下調lncRNA-H19表達對H2O2誘導的HUVEC炎性損傷的影響

宋姍姍,楊 洋,陳 陽,何 靜*

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院產科，西安 710077;2西安市人民醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學中心；*通訊作者,E-mail:drhej@126.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)在孕婦中發(fā)病率約為4%～6%，是導致母胎死亡的重要因素之一[1]。目前PE發(fā)病機制尚不明確，相關研究提示PE為多種因素共同導致的疾病[2]。其中，螺旋動脈重鑄不足而導致的胎盤功能障礙是該疾病的主要病因學說；胎盤源性因素作用于全身系統(tǒng)，引發(fā)的包括血管內皮功能障礙、炎性反應激活等一系列病理表現(xiàn)可能為PE發(fā)生的潛在機制[3]。相關研究表明，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)包括lncRNA、miRNA等在PE患者胎盤組織中差異性表達[4-6]，這些ncRNA能夠通過交互調控，影響下游靶基因，在調節(jié)細胞炎性損傷性死亡、內皮細胞及滋養(yǎng)細胞功能等過程中發(fā)揮重要作用。

lncRNA-H19被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生、生殖系統(tǒng)功能調節(jié)等領域中發(fā)揮重要作用[7]。其中，lncRNA-H19在胎兒生長受限患者的胎盤組織中低表達，并能夠間接調控滋養(yǎng)細胞的增殖、侵襲和自噬，從而與胎兒生長受限發(fā)病相關[8]。提示lncRNA-H19能夠參與胎盤功能的建立過程。在血管內皮細胞模型中，lncRNA-H19能夠通過發(fā)揮內源性競爭性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)作用，參與了腹主動脈瘤的形成[9]；而lncRNA-H19的沉默能夠加重細胞焦亡，導致動脈粥樣硬化發(fā)生[10]。但lncRNA-H19與PE的相關性，及其參與PE疾病的初步機制目前尚不明確。本研究通過觀察lncRNA-H19與PE相關性，及其是否能夠參與HUVEC的炎性損傷調節(jié)過程，進一步探討lncRNA-H19更多的相關生物學功能，及其參與PE的部分機制。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本

收集2021年1月至2021年8月在西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院產科住院行剖宮產分娩的15例PE晚孕患者(PE組)，診斷標準嚴格依據(jù)第九版《婦產科學》[11]，該組患者除PE外無其他妊娠期合并癥，孕周(38.3±1.2)周，年齡(30.1±4.2)歲，體質量指數(shù)(body mass index，BMI)(26±1.9)kg/m2。同時收集同期住院分娩的正常孕婦15例作為對照組，該組患者無妊娠期合并癥，孕周(38.6±1.2)周，年齡(29.4±4.9)歲，BMI(26.1±2.3)kg/m2。兩組孕婦均為單胎初產婦，入院前均未接受任何治療，既往無遺傳性、傳染性疾病及代謝性疾病病史；無慢性病藥物使用、放射線及毒物接觸史，無家族性遺傳病史。兩組孕婦孕周、年齡、BMI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經醫(yī)院倫理委員同意并批準(批準文號：XYFY2021LSK-018)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要細胞、試劑和材料

HUVEC細胞購自ATCC中國細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司)；H2O2(美國Sigma公司)；F12K培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(中國武漢普諾賽科技有限公司)；PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit(日本TaKaRa公司)；Lipofectamine2000(美國ThermoFisher公司)；siRNA-H19質粒(即lncRNA-H19抑制劑)及其陰性對照物(siRNA-H19 NC)(中國廣州吉賽生物科技股份有限公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；PCR引物序列(中國北京擎科生物有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、IL-18、IL-1β ELISA檢測試劑盒(中國上海碧云天公司)；p-ERK、p-JNK、p-p38、β-actin單克隆抗體、HRP標記二抗(中國武漢博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；ECL底物液(中國北京普利萊基因技術有限公司)；Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清及胎盤標本收集 入院后在接受藥物及手術治療前，分次采集、收集納入的兩組患者晨起空腹肘靜脈血共計5 ml。所有血漿樣本均在采集后置促凝管中，4 ℃靜置過夜后2 000 r/min離心5 min，吸取上層血清至EP管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

于胎盤娩出后迅速收集兩組患者胎盤組織標本，取1 cm3大小組織若干塊，PBS液中迅速漂洗后，置入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細胞培養(yǎng)及轉染 將HUVEC細胞取出后解凍，接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按每孔2×105個細胞量，均勻地接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜；待細胞生長密度至80%左右時按照Lipofectamine 2000說明書要求轉染siRNA-H19及其對照物(siRNA-H19 NC)，轉染后6 h于熒光顯微鏡下觀察轉染效率(羧基熒光素酶FAM標記對照)。轉染后進行H2O2培養(yǎng)液干預，根據(jù)文獻[12]報道，干預濃度為300 μmol/L。實驗分組：NC組(陰性對照)、H2O2組(H2O2干預培養(yǎng))、H2O2+H19抑制對照組(siRNA-H19陰性對照物轉染細胞+H2O2干預培養(yǎng))、H2O2+H19抑制組(siRNA-H19轉染細胞+H2O2干預培養(yǎng))。

1.3.3 qRT-PCR檢測lncRNA-H19 mRNA水平表達 Trizol法分別提取血清標本、胎盤組織中以及HUVEC細胞中總RNA；檢測RNA質量后，按照PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit說明書步驟進行qRT-PCR反應，引物序列見表1。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，40個循環(huán)。以U6為內參，進行PCR反應。每次檢測設定3個復孔，每個樣本重復3次。根據(jù)PCR擴增曲線，使用2-ΔΔCt法計算目的基因lncRNA-H19 mRNA水平的表達情況。

表1 目的基因引物序列

1.3.4 IL-1β、IL-18、p-ERK、p-JNK、p-p38表達水平的檢測 轉染48 h后，按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測4組HUVEC細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18表達量，記錄酶標儀測量的OD450值進行統(tǒng)計學分析。

轉染48 h后，使用RIPA裂解液分別提取4組HUVEC細胞中總蛋白。檢測蛋白濃度后，Western blot檢測p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白水平表達：配膠后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)；將目的條帶電轉至PVDF膜；一抗4 ℃孵育過夜(抗體濃度：p-ERK 1 ∶1 000、p-JNK 1 ∶1 500、p-p38 1 ∶1 000、β-actin內參1 ∶500)；HRP標記二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h；ECL顯影、定影，BandScan分析膠片灰度值。

1.3.5 HUVEC細胞成管能力檢測 轉染48 h后，取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，用F12K培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按每孔2×105個細胞量，接種到6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜；實驗分組同1.3.2中細胞分組。培養(yǎng)48 h后，使用0.25%胰酶消化HUVEC，用無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按照每孔1×105/個細胞，均勻接種到預鋪有基質膠的24孔板中，37 ℃、5%CO2過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)8～12 h后拍照觀察，檢測量化指標為總分支長度及管腔數(shù)，使用ImageJ軟件進行數(shù)據(jù)分析，后續(xù)行統(tǒng)計學分析。

1.3.6 流式細胞術檢測HUVEC細胞凋亡 實驗分組同1.3.2中細胞分組，將HUVEC細胞消化后，使用PBS液重懸成為單細胞懸液，無水乙醇固定細胞后，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒說明書步驟，給每組細胞樣本中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC及5 μl PI，混勻后避光，反應15 min后上樣至流式細胞儀進行檢測。使用Expo32 ADC Analysis系統(tǒng)統(tǒng)計分析細胞凋亡檢測結果；應用凋亡指數(shù)B2+B4作為量化指標進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 HUVEC細胞轉染效率檢測

轉染后6 h于熒光顯微鏡下觀察HUVEC細胞轉染效率，細胞轉染效率超過90%(見圖1)。

圖1 HUVEC細胞轉染效率 (×200，F(xiàn)MA標記)Figure 1 Transfection efficiency of HUVEC cells (×200, FMA mark)

2.2 血清標本、胎盤組織及HUVEC細胞中l(wèi)ncRNA-H19表達情況

qRT-PCR結果顯示，與正常組相比，PE組孕婦血清及胎盤組織中l(wèi)ncRNA-H19的表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表2)。

表2 血清、胎盤組織中l(wèi)ncRNA-H19表達水平

表3 lncRNA-H19在HUVEC中mRNA水平表達情況

2.3 各組上清液中IL-1β、IL-18及細胞中p-ERK、p-JNK、p-p38的表達情況

ELISA結果顯示：H2O2組、H2O2+H19抑制對照組、H2O2+H19抑制組HUVEC上清液中IL-1β、IL-18水平均高于NC組(P<0.05，見表4)；與H2O2組、H2O2+H19抑制對照組相比，H2O2+H19抑制組上清液中IL-1β、IL-18表達水平均進一步增高(P<0.05，見表4)。

Western blot結果顯示：H2O2組、H2O2+H19抑制對照組、H2O2+H19抑制組HUVEC細胞中p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白水平表達均高于NC組(見表4，圖2)；與H2O2組和H2O2+H19抑制對照組相比，H2O2+H19抑制組HUVEC細胞中p-ERK、p-JNK、p-p38表達水平均增高(見表4，見圖2)。

表4 HUVEC上清液中IL-1β、IL-18表達水平(n=3,pg/ml)

2.4 各組HUVEC細胞管樣形成總分支長度及管腔數(shù)情況

管樣形成實驗結果顯示，與NC組相比，H2O2組、H2O2+H19抑制對照組、H2O2+H19抑制組HUVEC細胞的總分支長度及管腔數(shù)均降低(P<0.05，見圖3，表5)；與H2O2組、H2O2+H19抑制對照組相比，H2O2+H19抑制組HUVEC細胞的總分支長度及管腔數(shù)均進一步降低(P<0.05，見圖3，表5)。

NC組 H2O2組 H2O2+H19抑制對照組 H2O2+H19抑制組圖3 各組HUVEC血管形成情況 (×200)Figure 3 Angiogenesis ability of HUVECs in each group (×200)

表5 各組HUVEC管樣形成情況 (n=3)

2.5 流式細胞術檢測各組HUVEC凋亡情況

流式細胞術結果顯示，與NC組相比，H2O2組、H2O2+H19抑制對照組、H2O2+H19抑制組HUVEC細胞的凋亡率均增高(P<0.05，見圖4)；與H2O2組、H2O2+H19抑制對照組相比，H2O2+H19抑制組HUVEC的凋亡率增高(P<0.05，見圖4)。

圖4 各組HUVEC細胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of HUVECs in each group

3 討論

PE是以高血壓、蛋白尿等多系統(tǒng)器官功能紊亂為主要表現(xiàn)的全身性疾病，是妊娠期導致孕產婦及胎兒不良結局的常見疾病[1]。眾所周知，胎盤功能異常與PE發(fā)病具有直接相關性[13]；PE時，由于胎盤淺著床，導致胎盤血流灌注異常，誘發(fā)氧化-抗氧化過程失調，出現(xiàn)母胎界面的氧化應激損傷[14]；伴隨著胎盤的分泌效應，始于胎盤的炎癥性改變也導致了PE患者從“局部”到“全身”的廣泛的全身性內皮功能障礙，進而出現(xiàn)多系統(tǒng)臨床癥狀。

正常的血管內皮細胞功能在胎盤建立以妊娠維系等過程中起到至關重要的作用，如出現(xiàn)內皮細胞功能障礙、炎癥性反應、內皮細胞氧化應激發(fā)生等，不僅會成為復發(fā)性流產、PE等疾病的直接誘因[15]，也會導致PE中后期母體全身多系統(tǒng)并發(fā)癥的出現(xiàn)。而lncRNA-miRNA構成的網路系統(tǒng)能夠參與上述病理生理過程，并且已經在PE病因學研究中得到了明確[16,17]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常孕婦相比，lncRNA-H19在PE患者血清及胎盤組織中均表達降低，提示從局部胎盤組織到母體全身循環(huán)系統(tǒng)，lncRNA-H19均存在差異性表達，lncRNA-H19可能與胎盤功能障礙、血管內皮損傷等PE相關的病理過程存在相關性。我們在PE胎盤中發(fā)現(xiàn)的lncRNA-H19表達趨勢與張嫘等[8]在胎兒生長受限胎盤組織中檢測到的表達趨勢一致。

雖然lncRNA能夠在轉錄水平以及表觀遺傳層面均發(fā)揮生理作用，但卻無法直接編碼功能性蛋白，其大多通過發(fā)揮ceRNA等作用方式調控miRNA從而實現(xiàn)其功用[18]。在人微血管內皮細胞中，抑制lncRNA-H19表達條件下，導致miR-181a高表達，而miR-181a則進一步通過降低絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號通路和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路激活，減少血管內VEGF合成，進而影響細胞成管能力[9]，提示lncRNA-H19能夠對炎性通路產生影響。因H2O2能夠通過其強氧化作用誘發(fā)細胞炎性死亡，故本研究中，我們構建了H2O2誘導的HUVEC細胞氧化應激模型，驗證了H2O2干預后HUVEC中p-ERK、p-JNK、p-p38及上清液中IL-1β、IL-18表達均增高；而在該細胞模型中抑制lncRNA-H19表達后，HUVEC中p-ERK、p-JNK、p-p38在蛋白水平進一步增高，而培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18表達也呈相同趨勢；細胞功能驗證發(fā)現(xiàn)H2O2+H19抑制時，HUVEC管腔形成能力下降,凋亡率增高；綜上提示降調節(jié)lncRNA-H19表達能夠影響炎癥通路從而增強H2O2對HUVEC的炎性損傷。

炎性因素為PE病因之一，母胎界面促炎-抗炎免疫失衡、子宮灌注壓降低以及多種炎性通路涉及其中；作為炎性通路之一的MAPKs由細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated kinases, ERK)、P38絲裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases, P38 MAPK)以及JNK組成；ERK通過磷酸化(phosphorylated)過程，成為活化的p-ERK，并由細胞質轉位到核內，進而介導P38、JNK的轉錄活化，參與細胞增殖與分化、形態(tài)維持、凋亡等多種生物學過程[9]。而核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)為另外一條重要的炎性通路，該通路激活能夠促進核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族含pyrin結構域蛋白3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing protein3,NLRP3)炎癥小體分泌炎性因子IL-1β及IL-18；而在A549細胞中，ERK的級聯(lián)磷酸化過程也能夠激活NF-κB通路[19]。ERK的磷酸化使得MAPKs/NF-κB通路具有部分共同路徑參與體內炎癥過程。而多種lncRNA在循環(huán)系統(tǒng)細胞中通過調節(jié)MAPKs/NF-κB通路參與細胞炎癥性損傷已得到了驗證[20]，其中l(wèi)ncRNA-H19被發(fā)現(xiàn)能夠抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的NF-κB激活[10]。結合本研究結果，提示：PE時，低表達的lncRNA-H19可能通過對下游miRNA發(fā)揮ceRNA樣作用，進一步影響MAPKs通路磷酸水平及NF-κB下游炎性因子的產生，誘發(fā)HUVEC細胞功能異常、凋亡增加，一方面參與了胎盤形成異常，另一方面，母體血液中低表達的lncRNA-H19也可能加重了PE時母體血管內皮損傷及全身炎癥反應的進展。既往研究[21]多集中于滋養(yǎng)細胞炎癥性損傷參與PE發(fā)病，而關于內皮細胞層面的相關研究尚少；但是，本研究僅進行了初步的現(xiàn)象型研究，lncRNA-H19調控炎性通路參與PE發(fā)病的具體機制仍需進一步探索。

綜上，lncRNA-H19在PE患者胎盤組織、血清中具有一致的低表達趨勢，明確了其與PE的相關性；lncRNA-H19可能通過調節(jié)炎癥通路激活，影響了如HUVEC等內皮細胞的炎性損傷過程；而PE時，在lncRNA-H19低表達的情況下，進一步增強了炎癥通路的激活，參與了從胎盤界面到母體循環(huán)的炎性反應產生過程。通過本研究，為進一步探討lncRNA在PE發(fā)病過程中的具體作用方式，以及其能否具有成為PE疾病標志物的潛力等方面提供了一定理論依據(jù)。