毒癥小鼠腎功能損傷。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖1 各組小鼠的腎功能比較Figure 1 Comparison of renal function between groups

2.2 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織結構損傷

sham組和sham+AS-Ⅳ組小鼠腎組織結構無明顯改變，無腎小球腫脹、壞死及腎小管內鑄型形成(P>0.05)；CLP組小鼠腎組織可見明顯的腎組織結構改變，如腎小球腫脹、壞死及腎小管內鑄型形成，腎組織損傷評分顯著升高(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織結構改變明顯得到減輕，腎組織損傷評分顯著降低(P<0.05，見圖2)。提示黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織結構損傷。

圖2 各組小鼠的腎組織結構變化比較 (HE染色)Figure 2 Comparison of changes of renal tissue structure between groups (HE staining)

2.3 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織炎癥反應及凋亡水平

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中SIRT1表達水平明顯降低(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及凋亡指標Bax、Caspase-3的mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1表達水平明顯升高(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及凋亡指標Bax、Caspase-3的mRNA表達明顯減少(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ組小鼠上述SIRT1、促炎因子以及凋亡指標的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖3)。提示黃芪甲苷可減輕膿毒癥小鼠腎組織炎癥反應及凋亡水平。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖3 各組小鼠腎組織炎癥反應水平比較Figure 3 Comparison of inflammatory response levels in renal tissue between groups

2.4 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織氧化應激損傷

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著增加，SOD和GSH的含量顯著減低(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著降低，SOD和GSH的含量顯著升高(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ組小鼠上述氧化應激指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖4)。提示黃芪甲苷可減輕膿毒癥小鼠腎組織氧化應激損傷。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖4 各組小鼠腎組織氧化應激水平比較Figure 4 Comparison of renal oxidative stress level between groups

2.5 黃芪甲苷顯著降低膿毒癥小鼠腎組織細胞凋亡率

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織細胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ小鼠腎組織細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖5)。提示黃芪甲苷顯著降低膿毒癥小鼠腎組織細胞凋亡率。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖5 TUNEL染色檢測各組小鼠腎組織凋亡率Figure 5 Apoptosis level in renal tissue in each group by TUNEL staining

2.6 黃芪甲苷顯著促進膿毒癥小鼠腎組織SIRT1信號表達及凋亡水平

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達及去乙酰化活性均顯著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達水平顯著增加(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達及去乙?；钚跃@著增加(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達水平顯著降低(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達及去乙?；钚浴ax、Caspase-3表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖6)。提示黃芪甲苷能夠促進膿毒癥小鼠腎組織SIRT1信號表達及凋亡水平。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖6 蛋白免疫印跡檢測各組小鼠腎組織SIRT1信號表達Figure 6 SIRT1 signal expression in renal tissue in each group by Western blot

3 討論

急性腎損傷是一種復雜的臨床綜合征，其定義為血清肌酐水平的快速增加和腎臟排泄功能的突然喪失，被視為與重癥患者死亡率升高相關的主要公共衛(wèi)生問題[10,11]。盡管腎臟替代療法取得了技術進步，但大多數患者仍然存在不良結果和嚴重的腎功能損害[3]。據報道，膿毒癥是危重患者急性腎損傷的重要誘因。比較研究表明，膿毒癥誘導的急性腎損傷患者其腎功能變化更明顯，腎臟組織學變化更劇烈，且總死亡率更高[12]。因此，迫切需要開發(fā)有效的治療策略來緩解并改善這種嚴重臨床并發(fā)癥的預后。

近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，一種來源于豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的黃酮類化合物黃芪甲苷，在腎臟相關疾病中發(fā)揮了重要的保護作用[13,14]。然而，黃芪甲苷能否減輕膿毒癥急性腎損傷及其潛在分子機制還有待進一步探究。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)，與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr均顯著降低，且CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織結構改變明顯得到緩解。以上結果提示，黃芪甲苷對抑制膿毒癥引起的急性腎損傷具有巨大的治療潛力。

目前，膿毒癥誘導的急性腎損傷機制是復雜的。來自實驗模型和臨床研究的證據表明，炎癥在膿毒癥誘導的急性腎損傷中起著至關重要的作用[4]。全身性膿毒癥發(fā)生后，炎癥細胞因子和白細胞活性的增加導致腎臟進一步的促炎反應，從而導致微循環(huán)障礙、內皮細胞功能障礙和功能障礙性腎小管-腎小球反饋，最終導致腎臟損傷[15]。因此，減輕炎癥反應將是治療膿毒癥誘導的急性腎損傷的一個關鍵策略[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-Α以及凋亡相關指標Bax、Caspase-3的mRNA表達顯著升高；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中上述促炎因子和凋亡相關指標的表達明顯減少，這表明黃芪甲苷可以通過其抗炎作用保護膿毒癥誘導的急性腎損傷。

由過量ROS引發(fā)的氧化應激水平升高是急性腎損傷進展的另一個重要機制。持續(xù)增強的氧化應激過度消耗內源性抗氧化酶，導致膜脂過氧化、蛋白質和DNA氧化，最終導致細胞結構和功能的破壞以及腎組織的損傷[17,18]。在我們的研究中，與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著增加，SOD和GSH的含量顯著減低，與先前的研究結果相一致。大量研究發(fā)現(xiàn)，抑制氧化應激是緩解膿毒癥誘導的急性腎損傷的重要方法。我們的結果還觀察到，與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著降低，SOD和GSH的含量顯著升高。這表明黃芪甲苷不僅可以抑制過量ROS的產生，還可以恢復抗氧化系統(tǒng)的功能，突出了其在減輕膿毒癥小鼠腎組織氧化損傷方面的潛力。

當遇到諸如敗血癥、局部缺血和毒物等損傷時，腎組織中會出現(xiàn)細胞死亡，并嚴重影響腎臟功能。細胞凋亡是一種主要的細胞死亡類型，可因由多種途徑介導的炎癥和氧化應激反應所導致，極大地加劇了腎臟損傷和功能障礙[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，CLP組小鼠腎組織細胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織細胞凋亡率明顯下降，這些觀察結果表明黃芪甲苷在預防膿毒癥誘導的急性腎損傷細胞凋亡中可能發(fā)揮了重要的保護作用。

SIRT1是一種NAD+(煙酰胺腺苷二核苷酸)依賴的脫乙?；福蚱湓跍p輕氧化應激和炎癥中的作用而被視為膿毒癥誘導的急性腎損傷的主要調節(jié)分子之一[21]。SIRT1的作用主要依賴于其下游靶標的去乙?；?，如foxo1和NF-κB[22]。一方面，SIRT1對foxo1的去乙酰作用增加了抗氧化劑的合成，并提高了細胞抗氧化能力[23]。另一方面，SIRT1可以使NF-κB亞單位p65去乙酰化，以抑制炎性細胞因子的表達，并降低細胞炎癥反應[24]。因此，SIRT1表達或活性的降低與氧化應激和炎癥的增加密切相關。本研究觀察到，與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達及去乙?；钚跃@著降低，Bax、Caspase-3的表達增多；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達及去乙酰化活性均顯著增加，同時伴有凋亡相關指標Bax、Caspase-3的表達減少，這表明黃芪甲苷可能通過激活SIRT1及其相關的下游信號分子來介導其減輕膿毒癥急性腎損傷的作用。

綜上所述，在CLP誘導的膿毒癥模型中，黃芪甲苷對膿毒癥誘導的急性腎損傷具有有益的作用，這由膿毒癥小鼠腎功能改善和腎組織學損傷減輕所證實。而黃芪甲苷發(fā)揮上述保護作用可能是通過激活SIRT1信號，進而抑制了膿毒癥小鼠腎組織中的炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡來實現(xiàn)的。