周韓玲,安明哲,趙 東,喬宗偉,廖勤儉,郭 艷,李楊華
(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓 644007)
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)又稱尿烷,是一種具有遺傳毒性且多位點(diǎn)致癌的化合物。2007年,世界衛(wèi)生組織的國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)將EC歸為2A類致癌物[1-2]。EC廣泛存在于發(fā)酵食品和飲料酒中[3-4],其中,飲料酒中EC含量較高[5-6]。飲料酒中EC的形成途徑主要有兩種:①酸性環(huán)境下,由原料帶入及L-精氨酸經(jīng)酵母菌代謝所產(chǎn)生的尿素與乙醇反應(yīng)生成EC[7-8];②生氰糖苷經(jīng)酶解或熱裂解生成氰醇,氰醇進(jìn)一步分解生成氫氰酸,氫氰酸在Cu(II)的催化下(無(wú)催化劑Cu(II)且酸性條件下反應(yīng)較慢)生成氰酸鹽,最終與乙醇反應(yīng)生成EC[9-10]。
白酒是以糧谷為主要原料,以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑,經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的飲料酒[11-12]。因釀造原料、生產(chǎn)工藝等原因,白酒中含有一定量的EC[13-14]。加拿大、捷克和日本等國(guó)家針對(duì)蒸餾酒中EC制訂的限量標(biāo)準(zhǔn)為150 μg/L,EC已成為我國(guó)白酒走向國(guó)際化的技術(shù)壁壘之一。如何降低白酒中EC含量,提高產(chǎn)品品質(zhì),打破貿(mào)易壁壘并走向國(guó)際化,是行業(yè)面臨的共性問(wèn)題[15-16]。
白酒中EC生成機(jī)理復(fù)雜,高曉娟等[17]研究了清香型白酒貯存過(guò)程中EC的變化規(guī)律,結(jié)果表明,在發(fā)酵、蒸酒過(guò)程中只有少量的EC形成,清香型白酒中EC急劇增加的環(huán)節(jié)是貯存階段。張順榮[18]研究了不同香型原酒貯存過(guò)程中EC、氰化物和尿素的含量,并采用同位素示蹤法研究了原酒貯存期間EC形成的主要前體,結(jié)果表明:白酒貯存過(guò)程中EC形成的主要前體物是氰化物。白酒釀造的重要原料高粱是一種含生氰糖苷的作物,生氰糖苷在高粱中以蜀黍氰苷的形式存在[19],高粱中的蜀黍氰苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解或者高溫酸解之后生成β-D-葡萄糖和不穩(wěn)定的對(duì)羥基-(S)-扁桃腈,對(duì)羥基-(S)-扁桃腈在內(nèi)源性α-羥基裂解酶或堿性條件下分解生成對(duì)羥基苯甲醛和氰化物,因沸點(diǎn)較低,在蒸酒過(guò)程中,氰化物極易進(jìn)入到酒體中[20-23]。
作為中國(guó)三大主要香型白酒之一,濃香型白酒具有窖香濃郁、綿甜醇厚、協(xié)調(diào)爽凈等特點(diǎn)[24],是市場(chǎng)占有率最高、消費(fèi)人群最多的白酒[25]。本研究通過(guò)水解試驗(yàn)、模擬蒸酒試驗(yàn)和釀酒試驗(yàn),探究高粱中蜀黍氰苷與濃香型白酒中氰化物、EC之間的關(guān)系。旨在從原料控制角度探討濃香型白酒中氰化物、EC的控制方法,為白酒生產(chǎn)企業(yè)降低酒體中EC含量、提高產(chǎn)品質(zhì)量安全水平、應(yīng)對(duì)國(guó)際食品安全發(fā)展形勢(shì)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。
氨基甲酸乙酯(99%):梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;D5-氨基甲酸乙酯(98%)、蜀黍氰苷(95%):美國(guó)Sigma-Aldrich公司;水中氰標(biāo)準(zhǔn)溶液(CN-質(zhì)量濃度為50 mg/L):中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;正己烷、乙酸乙酯(均為色譜純)、乙酸鋅(分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙醚(色譜純)、磷酸、酒石酸、氫氧化鈉、氯胺T(均為分析純):成都市科隆化學(xué)品有限公司;甲醇(色譜純):德國(guó)Merck公司。
高粱樣品(編號(hào)為S1~S10),S1高粱:產(chǎn)地為中國(guó)西南地區(qū),S2~S4高粱:產(chǎn)地為中國(guó)西北地區(qū),S5~S8高粱:產(chǎn)地為中國(guó)東北地區(qū),S9~S10高粱:產(chǎn)地為澳大利亞;五糧濃香型白酒出窖糟醅、糠殼、中高溫大曲:宜賓地區(qū)某酒廠提供。
7890A型氣相色譜儀、7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)Agilent公司;ExionLC-5500型三重四級(jí)桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)AB Sciex公司;DMA 35型手持式密度計(jì):奧地利安東帕公司;SBEQ-CG1012型固相萃取裝置:上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;SHB ⅢA型循環(huán)水式真空泵:杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司;TTL-DCⅡ型氮吹儀:北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;Milli-Q型超純水儀:美國(guó)Millipore公司;ML1602型百分之一分析天平、AE200型萬(wàn)分之一分析天平:美國(guó)梅特勒-托利多公司;LRH-250型生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FSJ-Ⅱ型錘片式糧食粉粹機(jī):中儲(chǔ)糧成都糧食貯藏科學(xué)研究院;YM-060S型超聲波清洗機(jī):深圳市雨盟超聲波清洗機(jī)設(shè)備廠;DL-1型萬(wàn)用電爐:北京市永光明醫(yī)療儀器廠。
1.3.1 水解試驗(yàn)
分別將10種高粱(S1~S10)粉粹,過(guò)120目篩,每種樣品稱取1.50 g,分別采用20 mL甲醇水溶液(95∶5,V/V)超聲提取1 h,8 000 r/min離心10 min,取上清液0.4 mL,用超純水稀釋3倍,經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)三重四級(jí)桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,測(cè)量并計(jì)算10種高粱中蜀黍氰苷含量[26]。
參考GB 5009.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測(cè)定》[27]中方法對(duì)高粱進(jìn)行酸水解:稱取S1高粱粉10.00 g(以絕干計(jì))于全玻璃蒸餾器的500 mL燒瓶中,加入200 mL蒸餾水,塞嚴(yán)瓶口,攪拌2 h后加入20 mL 100 g/L的乙酸鋅溶液和2.00 g酒石酸后迅速連接好蒸餾裝置,將與冷凝管下端相連的乳膠軟管插入盛有10 mL 20 g/L氫氧化鈉溶液的200 mL容量瓶中,進(jìn)行蒸餾,收集蒸餾液約190 mL時(shí)停止加熱,以蒸餾水定容至200 mL,混勻。按上述方法依次對(duì)S2~S10高粱進(jìn)行水解,每種高粱各進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定餾出液中氰化物含量,方法參照GB 5009.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測(cè)定》中氣相色譜法,對(duì)高粱粉中蜀黍氰苷含量及其水解餾出液中氰化物含量進(jìn)行直線回歸和雙變量相關(guān)分析。
1.3.2 模擬蒸酒試驗(yàn)
分別以1.3.1中的蜀黍氰苷含量最低的S1高粱粉(739 μg/kg,以絕干計(jì))和蜀黍氰苷含量最高的S2高粱粉(9 160 μg/kg,以絕干計(jì))為原料,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室模擬蒸酒試驗(yàn)。取固態(tài)白酒出窖糟醅10.5 kg,充分拌勻,分別設(shè)置空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)。
空白組:稱取1 000.00 g出窖糟醅,放置1 h;
實(shí)驗(yàn)組:稱取1 000.00 g出窖糟醅,加入S1高粱粉150.00 g(以絕干計(jì)),混勻,潤(rùn)糧1 h;
對(duì)照組:稱取1 000.00 g出窖糟醅,加入S2高粱粉150.00 g(以絕干計(jì)),混勻,潤(rùn)糧1 h。
向空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組酒糟中各加入糠殼30.00 g,拌勻,分別采用實(shí)驗(yàn)室小型蒸酒裝置進(jìn)行蒸餾,分段接餾分酒,每段接取100 mL,各接取4段,分別以D1、D2、D3和D4表示,空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),采用氣相色譜法[27]測(cè)定餾分酒中氰化物含量。
1.3.3 釀酒試驗(yàn)
釀酒原料的組成為:高粱36%,大米22%,糯米18%,小麥16%,玉米8%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。按以下步驟進(jìn)行釀酒試驗(yàn):選擇宜賓地區(qū)某酒廠小試基地6口正常生產(chǎn)的小窖池(長(zhǎng)、寬、高均為1.2 m),以其中3口作為實(shí)驗(yàn)組,編號(hào)分別為1號(hào)窖、2號(hào)窖和3號(hào)窖,以另外3口作為對(duì)照組,編號(hào)分別為4號(hào)窖、5號(hào)窖和6號(hào)窖。配制原料以備用:(1)實(shí)驗(yàn)組原料:采用S1高粱作為原料,按照配比加入另4種原料后粉碎;(2)對(duì)照組原料:采用S2高粱作為原料,加入和實(shí)驗(yàn)組相同的另4種原料后粉碎。
第一輪釀酒試驗(yàn):將實(shí)驗(yàn)組1號(hào)窖和對(duì)照組4號(hào)窖中的出窖糟醅全部起出置于一起,充分拌勻后平均分成兩部分,一半加入實(shí)驗(yàn)組原料后拌勻潤(rùn)糧,加糠殼拌勻,物料上甑,蒸酒蒸糧(實(shí)驗(yàn)組第一輪酒取樣),物料出甑,打量水,攤晾下曲,入1號(hào)窖池發(fā)酵;另一半加入對(duì)照組的原料后拌勻潤(rùn)糧,加糠殼拌勻,物料上甑,蒸酒蒸糧(對(duì)照組第一輪酒取樣),物料出甑,打量水,攤晾下曲,入4號(hào)窖池發(fā)酵。按照此方法依次完成2號(hào)窖、5號(hào)窖及3號(hào)窖和6號(hào)窖的全部實(shí)驗(yàn)。
第二輪釀酒試驗(yàn):發(fā)酵60 d后,實(shí)驗(yàn)組:將1號(hào)窖池中的糟醅起出,加入實(shí)驗(yàn)組原料后拌勻潤(rùn)糧,加糠殼拌勻,物料上甑,蒸酒蒸糧(實(shí)驗(yàn)組第二輪酒取樣),物料出甑,打量水,攤晾下曲,入1號(hào)窖池發(fā)酵。對(duì)照組:將4號(hào)窖池中的糟醅起出,加入對(duì)照組的原料后拌勻潤(rùn)糧,加糠殼拌勻,物料上甑,蒸酒蒸糧(對(duì)照組第二輪酒取樣),物料出甑,打量水,攤晾下曲,入4號(hào)窖池發(fā)酵。按照此方法依次完成2號(hào)窖、5號(hào)窖及3號(hào)窖和6號(hào)窖的全部實(shí)驗(yàn)。
第三輪釀酒試驗(yàn):按第二輪釀酒試驗(yàn)步驟完成第三輪釀酒試驗(yàn)和取樣。
白酒蒸餾出來(lái)后,測(cè)定原酒酒精度和酒中氰化物含量,按GB 5009.223—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》方法測(cè)定EC含量[28],將所有酒樣置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯存,分別于第10天、第20天時(shí)測(cè)定原酒中氰化物和EC含量,之后每隔30 d測(cè)定一次氰化物和EC含量,總監(jiān)測(cè)時(shí)間為350 d。
1.3.4 數(shù)據(jù)處理
采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析,并使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,重復(fù)試驗(yàn)3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”()表示。
本試驗(yàn)將10種高粱粉碎,過(guò)120目篩,高粱粉粒度較小,再采用蒸餾水?dāng)嚢杞? h,讓高粱中蜀黍氰苷溶解到蒸餾水中,加入乙酸鋅溶液和酒石酸,進(jìn)行酸水解,讓蜀黍氰苷充分轉(zhuǎn)化為氫氰酸,氫氰酸沸點(diǎn)較低,蒸餾過(guò)程中極易被蒸出,以氫氧化鈉溶液吸收后測(cè)定餾出液中氰化物含量,結(jié)果見(jiàn)表1,對(duì)高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量進(jìn)行直線回歸和雙變量相關(guān)分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。
表1 高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量Table 1 Content of dhurrin in sorghum powder and cyanide in its hydrolytic distillate μg/kg
圖1 高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量的相關(guān)曲線Fig.1 Correlation curve of dhurrin content in sorghum powder and cyanide content in hydrolysis distillate
由表1可知,10種高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量具有一定的差異性,其中,S1高粱中蜀黍氰苷含量最低,平均值為739 μg/kg,S2高粱中蜀黍氰苷含量最高,平均值為9 160 μg/kg。由圖1可知,高粱中蜀黍氰苷含量與其水解生成的氰化物呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2為0.892 6),說(shuō)明高粱中蜀黍氰苷水解可生成氰化物,且高粱中蜀黍氰苷含量與其水解所生成的氰化物總量呈正相關(guān)。
在實(shí)驗(yàn)室采用小型蒸酒裝置進(jìn)行蒸酒試驗(yàn),糟醅量較少,蒸餾速度快,測(cè)定各段餾分酒中氰化物含量并進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 各段餾出酒中氰化物含量Table 2 Cyanide content in distillates of each stage μg/kg
由表2可知,空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各段餾分酒中氰化物含量變化趨勢(shì)一致,前段餾分酒(D1)中氰化物含量最高,隨著蒸餾的進(jìn)行,餾分酒中氰化物快速降低,末段餾分酒(D4)中氰化物含量最低。從表2還可看出,實(shí)驗(yàn)組各段餾分酒中氰化物含量顯著低于對(duì)照組中相對(duì)應(yīng)餾分酒中氰化物含量(P<0.01)。餾分酒中的氰化物主要來(lái)自于兩個(gè)方面:①糟醅中由β-葡萄糖苷酶水解所生成的氰化物在蒸酒時(shí)進(jìn)入到餾分酒中;②高粱粉中的蜀黍氰苷在高溫下發(fā)生酸水解,最終生成氰化物,蒸酒時(shí)進(jìn)入到餾分酒中。本試驗(yàn)的空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所使用的出窖糟醅相同,餾出酒中來(lái)自于糟醅的氰化物相同,排除了基底干擾,引起餾分酒中氰化物含量差別大的主要因素是原料,實(shí)驗(yàn)組所使用的S1高粱蜀黍氰苷含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組所使用的S2高粱,其蜀黍氰苷水解所生成的氰化物含量也相應(yīng)低于S2高粱。
采用手持式密度計(jì)測(cè)定三輪釀酒試驗(yàn)原酒的酒精度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),原酒酒精度差別較小,約為71%vol。監(jiān)測(cè)第一輪、第二輪、第三輪酒樣中氰化物和EC含量,結(jié)果分別見(jiàn)圖2A、圖2B和圖2C。
圖2 三輪釀酒試驗(yàn)原酒中氰化物和氨基甲酸乙酯含量的變化Fig.2 Changes of cyanide and EC contents in base Baijiu of three rounds of brewing tests
從圖2A~2C可看出,三輪釀酒試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組原酒中氰化物降低趨勢(shì)一致,EC上升趨勢(shì)也相一致:原酒中初始氰化物含量較高,隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng),酒體中氰化物含量急劇降低,貯存前10 d,氰化物降低速度最快,其后降低速度有所減緩,貯存50~80 d時(shí),酒中氰化物檢出值極低;實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組剛蒸餾出來(lái)的原酒中EC含量均較低,約為20~40 μg/kg,隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng),酒體中EC含量緩慢上升,貯存350 d時(shí),所有原酒樣品中EC含量達(dá)到了相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài),原酒中絕大部分EC是在貯存過(guò)程中生成的,這與高曉娟等[17]的貯存階段是清香型白酒中EC急劇增加環(huán)節(jié)的研究發(fā)現(xiàn)相似。從圖2B和圖2C可看出,6號(hào)窖池的第二輪酒、3號(hào)窖池及4號(hào)窖池的第三輪酒中EC生成速度比其他酒樣快,酒體中EC達(dá)到平衡狀態(tài)所需時(shí)間比其他酒樣短,表明EC的生成還有其他影響因素。從圖2A~2C還可看出,三輪釀酒試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組原酒中氰化物初始含量低于對(duì)照組原酒中氰化物初始含量,達(dá)到了相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)(貯存350 d),實(shí)驗(yàn)組原酒中EC含量低于對(duì)照組原酒中EC含量。
對(duì)原酒中氰化物初始含量和貯存350 d時(shí)EC值進(jìn)行直線回歸和雙變量相關(guān)分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,原酒中氰化物初始含量和貯存350 d時(shí)EC值線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2=0.966 9,二者在0.01水平上顯著相關(guān),說(shuō)明在原酒貯存過(guò)程中,氰化物是EC的重要前體物。
圖3 原酒中氰化物初始含量和貯存350 d時(shí)氨基甲酸乙酯含量的相關(guān)曲線Fig.3 Correlation curve of initial cyanide content in base Baijiu and ethyl contents at 350 d of storage
在第一輪釀酒試驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組1號(hào)窖和對(duì)照組的4號(hào)窖出窖糟相同,實(shí)驗(yàn)組2號(hào)窖和對(duì)照組的5號(hào)窖出窖糟相同,實(shí)驗(yàn)組3號(hào)窖和對(duì)照組的6號(hào)窖出窖糟相同,相對(duì)應(yīng)窖池的第一輪酒中來(lái)自于出窖糟醅的氰化物也相同,引起酒體中氰化物含量不同的主要因素是釀酒原料,實(shí)驗(yàn)組采用的高粱原料為蜀黍氰苷含量低的S1高粱,對(duì)照組采用的高粱原料為蜀黍氰苷含量高的S2高粱,S1高粱水解所生成的氰化物也低于S2高粱,因此,實(shí)驗(yàn)組各窖池原酒中氰化物初始含量均低于對(duì)照組相應(yīng)窖池原酒中氰化物初始值,貯存350 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組各窖池原酒中EC含量低于對(duì)照組相應(yīng)窖池原酒中EC含量。
在第二輪釀酒試驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組原酒中氰化物初始含量和達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)EC含量差別更大。引起酒體中氰化物初始含量不同的主要因素有兩個(gè):①酒體中來(lái)自于糟醅的氰化物不同。第二輪酒的出窖糟醅由兩部分組成,一部分是循環(huán)發(fā)酵的母糟,另一部分是上一輪糧食發(fā)酵形成的糟醅;②蒸酒過(guò)程中,酒體中來(lái)自于原料的氰化物不同。因?qū)嶒?yàn)組持續(xù)采用S1高粱作為高粱原料,對(duì)照組則采用S2高粱作為高粱原料,在第三輪釀酒試驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組原酒中氰化物含量差別繼續(xù)擴(kuò)大,EC含量差別也進(jìn)一步增大,實(shí)驗(yàn)組原酒中來(lái)自于糟醅部分的氰化物幾乎全部由S1高粱及另四種原料發(fā)酵所形成的糟醅所貢獻(xiàn),對(duì)照組原酒中來(lái)自于糟醅部分的氰化物則幾乎全部由S2高粱和另四種原料發(fā)酵所形成的糟醅所貢獻(xiàn)。
高粱是白酒釀造的重要原料,本研究以不同高粱為對(duì)象,分別進(jìn)行了水解試驗(yàn)、模擬蒸酒試驗(yàn)和釀酒試驗(yàn),探索了高粱中蜀黍氰苷與濃香型白酒中氰化物、EC之間的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明:高粱中蜀黍氰苷含量與其水解所生成的氰化物總量呈正相關(guān),采用蜀黍氰苷含量低的高粱作為釀酒原料時(shí),酒中氰化物含量較低,EC生成量也較少,濃香型白酒中絕大部分EC是在貯存過(guò)程中生成的,氰化物是EC的重要前體物。
濃香型白酒釀造工藝復(fù)雜,生產(chǎn)周期長(zhǎng),酒體中微量成分多,EC研究難度較大。本研究發(fā)現(xiàn)濃香型白酒中絕大部分EC是在貯存過(guò)程中生成的,因此,研究者在探索濃香型白酒中EC生成機(jī)理時(shí),可重點(diǎn)關(guān)注貯存階段。感官風(fēng)味是白酒香型判別和品質(zhì)鑒定的重要基礎(chǔ),中國(guó)白酒香型眾多,每一種香型的白酒都有其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝,研究者在探索白酒中EC控制措施時(shí),應(yīng)以不改變?cè)猩a(chǎn)工藝、不影響酒體風(fēng)格為前提。
本研究首次從生產(chǎn)水平上證實(shí)了高粱中蜀黍氰苷是濃香型白酒中EC的一個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn),濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)采用蜀黍氰苷含量低的高粱作為釀酒原料,可有效降低酒中氰化物和EC含量。本研究為濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)控制酒體中EC含量、提高產(chǎn)品安全水平提供了實(shí)踐依據(jù),也為其他香型白酒EC控制提供了參考。