卵泡液回收加熱系統(tǒng)對體外受精-胚胎移植臨床結(jié)局的影響

侯明霞，葉飛，熊東升，劉偉信，曾玖芝，孫燕

母體子宮對于胚胎來說是一個(gè)恒溫恒濕的穩(wěn)定生理環(huán)境[1]。溫度作為培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵因素，過高、過低都會(huì)影響卵子和胚胎的發(fā)育，其中影響最顯著的是紡錘體穩(wěn)定性和胚胎代謝水平[2]。就目前的取卵方式而言，卵泡液在回收過程中流經(jīng)回收管時(shí)溫度不可避免會(huì)下降，因此在收取卵泡液時(shí)，維持卵泡液溫度在37℃，對胚胎后續(xù)發(fā)育至關(guān)重要。本研究自行設(shè)計(jì)一套卵泡回收加熱系統(tǒng)，以確保在獲取卵子過程中卵泡液溫度始終維持在37℃，探討在取卵過程中控制卵泡液的溫度變化對體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)臨床結(jié)局的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2020年6月至2021年10月在四川省婦幼保健院因輸卵管阻塞行IVF-ET治療的146例患者，將其按來院就診次序隨機(jī)分為對照組和研究組，每組73例(利用PASS15軟件計(jì)算得到對照組和研究組樣本數(shù)為n1=n2=58例，考慮到患者退出情況則需樣本量n1=n2=58/0.8≈73例)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 患者年齡<35歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)18～25 kg/m2；② 月經(jīng)周期規(guī)律(22～35 d)；③ 既往無卵巢手術(shù)史、B 超檢查雙側(cè)卵巢外觀正常,無輸卵管積水及多囊卵巢綜合征病史；④ 無影響卵巢功能的內(nèi)分泌疾??；⑤ 丈夫精液檢查正常。

1.2 試劑耗材

試劑均購買于COOK公司，耗材購買于美國BD FALCON公司。卵泡液回收加熱系統(tǒng)由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，廣州品知醫(yī)療器械有限公司按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)生產(chǎn)出成品(見圖1)。

注：1.保溫套；2.卡槽；3.魔術(shù)貼(31.魔術(shù)貼勾面；32.魔術(shù)貼毛面)；4.套環(huán)；5.加熱頭；6.電線；7.加熱器連接頭

1.3 研究方法

對照組按照常規(guī)取卵步驟操作。研究組在常規(guī)取卵基礎(chǔ)上增加卵泡回收加熱系統(tǒng)進(jìn)行操作：將卵泡回收加熱系統(tǒng)安裝在卵泡回收系統(tǒng)輸送軟管上，溫度設(shè)定在38.6℃，然后模擬取卵過程將37℃生理鹽水作為卵泡液通過卵泡液回收加熱系統(tǒng)抽吸到14 mL圓底試管，此時(shí)測定圓底試管中生理鹽水溫度為37℃，因此卵泡回收加熱系統(tǒng)在使用時(shí)溫度應(yīng)設(shè)置為38.6℃。

根據(jù)患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平、卵巢儲(chǔ)備等情況按照常規(guī)促排卵方案，當(dāng)1～2枚卵泡直徑≥18 mm時(shí)注射重組人絨毛膜促性腺激素 (recombinant human chorio gonadotropin，rhCG，艾澤，德國默克雪蘭諾)，36．5～37.0 h 陰道B超引導(dǎo)下取卵，所獲卵母細(xì)胞短時(shí)受精 4 h后去除顆粒細(xì)胞觀察受精情況。將受精卵培養(yǎng)皿置于時(shí)差監(jiān)控培養(yǎng)箱(6.0% CO2，5% O2，37.0℃)培養(yǎng)，D3均選擇來源于2PN胚胎 1～2枚進(jìn)行移植，剩余可利用胚胎換液后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)至D6，記錄囊胚形成情況。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察記錄正常受精率、多PN受精率、卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、臨床結(jié)局以及胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)。胚胎動(dòng)力學(xué)利用時(shí)差監(jiān)控系統(tǒng)記錄胚胎從原核發(fā)育至不同細(xì)胞期所需時(shí)間，其指標(biāo)如下：發(fā)育至 2 細(xì)胞的時(shí)間為 t2，發(fā)育至4細(xì)胞的時(shí)間為 t4，發(fā)育至5細(xì)胞的時(shí)間為 t5,發(fā)育至8細(xì)胞的時(shí)間為 t8。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者年齡、不孕年限、BMI、總Gn量、總Gn天數(shù)和移植胚胎數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較

研究組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組正常受精率、多PN受精率、卵裂率、囊胚形成率以及優(yōu)質(zhì)囊胚率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但研究組卵裂率、囊胚形成率有升高趨勢，并且多PN受精率有所下降，詳見下頁表2。

表2 兩組患者胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較

2.3 兩組患者胚胎發(fā)育速率比較

兩組患者胚胎發(fā)育速率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表3。

表3 兩組患者胚胎發(fā)育速率比較

3 討論

胚胎體外培養(yǎng)涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，從卵泡液離開卵泡開始，各種外部環(huán)境開始影響卵子和胚胎質(zhì)量，而胚胎質(zhì)量將直接影響移植后的臨床結(jié)局。除去配子和胚胎本身質(zhì)量外，影響它們的外部因素有很多，從實(shí)驗(yàn)室角度，主要有操作因素、環(huán)境因素等，其中環(huán)境因素最為復(fù)雜，比如環(huán)境溫度、濕度等。由于監(jiān)控的節(jié)點(diǎn)較多，目前胚胎實(shí)驗(yàn)室廣泛關(guān)注的是胚胎培養(yǎng)過程中的環(huán)境控制，尤其是培養(yǎng)過程中溫度的監(jiān)控，而常常忽略卵泡液獲取過程中溫度的控制和監(jiān)測。本中心以37℃生理鹽水模擬卵泡液，然后模擬卵泡液獲取整個(gè)流程發(fā)現(xiàn)，37℃的生理鹽水經(jīng)過常規(guī)卵泡回收系統(tǒng)流入14 mL圓底試管后，溫度會(huì)降至34℃～34.5℃。因此，本研究關(guān)注于該過程中溫度的控制，自行設(shè)計(jì)和組裝一套簡易的卵泡回收加熱系統(tǒng)用于卵泡液回收過程中溫度的控制，探究卵泡液回收過程中溫度對胚胎質(zhì)量以及臨床結(jié)局的影響。

溫度對胚胎發(fā)育有至關(guān)重要的影響，人體的基礎(chǔ)體溫是37℃，常規(guī)理論認(rèn)為，37℃是配子體外受精和發(fā)育的最適溫度(輸卵管溫度和宮腔溫度)[3-4]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，人卵泡液內(nèi)溫度低于37℃，大約低2.3℃，因此，理論上認(rèn)為36℃更接近生殖道溫度，也許更有利于胚胎發(fā)育[5]。不過，Hong KH等[6]一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)對照研究認(rèn)為，在控制培養(yǎng)箱溫度波動(dòng)、類型及pH值等因素后，37℃培養(yǎng)的胚胎與36℃相比，第3天細(xì)胞數(shù)更多，囊胚形成率更高，而著床率和非正整倍體率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而低溫對配子和胚胎的影響是明確的，在小鼠卵母細(xì)胞中，從37℃分別冷卻至25℃、18℃或4℃會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂紡錘體的微管破裂；當(dāng)溫度恢復(fù)到37℃時(shí)，這種破壞就會(huì)逆轉(zhuǎn)[7]。相比之下，人類卵母細(xì)胞冷卻至室溫會(huì)導(dǎo)致紡錘體的破壞且不可逆轉(zhuǎn)[8]。Sherbahn R[9]的研究結(jié)果顯示，取卵時(shí)卵泡液溫度超過36.4℃～36.9℃這一范圍，將影響胚胎囊胚形成率、著床率及活產(chǎn)率，提示配子及胚胎在體外離開培養(yǎng)箱后，溫度降至36.4℃下，可能對胚胎后期發(fā)育產(chǎn)生影響。

目前尚不清楚溫度變化是否會(huì)影響胚胎植入或活產(chǎn)?，F(xiàn)有的研究表明，體外培養(yǎng)條件(包括溫度)可能會(huì)影響胚胎植入前的有絲分裂非整倍性或嵌合比例[10-11]。Walters EA等[12]認(rèn)為現(xiàn)有的研究并不支持胚胎培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)溫度，在37.0℃的穩(wěn)定溫度下進(jìn)行培養(yǎng)可能更穩(wěn)妥。

本研究利用卵泡回收加熱系統(tǒng)對卵泡液從卵泡到取卵管這個(gè)過程溫度的控制，發(fā)現(xiàn)D3優(yōu)質(zhì)胚胎率(62.36%)和臨床妊娠率(57.78%)較對照組(43.87%，46.51%)有明顯提高，囊胚形成率、卵裂率有升高的趨勢。但胚胎動(dòng)力學(xué)觀察未發(fā)現(xiàn)兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究表明36℃培養(yǎng)和37℃培養(yǎng)胚胎，移植后妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但過低溫度卵裂率和妊娠率顯著下降[13-17]。

綜上所述，雖然最適宜的胚胎培養(yǎng)溫度還有爭議，但目前大家公認(rèn)的配子和胚胎維持溫度是37℃，所以應(yīng)當(dāng)在每一個(gè)環(huán)節(jié)對溫度做好控制和監(jiān)測。本研究在取卵過程中實(shí)施的保溫措施僅是初步探索，還需要增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證該項(xiàng)保溫措施對胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響。