一測多評法同時測定清熱顆粒中5種成分的含量

邱瓊?cè)A，覃子龍，張 蓓，韋 倩，李雋永，梁學政

（1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院/柳州市壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001；2.柳州市質(zhì)量檢驗檢測研究中心，廣西 柳州 545001）

清熱顆粒為柳州市中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，已申報注冊二十多年，處方由崗梅、野菊花、千里光、紫花地丁、桑葉、蒲公英6味藥物組成。清熱顆粒具有清熱解毒、清肝明目、疏風散熱的作用，臨床上常用于呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚瘡癰腫毒等，效果顯著，使用量較大。但由于該制劑申報時間較早，質(zhì)量標準不完善，缺乏含量控制指標，尚不能全面反映制劑質(zhì)量。

為對清熱顆粒進行更全面的質(zhì)量評價，本研究采用一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）對清熱顆粒中的5種有效成分進行含量測定。QAMS是近年來廣泛用于中藥質(zhì)量評價的一種方法，它利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測定1個成分即可實現(xiàn)多個成分同步測定的方法，具有經(jīng)濟、便捷的優(yōu)點[1-2]。本研究以綠原酸為內(nèi)參物，建立綠原酸與隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷等有效成分的相對校正因子，同時測定5種成分的含量，實現(xiàn)對清熱顆粒質(zhì)量較為全面的控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-20AT高效液相色譜儀，配備SPD-M20A檢測器（日本島津公司）；UV-2450二極管陣列檢測器（日本島津公司）；Waters e2695型高效液相色譜儀（北京普析通用儀器有限責任公司）；XS205DU型分析天平（梅特勒-托利多公司）；AE200型分析天平（梅特勒-托利多公司）；GWB-2E型超純水機（北京普析通用儀器有限責任公司）；SK8200HP型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）。

1.2 試藥綠原酸（批號：MUST-20032310，含量：99.73%）、隱綠原酸（批號：MUST-20042403，含量：99.07%）、秦皮乙素（批號：MUST-20070504，含量：99.87%）、蒙花苷（批號：MUST-20031612，含量：98.65%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司。木犀草苷（批號：111720-201406，含量：94.9%）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇均為色譜純，購自弗頓科學技術(shù)有限公司。清熱顆粒5批（批號：20190905，20200102，20200501，20200504，20201101）購自柳州市中醫(yī)醫(yī)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷對照品適量，以70%甲醇溶解并定容，用0.45 μm濾膜濾過，即得混合對照溶液[綠原酸（50.66 μg/mL）、隱綠原酸（52.61 μg/mL）、秦皮乙素（51.83μg/mL）、木犀草苷（15.69 μg/mL）、蒙花苷（14.86 μg/mL）]。

2.1.2 供試品溶液的制備 取質(zhì)量差異下的清熱顆粒10袋，混勻，取約10.0 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%的甲醇50 mL，超聲30 min，取出，放冷，定容，0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按清熱顆粒的處方及制法，制備缺野菊花、缺紫花地丁陰性對照品，按“2.2.2”項下方法操作，制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件Welchrom C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，10%乙腈；5～20 min，10%→20%乙腈；20～30 min，20%乙腈；30～55 min，20%→45%乙腈；55～60 min，45%乙腈；60～65 min，45%→10%乙腈；65～70 min，10%乙腈；體積流量為1 mL/min；測定波長為320 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，進樣分析，結(jié)果見圖1。綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計算均在10 000以上。缺紫花地丁和缺野菊花的陰性對照品在相應(yīng)位置處未見色譜峰，表明方法專屬性良好。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液，制成6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進行測定。記錄相應(yīng)的色譜峰峰面積，以峰面積為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），進行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.4.2 檢測限與定量限 取“2.1.1”項下混合對照品溶液逐步稀釋，以信噪比S/N=3/1測定檢測限，以S/N=10/1測定定量限，結(jié)果見表1。

表1 5種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗 稱取樣品（批號：20200102）粉末約10 g，精密稱定，制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄各色譜峰峰面積，計算綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷峰面積的RSD值分別為0.19%、0.17%、0.12%、0.16%、0.11%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 稱取樣品（批號：20200102）粉末約10 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜峰，計算綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷峰面積的RSD值分別為0.13%、0.12%、0.14%、0.51%、0.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復性試驗 稱取樣品（批號：20200102）粉末約10 g，共6份，精密稱定，分別制備供試品溶液，進樣測定，計算綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為0.16%、0.27%、0.19%、0.34%、0.26%，結(jié)果表明本試驗的重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取樣品（批號：2020102）粉末6份，精密稱定，每份5 g，分別置錐形瓶中，加入中等濃度的對照品儲備溶液適量（相當于樣品中各成分的50%），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，計算加樣回收率，結(jié)果表明本試驗方法回收率良好。（見表2）

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

附表2：

2.5 相對校正因子（fk/s）的計算[3-6]

2.5.1 多點校正法 以多個質(zhì)量濃度點計算所得的fk/s取平均值作為定量用fk/s。其中fk/s=（Cs×Ak）/（Ck×As）；待測成分質(zhì)量濃度Ck′=（Cs×Ak′）/（fk/s×As）。兩式中Cs為參照物質(zhì)質(zhì)量濃度，As為參照物質(zhì)色譜峰峰面積，Ck為其他對照組分質(zhì)量濃度，Ak為其他對照組分色譜峰峰面積，Ak′為待測組分色譜峰峰面積。以綠原酸為內(nèi)參物，應(yīng)用以上多點校正法進行計算，得到其他成分相對于綠原酸的fk/s。由表3可知，隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的fk/s分別為1.050 7、1.223 1、1.508 7、1.437 4，RSD值分別為0.51%、0.25%、0.29%、0.20%。（見表3）

表3 以綠原酸為參照的fk/s（多點校正法）

2.5.2 斜率校正法 用“2.4.1”項下所得的各成分標準曲線計算X與Y的斜率之比即fk/s（fk/s=ak/as）。Ck′=Ak′/(as×fk/s)，as為參照物斜率，ak為其他對照組分斜率。應(yīng)用斜率校正法進行計算，得到其他成分相對于綠原酸的fk/s。隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷對于綠原酸的fk/s分別為1.046 9、1.219 1、1.505 1、1.439 4。

2.5.3 定量因子 在公式Ck′=Ak′/(as×fk/s)中，當在同一實驗室、同一儀器、同一色譜條件時，特別是在藥廠或藥檢所大量樣品短期內(nèi)復檢時，由于as基本一致，fk/s也是固定值，故可先以公式ak=asfk/s推算出定量因子ak，直接以待測樣品峰面積Ak′即可快速推測其量（Ck′=Ak′/ak）?？梢姌藴是€中各成分的斜率值實際上就是其定量因子。應(yīng)用此法需首先獲得as值，并保證as值恒定。定量因子ak僅對同一儀器在相同色譜條件下短期內(nèi)保持恒定，不同儀器應(yīng)分別建立。另外定量因子計算所用fk/s為斜率校正法所得，故其計算結(jié)果與斜率校正法一致。結(jié)果綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的定量因子分別為27 555 502.04、26 332 161.83、22 602 724.56、18 307 697.59、19 143 636.44。

2.6 fk/s的重現(xiàn)性考察本試驗考察了2套不同的色譜系統(tǒng)（LC-20AT、Waters e2695）及不同的色譜柱（Welchrom C18、UltimateAQ C18、Shin-pack GIST C18）對fk/s的影響。結(jié)果表明，各種條件下所得到的RSD值＜3.0%，本試驗條件下不同儀器及色譜柱對各成分fk/s無顯著影響。（見表4）

表4 不同儀器和不同色譜柱對fk/s的影響

2.7 待測組分色譜峰的定位利用相對保留時間進行定位，即以各待測組分色譜峰與綠原酸色譜峰的相對保留時間來確定。以綠原酸為基準峰，計算不同儀器和不同色譜柱下隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷相對保留時間。結(jié)果顯示各種條件下所得到的RSD＜5.0%，表明本方法利用綠原酸來定位不同成分色譜峰是可行的。（見表5）

表5 不同儀器和不同色譜柱下的各色譜峰相對保留時間

2.8 一測多評法與常規(guī)法測定結(jié)果的比較取5批清熱顆粒樣品，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定，記錄綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的峰面積，分別用外標法和3種一測多評法計算其含量，對比不同方法計算清熱顆粒指標成分含量的差異，結(jié)果顯示RSD均＜2%。說明一測多評法應(yīng)用于清熱顆粒多指標成分測定具有良好的準確定性，可信度較高。（見表6）

表6 清熱顆粒中5種成分不同方法定量測定結(jié)果（n=3）

3 討 論

3.1 指標性成分的選擇清熱顆粒臨床上常用于治療咽喉腫痛、上呼吸道感染、皮膚瘡癰腫毒、濕疹等。本課題組前期曾對崗梅[7-8]中的冬青苷B、香葉木素、東莨菪內(nèi)酯，蒲公英[9]中菊苣酸、咖啡酸，千里光[10]中金絲桃苷等成分進行檢測，但該色譜條件下未被檢出，推測該顆粒制備工藝中使用了醇沉工藝，導致部分化學成分流失。清熱顆粒組方中各味藥物均有抗炎、抑菌、抗病毒等功效。其中，綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷為抑菌、抗病毒的有效成分[11-13]，在清熱顆粒多味藥物中均有存在。其次秦皮乙素、蒙花苷分別為紫花地丁與野菊花中的特征性成分[14]，也是抑菌、抗炎、祛痰的有效成分[15-17]，故本研究選擇綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、秦皮乙素、蒙花苷等5個成分作為清熱顆粒質(zhì)量控制的指標性成分。

3.2 試驗方法的考察為了盡可能充分提取出清熱顆粒中的有效成分。本試驗前期考察了不同提取溶劑（100%、70%、50%甲醇）對指標性成分的影響，發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取較為充分，各指標性成分響應(yīng)較高。在此基礎(chǔ)上，本研究比較了超聲提取和回流提取兩種方式，發(fā)現(xiàn)兩者的提取率差異無統(tǒng)計學意義。而超聲提取的操作便捷，故確定供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲30 min。另外，在考察檢測波長時，由于綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷等5個成分的最大吸收波長均在300～350 nm[18-19]，當檢測波長為320 nm時，樣品中5種待測成分色譜峰的分離良好、峰面積較大，故本研究選擇320 nm為5種成分的檢測波長。同時預(yù)試驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液流動相系統(tǒng)在梯度洗脫條件下的分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇-水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，分離度較差，且各成分出峰時間較長，故本研究選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為該檢測條件的流動相。

3.3 3種一測多評法的比較本試驗考察了一測多評法fk/s的3種不同計算方式，其中多點校正法為近年來多數(shù)文獻所用，但由于其使用不同濃度參比對照溶液的峰面積計算其余成分的fk/s值，當參比對照溶液濃度較低或較高時，儀器容易產(chǎn)生檢測誤差，導致fk/s也有一定偏差。采用標準曲線斜率之比計算fk/s，系統(tǒng)誤差不容易對標準曲線斜率產(chǎn)生影響，準確度較高，且斜率法直接使用線性回歸方程中的斜率進行計算，相對更簡便。定量因子計算所用fk/s為斜率校正法所得，故其計算結(jié)果與斜率校正法一致，但由于不同儀器對同一成分檢測有一定差異，故每臺儀器需單獨建立相應(yīng)方法的定量因子，此方法在大量樣品短期內(nèi)復檢時較為簡便。

4 小 結(jié)

本試驗比較了外標法和3種一測多評法測定清熱顆粒指標成分的含量，3種一測多評法計算的結(jié)果與外標法無顯著差異，說明一測多評法測定清熱顆粒多指標成分與外標法具有良好的一致性，準確度較高，重現(xiàn)性較好，實際工作中可根據(jù)需要選擇適合的一測多評方法。此外，由于綠原酸對照品便宜易得，檢測成本較低，適用于醫(yī)院制劑日常檢驗工作中。綜上所述，一測多評法可用于清熱顆粒的質(zhì)量控制。