漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離純化天麻素及其熱力學(xué)研究

曾 磊，易馮梅，曹 宇，史伯安,, 雷福厚*

(1.廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院；廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；林產(chǎn)化學(xué)與工程國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530006；2.湖北民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000)

天麻為蘭科植物天麻的干燥塊莖，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，是中醫(yī)用于治療小兒驚風(fēng)、癲癇、肢體麻木、風(fēng)濕痹痛、頭痛等病癥的常用藥物[1]。天麻素(GAS)是天麻的有效活性成分之一，化學(xué)名稱為4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，又名天麻苷。由于該化合物是一種良好的鈣離子通道阻滯劑，在臨床上常用于治療神經(jīng)系統(tǒng)[2-4]和心腦血管方面疾病[5-6]。隨著天麻素研究的不斷深入，新的藥用價(jià)值也不斷被開發(fā)出來，如抑制肝細(xì)胞凋亡、改善肝臟病例變化[7]，抑制人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷[8]，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎[9]和骨質(zhì)疏松癥[10]具有治療作用，因而具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。目前許多天麻藥品和制品直接以天麻全品生產(chǎn)，這不利于控制產(chǎn)品質(zhì)量[11]。因此，對(duì)天麻產(chǎn)品的開發(fā)需要向深加工和精制方面發(fā)展，實(shí)現(xiàn)其高質(zhì)化利用、提升其附加值[12]。天麻素提取效率的提高對(duì)天麻藥物的生產(chǎn)和研發(fā)具有重要的意義。高效液相色譜(HPLC)法作為一種高效、快速、檢測(cè)靈敏、條件溫和的分離方法具有廣泛的適用性[13]。在液相色譜(LC)中，色譜柱作為色譜系統(tǒng)的核心部件對(duì)物質(zhì)的分離起到關(guān)鍵性的作用[14]。除此之外，色譜分離條件同樣也會(huì)對(duì)色譜柱的分離性能造成影響，例如流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫等因素[15]。本研究利用自制的漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)中藥天麻的主要活性成分天麻素進(jìn)行分離純化，以天麻素的結(jié)構(gòu)類似物苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PGL)和4-甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(MGL)作為競(jìng)爭(zhēng)分子，考察漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)天麻素的分離性能，并利用 Van’t Hoff 方程對(duì)其分離過程的熱力學(xué)進(jìn)行研究，以期為天麻素的分離純化提供一種新的思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

天麻(GastrodiaelataBl.)干樣，湖北恩施。磷酸、無水乙醇和石油醚，分析純；尿嘧啶、天麻素(GAS)、苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PGL)和4-甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(MGL)，均為分析標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC，≥98%)，阿拉丁試劑公司；乙腈，色譜純；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

漆酚酯鍵合SiO2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，實(shí)驗(yàn)室自制[16]；WR5-3838 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，LC-15C高效液相色譜(HPLC)儀，LC-20AR制備型HPLC儀，日本島津公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物(結(jié)構(gòu)式見圖1)5.0 mg，用乙腈-0.05%磷酸水溶液(體積比3∶97，下同)溶解，配置成0.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別量取1 mL的3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合后定容至10 mL，放置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 天麻素及其衍生物結(jié)構(gòu)式

1.3 天麻粗提物的制備

將天麻干樣粉碎后過0.15 mm篩網(wǎng)，并在50 ℃條件下真空干燥8 h。稱取50 g天麻粉末，在70 ℃的溫度下，用200 mL 60%乙醇溶液提取3次，每次2 h，抽濾除掉濾渣，合并3次粗提液，用石油醚萃取脫脂后旋蒸濃縮，制得天麻粗提物。取天麻粗提物15.0 mg，用流動(dòng)相溶液定容至50 mL，配置的溶液經(jīng)微孔濾膜過濾后，得到天麻粗提物溶液。

1.4 天麻素的純化

將漆酚酯鍵合SiO2色譜柱接入LC-20AR高效液相色譜儀中，在以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm、流速0.4 mL/min、進(jìn)樣量20 μL、柱溫25 ℃的色譜條件下進(jìn)行分離純化。通過餾分收集器收集天麻素的餾分，將餾分濃縮后用C18柱檢測(cè)其純化效果(流速為1.0 mL/min，其他色譜條件同漆酚酯鍵合SiO2色譜柱)。

1.5 熱力學(xué)研究

為了探究天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物在漆酚酯鍵合SiO2色譜柱上的分離機(jī)理，研究了25～45 ℃范圍內(nèi)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物的熱力學(xué)行為。通過Van’t Hoff方程計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)[17-19]，計(jì)算公式見式(1)和(2)：

(1)

(2)

式中：k—溶質(zhì)的保留因子；α—相鄰兩種物質(zhì)之間的分離因子；R—?dú)怏w常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；T—柱溫，K；ΔH—溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配的焓變值，kJ/mol；ΔS—溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配的熵變值,J/(mol·K)；ΔΔH—待分離組分在固定相和流動(dòng)相之間分配的焓變的差值,kJ/mol；ΔΔS—待分離組分在固定相和流動(dòng)相之間分配的熵變的差值,J/(mol·K)；φ—相比，即固定相與流動(dòng)相的體積比值(Vs/Vm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 漆酚酯鍵合SiO2色譜柱的分離性能

由于漆酚酯鍵合SiO2色譜柱與C18柱同為反相色譜柱，并且具有烷基疏水長(zhǎng)側(cè)鏈，所以在流動(dòng)相的選擇上參考了藥典[1]的方法。以乙腈-0.05%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，磷酸起到調(diào)節(jié)色譜峰峰型的作用，乙腈起到調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫能力。在流速為1.0 mL/min、進(jìn)樣量為20 μL、柱溫為25 ℃和檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm條件下，其分離色譜圖見圖2，PGL-GAS的分離度為6.09；MGL-GAS的分離度為10.95，表明在該色譜條件下漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物表現(xiàn)出良好的分離性能。

2.2 色譜條件對(duì)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離性能的影響

2.2.1柱溫 以乙腈-0.05%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，在流速0.4 mL/min的條件下，考察了柱溫對(duì)色譜柱分離性能的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 柱溫對(duì)天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物分離度的影響

由圖可知，隨著柱溫的升高，漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物的保留能力有所減弱。從動(dòng)力學(xué)角度分析，溫度的升高會(huì)降低流動(dòng)相的黏度，導(dǎo)致傳質(zhì)阻力下降，提升柱效，有利于分離。從熱力學(xué)角度分析，較高的溫度削弱了溶質(zhì)與固定相之間的作用力，導(dǎo)致溶質(zhì)的保留時(shí)間和保留因子降低，不利于分離[18]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在分離過程中隨著柱溫升高，分析物的保留因子與分離度均有所下降，表明溫度對(duì)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離選擇性的影響強(qiáng)于其對(duì)色譜柱柱效的影響[19]，因此選擇25 ℃作為分離柱溫。

2.2.2流速 由于流速較大洗脫能力較強(qiáng)，削弱了天麻素及其競(jìng)爭(zhēng)分子與固定相之間的作用力，所以固定相對(duì)天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物的保留能力較弱，導(dǎo)致出峰時(shí)間較早。考慮到天麻粗提物中存在許多雜質(zhì)和其他物質(zhì)，過早出峰不利于其分離和純化。為了優(yōu)化天麻素的出峰時(shí)間，通過調(diào)節(jié)流速來調(diào)控天麻素的出峰時(shí)間。在柱溫為25 ℃條件下，流速對(duì)天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物分離度的影響結(jié)果見圖4(a)。

由圖可知，隨著流速的降低，天麻素與兩組競(jìng)爭(zhēng)分子的分離度逐漸升高，流速為0.4 mL/min時(shí)分離度最大，其色譜分離圖如圖4(b)所示。當(dāng)流速降到0.3 mL/min時(shí)，分離度有所降低。這是由于洗脫能力下降后，分子擴(kuò)散較為嚴(yán)重，色譜峰峰型變寬從而導(dǎo)致分離度下降。通過降低流速可以調(diào)整出峰時(shí)間，當(dāng)流速降為0.4 mL/min時(shí)分離度最大且峰型未發(fā)生明顯的改變，因此選擇0.4 mL/min作為分離流速。此時(shí)，色譜柱對(duì)PGL-GAS和MGL-GAS的分離度分別達(dá)到7.8和14.0。

圖4 流速對(duì)天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物分離度的影響(a)及其在0.4 mL/min時(shí)的分離色譜(b)

2.3 漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離純化天麻素

2.3.1分離純化效果分析 以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速為0.4 mL/min的色譜條件下，測(cè)試漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)天麻粗提物的分離性能，結(jié)果見圖5(a)。

1.粗提物crude extract; 2.標(biāo)準(zhǔn)品standard

由圖可知，天麻粗提物經(jīng)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離后，出現(xiàn)5個(gè)特征色譜峰，其中響應(yīng)值最強(qiáng)的色譜峰與天麻素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間一致?？梢钥闯?，漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)天麻粗提物表現(xiàn)出良好的分離性能，為后續(xù)對(duì)天麻素的純化奠定了基礎(chǔ)。將流速調(diào)至1.0 mL/min，其他條件不變，測(cè)試C18柱對(duì)天麻粗提物的分離性能，結(jié)果見圖5(b)。由圖可知，經(jīng)C18柱分離后出現(xiàn)2個(gè)特征峰，其中響應(yīng)值最強(qiáng)的色譜峰與天麻素對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間一致。通過面積歸一化法計(jì)算得到粗提物中天麻素的純度為17.06%，表明天麻粗提物中除天麻素外還存在大量的雜質(zhì)。

天麻粗提物經(jīng)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱重復(fù)進(jìn)樣30次，收集天麻素段的餾分。將收集到的餾分進(jìn)行濃縮，再用流動(dòng)相溶液溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾后得到天麻素純化溶液。將天麻素純化溶液用C18柱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖6。由圖可知，天麻素粗提物經(jīng)過漆酚酯鍵合SiO2色譜柱純化后，雜質(zhì)含量明顯降低，通過面積歸一化法計(jì)算得到天麻素的純度為93.45%，表明漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)天麻素具有較好的純化效果。這為天麻素的純化提供了新的思路。在后期工作中課題組會(huì)將漆酚酯鍵合SiO2固定相用于制備柱填料，并將其應(yīng)用于天麻素的分離純化。

圖6 純化天麻素在C18柱的色譜

2.3.2穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 在實(shí)際應(yīng)用過程中，色譜柱需要具有良好的穩(wěn)定性。為了評(píng)價(jià)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱的穩(wěn)定性，隨機(jī)選取6次天麻粗提物的分離色譜圖，疊加后如圖7所示，由圖可知，色譜峰基本可以重疊。對(duì)各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中保留時(shí)間的RSD≤0.39%，色譜峰峰面積的RSD≤2.64%，表明漆酚酯鍵合SiO2色譜柱具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 分離天麻素及其結(jié)構(gòu)類似物的熱力學(xué)研究

2.4.1分離GAS與PGL的熱力學(xué)研究 根據(jù)Van’t Hoff方程對(duì)PGL和GAS的lnk-1/T和lnα-1/T進(jìn)行線性擬合得到熱力學(xué)方程，結(jié)果見表1。在25～45 ℃范圍內(nèi)擬合所得到的熱力學(xué)方程均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，表明在該溫度范圍內(nèi)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)GAS和PGL的保留機(jī)制未隨溫度改變發(fā)生變化。隨著柱溫升高，GAS和PGL的保留因子與分離度均有所下降，表明柱溫對(duì)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離選擇性的影響強(qiáng)于其對(duì)色譜柱柱效的影響[19]。

表1 GAS和PGL/MGL在漆酚酯鍵合SiO2色譜柱的熱力學(xué)參數(shù)(298K)

根據(jù)熱力學(xué)方程計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)如表1所示。GAS與PGL的ΔH均小于0，表明GAS和PGL在固定相的保留過程均為放熱過程。|ΔHGAS|<|ΔHPGL|，表明PGL與固定相之間的作用力強(qiáng)于GAS，所以GAS較PGL在色譜柱上先被洗脫出來。GAS和PGL的ΔS均小于0，并且|ΔSGAS|>|ΔSPGL|，表明GAS和PGL在經(jīng)過固定相與流動(dòng)相兩相之間的分配作用后，有序性增強(qiáng)，并且GAS在漆酚酯鍵合SiO2色譜柱上的分子總體有序性更強(qiáng)；ΔGGAS>0，ΔGPGL<0，表明分離過程中GAS在固定相上的保留是一個(gè)非自發(fā)過程，而PGL是一個(gè)自發(fā)過程；ΔΔG<0，ΔΔH<0，ΔΔS>0，表明漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)GAS和PGL的分離過程為一個(gè)自發(fā)過程，該過程既受焓驅(qū)動(dòng)又受熵驅(qū)動(dòng)。

2.4.2分離GAS與MGL的熱力學(xué)研究 根據(jù)Van’t Hoff方程對(duì)MGL和GAS的lnk-1/T和lnα-1/T進(jìn)行線性擬合得到熱力學(xué)方程，結(jié)果亦見表1，在25～45 ℃范圍內(nèi)擬合所得到的熱力學(xué)方程均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，表明在該溫度范圍內(nèi)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)GAS和MGL的保留機(jī)制未隨溫度改變發(fā)生變化。隨著柱溫升高，GAS和MGL的保留因子與分離度均有所下降，表明柱溫對(duì)漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離選擇性的影響強(qiáng)于其對(duì)色譜柱柱效的影響[19]。

漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離GAS和MGL的熱力學(xué)數(shù)據(jù)如表1所示。GAS與MGL的ΔH均小于0，表明GAS和MGL在固定相的保留過程均為放熱過程。因此當(dāng)柱溫升高時(shí)，固定相對(duì)GAS和MGL的保留能力減弱，分離度降低；|ΔHGAS|<|ΔHMGL|，表明MGL與固定相之間的作用力強(qiáng)于GAS，所以GAS較MGL在漆酚酯鍵合SiO2色譜柱上先被洗脫出來；ΔS小于0，并且|ΔSGAS|>|ΔSMGL|，表明GAS和MGL在經(jīng)過固定相與流動(dòng)相兩相之間的分配作用后，有序性增強(qiáng)，并且GAS在漆酚酯鍵合SiO2色譜柱上的分子總體有序性更強(qiáng)；ΔGGAS>0，ΔGMGL<0，表明分離過程中GAS在固定相上的保留是一個(gè)非自發(fā)過程，而MGL是一個(gè)自發(fā)過程。

ΔΔG<0，表明漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)GAS和MGL的分離過程為自發(fā)過程。ΔΔH<0，ΔΔS>0，表明漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)GAS和PGL的分離過程既受焓驅(qū)動(dòng)又受熵驅(qū)動(dòng)。結(jié)合表1中數(shù)據(jù)可以看出，|ΔΔGMGL-GAS|>|ΔΔGPGL-GAS|，表明漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)MGL-GAS的分離能力大于PGL-GAS，這也與實(shí)際分離情況相符合。

3 結(jié) 論

3.1以天麻素(GAS)的結(jié)構(gòu)類似物PGL和MGL作為競(jìng)爭(zhēng)分子，確定了漆酚酯鍵合SiO2色譜柱分離GAS的最佳色譜條件：乙腈/0.05%磷酸水溶液(體積比3∶97)為流動(dòng)相，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速0.4 mL/min。在該色譜條件下，漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)PGL-GAS的分離度達(dá)到7.8，對(duì)MGL-GAS的分離度達(dá)到14.0。

3.2通過Van’t Hoff方程對(duì)PGL-GAS和MGL-GAS的分離過程進(jìn)行熱力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)二者的規(guī)律一樣，分離過程中ΔΔH<0、ΔΔS>0、ΔΔG<0，表明漆酚酯鍵合SiO2色譜柱對(duì)GAS及其結(jié)構(gòu)類似物的分離過程是一個(gè)自發(fā)的放熱過程，該分離過程既受熵驅(qū)動(dòng)又受焓驅(qū)動(dòng)；隨著柱溫的升高，保留因子和分離度均有所降低。

3.3將天麻粗提物用漆酚酯鍵合SiO2色譜柱進(jìn)行分離純化，純化后GAS的雜質(zhì)明顯降低，其純度由粗提物的17.06%提升至93.45%。該研究既為分離純化GAS提供了一種思路，還拓展了漆酚酯鍵合SiO2色譜柱在實(shí)際分離方面的應(yīng)用。