云南金花茶葉不同極性提取物的抗氧化活性分析

何旭華，石志嬌，彭小偉，闞 歡，趙 平，劉 云*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)局重點實驗室，云南 昆明 650224)

云南金花茶，學(xué)名簇蕊金花茶(CamelliafascicularisH.T.Chang)，又名云南顯脈金花茶，為山茶科山茶屬金花茶組植物，擁有獨特的金黃色花瓣[1-3]。金花茶因其物種資源珍稀且具有較高的觀賞價值，被稱為“植物界大熊貓”和“茶族皇后”[4]。金花茶組植物在中國共有10個種和8個變種，主要分布于廣西南部、貴州和云南[3]。云南的金花茶組植物資源主要分布在河口、個舊和馬關(guān)，部分金花茶資源已遭到嚴(yán)重破壞，因此，進(jìn)行科學(xué)研究對金花茶組植物的保護(hù)具有重要意義[5]。金花茶的葉和花均可作為藥材，其含有豐富的礦質(zhì)元素和生理活性成分，其中天然有機鍺、硒和鋅等微量元素達(dá)400多種，更有總黃酮、茶多酚、茶多糖、茶皂堿、茶黃酮和皂苷等諸多生理活性成分[1,6-7]，使其成為一種很好的藥食兩用植物，有極高的研究價值[8]。金花茶有清熱解毒、利尿消腫、止血止痛、延緩衰老、降血脂、抗腫瘤、抗過敏、增強機體免疫機能等藥理作用[9-11]。金花茶的抗氧化活性與其含有的多酚類物質(zhì)有關(guān)，如兒茶素、表兒茶素、牡荊素、異牡荊素、槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖和山柰酚等，其中槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖和兒茶素的抗氧化性較強[12]。農(nóng)彩麗等[13]對金花茶總黃酮進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)金花茶總黃酮能抑制4種腫瘤細(xì)胞株體外增殖作用，有抗腫瘤功效。目前，對云南金花茶葉片不同極性提取物抗氧化活性的研究鮮有報道。因此，本研究采用不同極性溶劑對云南金花茶葉片進(jìn)行提取，測定提取物中多酚和總黃酮的含量，并考察不同極性提取物的抗氧化活性，以期為云南金花茶葉片活性成分的分離和天然抗氧化劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料及儀器

云南金花茶(CamelliafascicularisH.T.Chang)的葉片，2019年10月29日采自云南省馬關(guān)縣八寨鎮(zhèn)。將云南金花茶葉片于45 ℃干燥4 h，粉碎，取粒徑<0.25 mm，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，純度>97.0%)、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS，純度>98.0%)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。甲醇、石油醚、CHCl3、乙酸乙酯、正丁醇、NaNO2、NaOH、Al(NO3)3、Na2CO3、無水乙醇(純度99.7%)、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸(TCA)、6H2O·FeCl3，均為市售分析純。

FD5-3型冷凍干燥機；HB 10 S96旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機；YB-250A型高速多功能粉碎機；SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵；UV-2600紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；SB25-12DTDS超聲波清洗機，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；5804 R多功能臺式高速冷凍離心機，艾本德公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司。

1.2 云南金花茶葉片提取物的制備

1.2.1粗提液 稱250 g云南金花茶葉片粉末，按料液比1∶10(g∶mL)溶于甲醇，250 W、30 ℃超聲波作用40 min，真空循環(huán)抽濾3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到云南金花茶粗提取物浸膏，用300 mL蒸餾水溶解成粗提液備用。

1.2.2不同極性溶劑提取物 參考文獻(xiàn)[14]方法并略作調(diào)整制備不同極性提取物。取1.2.1節(jié)制備的粗提液300 mL于分液漏斗中，按體積比1∶1加入石油醚300 mL，搖勻、靜置、分層，再取石油醚(體積比為1∶1)加入下層液，搖勻、分離。重復(fù)此步驟，直至下層液無色，收集合并上層液，為石油醚相萃取液。

取下層液依次加入氯仿、乙酸乙酯和正丁醇(體積比均為1∶1)，重復(fù)上述過程，得不同極性萃取液。將各相萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥得云南金花茶石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相提取物，于4 ℃的冰箱避光存放，備用。

1.3 不同極性提取物成分的測定

1.3.1總酚的測定 選用福林酚法測定總酚含量[15]，配制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.05 g/L的母液，母液稀釋至不同質(zhì)量濃度，通過測定不同質(zhì)量濃度(x)的沒食子酸溶液的吸光值(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.039+82.371x，R2=0.999。將云南金花茶不同極性溶劑提取物配制成合適的質(zhì)量濃度并測定吸光度值，依據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線算出云南金花茶不同極性溶劑提取物中多酚的含量。

1.3.2總黃酮的測定 參照文獻(xiàn)[16]配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.05 g/L的母液，母液稀釋至不同質(zhì)量濃度，通過測定不同質(zhì)量濃度的蘆丁溶液的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.019+13.186x，R2=0.999。將云南金花茶不同極性溶劑提取物配制成合適的質(zhì)量濃度并測定吸光度，依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線算出云南金花茶不同極性溶劑提取物中總黃酮的含量。

1.4 提取物抗氧化能力的測定

1.4.1DPPH·清除能力 參考Hua等[17]的方法，配制質(zhì)量濃度為0.05 g/L DPPH-無水乙醇溶液，將云南金花茶不同極性溶劑提取物配制成質(zhì)量濃度為30、50、70、90、110、130和150 mg/L的樣液，各取200 μL與DPPH-無水乙醇溶液置于0.5 mL的離心管中，混合均勻，在37 ℃的水浴中暗反應(yīng)30 min，于96孔酶標(biāo)板在517 nm處測定樣品組吸光值(Ap)。用甲醇代替樣液測定樣品控制組吸光值(Aq)，用無水乙醇代替DPPH-無水乙醇溶液測定空白組吸光值(Aw)。以Vc作陽性對照，比較云南金花茶不同極性溶劑提取物對DPPH·的清除率。

1.4.2·ABTS+清除能力 參考Li等[18]的方法，將7 mmol/L·ABTS+與5 mmol/L過硫酸鉀溶液于棕色容量瓶中等體積混合，靜置反應(yīng)12 h，即得·ABTS+反應(yīng)液。在734 nm處用蒸餾水稀釋·ABTS+反應(yīng)液至吸光值0.700(±0.02)，避光現(xiàn)用。將云南金花茶不同極性溶劑提取物配制成質(zhì)量濃度為250、500、750、1 000、1 250、1 500和1 750 mg/L的樣液，取20 μL樣液與380 μL·ABTS+反應(yīng)液于96孔酶標(biāo)板混合均勻，暗反應(yīng)6 min，在734 nm測定Ap。用甲醇代替樣液測定Aq，用蒸餾水代替·ABTS+溶液測定Aw。以Vc作陽性對照，比較云南金花茶不同極性溶劑提取物對·ABTS+的清除率。

1.4.3·OH清除能力 參照Mao等[19]的方法，將云南金花茶不同極性溶劑提取物配制成質(zhì)量濃度為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000和7 000 mg/L的樣液，取云南金花茶不同極性溶劑提取物樣液100 μL、9 mmoL/L FeSO4溶液100 μL、9 mmoL/L水楊酸-乙醇溶液100 μL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% H2O2100 μL，于96孔酶標(biāo)板混合均勻，避光反應(yīng)1 h，在510 nm測定Ap。甲醇代替樣液測定Aq，用乙醇溶液代替水楊酸-乙醇溶液測定Aw。以Vc作陽性對照，比較云南金花茶不同極性溶劑提取物對·OH的清除率。

1.4.4總還原能力 采用鐵氰化鉀法[20]，將云南金花茶不同極性溶劑提取物配制成質(zhì)量濃度為250、500、750、1 000、1 250、1 500和1 750 mg/L的樣液，取樣液、pH值6.6磷酸緩沖液、1%鐵氰化鉀各100 μL混合均勻，置于50 ℃的水浴中20 min，加入10% TCA溶液100 μL，混合均勻后離心(4 000 r/min)10 min。分別取100 μL上清液、蒸餾水和1%三氯化鐵于96孔酶標(biāo)板，混合均勻靜置10 min，700 nm處測吸光值。以VC作陽性對照。

1.4.5自由基清除率和IC50值的計算 DPPH·、·ABTS+、·OH清除率計算公式如下：

式中：Ap—樣品組的吸光值；Aq—樣品控制組的吸光值；Aw—空白組的吸光值。

采用Origin 2018對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到清除率(Y)和質(zhì)量濃度(X)的二元一次方程，求清除率(Y)為50%，對應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)值，即為IC50值。

1.4.6數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Origin 2018對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到擬合方程，進(jìn)行平行試驗3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差為結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 提取物中多酚和總黃酮含量

云南金花茶葉片提取物中多酚和總黃酮含量見表1。水相提取物中多酚含量最高，為(140.259±5.989)mg/g；正丁醇相中多酚含量最低，為(62.866±2.278)mg/g；石油醚相和氯仿相的多酚含量無顯著差異(P>0.05)。水相提取物總黃酮含量最高，為(102.324±1.095)mg/g，略高于乙酸乙酯相；正丁醇相總黃酮含量最低，為(26.484±3.047)mg/g，總黃酮含量均存在差異顯著(P<0.05)。

表1 云南金花茶不同極性提取物中多酚和總黃酮含量1)

2.2 不同極性提取物的抗氧化活性

2.2.1DPPH·清除能力 DPPH·無水乙醇溶液呈紫色，當(dāng)加入有清除DPPH·能力的物質(zhì)時，會使反應(yīng)系統(tǒng)的顏色褪色，因而可以通過吸光值變化來定量分析[21-22]。云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物對DPPH·清除能力見圖1(a)。當(dāng)Vc質(zhì)量濃度為13 mg/L時，對DPPH·的清除率高達(dá)94.046%。云南金花茶不同極性提取物質(zhì)量濃度在30～150 mg/L時，對DPPH·清除效果隨樣品濃度增大而增強，水相對DPPH·的清除率高于其他極性提取物。半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)可衡量各提取物對DPPH·的清除能力，IC50值越小，說明清除能力越強，反之越弱。云南金花茶不同極性溶劑提取物清除DPPH·的能力大小順序為：水相((38.634±2.556)mg/L)>乙酸乙酯相((50.845±3.985)mg/L)>氯仿相((63.598±3.854)mg/L)>石油醚相((66.197±5.950)mg/L)>正丁醇相((119.810±8.207)mg/L)。

a.DPPH·；b.·ABTS+；c.·OH；d.總還原能力total reducing power

2.2.2·ABTS+清除能力 ·ABTS+清除能力主要是根據(jù)電子轉(zhuǎn)移實現(xiàn)的，而且氫原子轉(zhuǎn)移是邊緣反應(yīng)途徑[23]?！BTS+呈藍(lán)綠色是由·ABTS+和過硫酸鉀反應(yīng)生成，當(dāng)加入能清除·ABTS+的物質(zhì)時，反應(yīng)系統(tǒng)顏色會褪色[24]。云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物對ABTS·清除能力見圖1(b)。由圖可知，不同提取物對·ABTS+均有較好的清除率。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在250～1 750 mg/L范圍內(nèi)，清除率隨質(zhì)量濃度增大而升高。Vc在質(zhì)量濃度為250 mg/L時，對·ABTS+清除率高達(dá)100%，高于云南金花茶不同提取物的清除效果。云南金花茶不同極性溶劑提取物清除·ABTS+的能力大小順序為：水相((276.610±8.416)mg/L)>乙酸乙酯相((362.754±22.555)mg/L)>氯仿相((643.692±29.651)mg/L)>正丁醇相((865.188±35.706)mg/L)>石油醚相((1 276.462±39.405)mg/L)。

2.2.3·OH清除能力 過氧化氫與二價的鐵離子反應(yīng)形成芬頓系統(tǒng)，產(chǎn)生·OH，在該系統(tǒng)中加入水楊酸溶液時，·OH與水楊酸形成羥基化合物即2,3-二羥基苯甲酸，當(dāng)加入有清除·OH的物質(zhì)時，有色化合物生成會減少，吸光值會降低[25]。云南金花茶葉片不同極性提取物對·OH清除能力見圖1(c)。由圖可知，提取物對·OH有明顯的清除效果，提取物質(zhì)量濃度在300～3 000 mg/L范圍時，石油醚相對·OH的清除率高于Vc，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 000 mg/L時，石油醚相和Vc對·OH的清除率均達(dá)到了100%，明顯高于其他相。質(zhì)量濃度在300～7 000 mg/L范圍時，各極性提取物清除·OH的能力大小順序為：石油醚相((180.880±49.568)mg/L)>氯仿相((1 130.630±157.932)mg/L)>乙酸乙酯相((2 472.160±826.007)mg/L)>水相((2 601.500±164.756)mg/L)>正丁醇相((3 936.230±621.700)mg/L)。

2.2.4總還原能力 以鐵氰化鉀法測不同提取物的總還原能力，還原生成的亞鐵氰化鉀與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，吸光值越大反應(yīng)樣品的還原能力越強，即抗氧化能力也越強[26]。云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物的總還原能力見圖1(d)。由圖可知，Vc的吸光值高于不同提取物，不同提取物均具有一定的還原力。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 mg/L，反應(yīng)體系中的三價鐵離子已經(jīng)被完全反應(yīng)，故呈現(xiàn)平緩趨勢。不同極性溶劑提取物總還原能力的吸光值大小為水相(2.281±0.103)>乙酸乙酯相(1.504±0.021)>氯仿相(1.077±0.056)>正丁醇相(0.838±0.021)>石油醚相(0.618±0.022)。

2.2.5抗氧化活性及相關(guān)性分析 云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物對自由基清除率和總還原力的曲線方程及IC50值見表2。由表2可知，擬合方程的R2>0.95，R2越接近1，表明擬合方程的擬合程度較好。

表2 云南金花茶不同極性提取物對自由基清除率和總還原力的曲線方程及IC50值

由表2的IC50值數(shù)據(jù)可以看出：水相對DPPH·、·ABTS+的清除能力最強，石油醚相對·OH清除能力最強；正丁醇相對DPPH·、·OH的清除能力最弱，石油醚相對·ABTS+清除能力最弱。不同極性溶劑提取物抗氧化活性能力的比較見圖2。圖2直觀表明：云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物的總還原能力均較強，對DPPH·清除能力強于對·ABTS+和·OH清除能力，而對·OH清除能力最弱。這是因為云南金花茶提取物的抗氧性能力不僅取決于其所含的黃酮類的極性，還取決于黃酮類化合物對自由基的選擇性和作用機理，不同極性溶劑提取物中黃酮類化合物的不同化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了其對不同自由基的清除能力的差異。

圖2 云南金花茶不同極性提取物抗氧化活性雷達(dá)圖

云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物的抗氧化活性與多酚、總黃酮含量之間的相關(guān)性見表3。

表3 云南金花茶不同極性提取物的抗氧化活性與多酚、總黃酮含量之間的相關(guān)性分析

由表3可知，不同提取物的4種抗氧化能力之間存在一定的相關(guān)性，其中DPPH·清除率的IC50、·ABTS+清除率的IC50及總還原能力之間存在極顯著的相關(guān)性，三者間的相關(guān)系數(shù)分別為0.779、-0.786、-0.971(P<0.01)；DPPH·、·ABTS+以及·OH清除率的IC50與多酚和總黃酮含量存在負(fù)相關(guān)，總還原能力與多酚和總黃酮的含量存在正相關(guān)，其中DPPH·、·ABTS+清除率的IC50以及總還原能力與多酚和總黃酮的含量存在極顯著的相關(guān)性(P<0.01)，表明云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物的抗氧活性與多酚和總黃酮含量存在一定的劑量效應(yīng)，多酚和總黃酮含量越高，抗氧化活性越強。

此外，水相和乙酸乙酯相中多酚和總黃酮的含量及其總體的抗氧化能力均高于氯仿相、正丁醇相和石油醚相。因此，云南金花茶葉片的抗氧化活性成分可能集中在水相和乙酸乙酯相，后期可進(jìn)一步對其組分進(jìn)行測定，分離單體化合物，確定具體的抗氧化物質(zhì)，并基于體外抗氧化活性研究，利用細(xì)胞模型、動物模型分析不同極性提取物的抗癌活性。

3 結(jié) 論

3.1采用不同極性溶劑對云南金花茶葉片中的有效成分進(jìn)行提取，其多酚提取能力依次為水>乙酸乙酯>石油醚>氯仿>正丁醇，總黃酮提取能力依次為水>乙酸乙酯>氯仿>石油醚>正丁醇。水相和乙酸乙酯相所含多酚為(140.259±5.989)和(124.578±2.132)mg/g，含總黃酮為(102.324±1.095)和(92.844±6.021)mg/g，均顯著高于其他相(P<0.05)。

3.2云南金花茶葉片不同極性溶劑提取物的抗氧化活性測定結(jié)果表明：水相和乙酸乙酯相對DPPH·、·ABTS+的清除能力及總還原能力較強；石油醚相對·OH清除能力較強。DPPH·、·ABTS+的IC50值與總還原能力之間存在極顯著的相關(guān)性，且與多酚和總黃酮的含量也存在極顯著的相關(guān)性(P<0.01)。