核磁共振光譜和質(zhì)譜在代謝組學(xué)中的優(yōu)勢和劣勢

李名悅, 林向成, 趙萌萌

(桂林電子科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,廣西 桂林 541004)

代謝組學(xué)研究是一種技術(shù)驅(qū)動(dòng)的方法,分析工具、軟件和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析的最新發(fā)展推動(dòng)了該領(lǐng)域的發(fā)展。核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,簡稱NMR)和質(zhì)譜(mass spectrometry,簡稱MS)是代謝組學(xué)研究中最常見的分析工具[1-9]。NMR技術(shù)的高重現(xiàn)性以及MS技術(shù)的高靈敏度和選擇性意味著這些工具優(yōu)于其他分析技術(shù)。代謝組學(xué)研究可以分為靶向或非靶向分析類別。非靶向分析側(cè)重于樣品中代謝物總補(bǔ)體(“指紋”)的代謝分析。NMR 常用于代謝組學(xué)指紋研究。靶向代謝組學(xué)方法側(cè)重于對(duì)選定代謝物的定量和鑒定,例如參與特定代謝途徑的代謝物或其他作為給藥攝入的直接產(chǎn)物的代謝物。在靶向分析中,所研究的代謝物通常是已知的,可以調(diào)整樣品的制備,以減少相關(guān)代謝物的干擾影響?；贛S的代謝組學(xué)方法通常是靶向分析的最佳方法。

MS方法和機(jī)器的不斷發(fā)展為代謝組學(xué)提供了一種高度特異性的分析工具,可提供未知物質(zhì)的化學(xué)信息,例如用于確定元素分子式的相對(duì)分子質(zhì)量質(zhì)量、同位素分布模式、通過母離子和碎片離子的特征進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析、使用與真實(shí)化合物數(shù)據(jù)的光譜匹配,以及混合樣品中不同化學(xué)物質(zhì)濃度水平進(jìn)行比較。事實(shí)上,基于MS的代謝組學(xué)技術(shù)由于其較高的靈敏度和較好選擇性,為眾多的代謝組學(xué)研究提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)。與NMR光譜相比,MS在分析代謝物方面具有優(yōu)勢,檢測水平的靈敏度有了很大提高[10-11]。此外,不同的MS技術(shù)提供了可以應(yīng)用的操作原理,例如不同的電離技術(shù),因此增加了可能檢測到的代謝物的數(shù)量。

1 材料

核磁共振光譜的高重復(fù)性以及非破壞性特征是NMR在代謝組學(xué)研究中的重要優(yōu)勢。此外,NMR可用于體內(nèi)研究,稱為磁共振光譜(MR spectroscopy,簡稱MRS),任何通過NMR光譜研究的體外代謝物途徑都可以通過使用MRS的體內(nèi)研究來進(jìn)行?；贜MR代謝組學(xué)方法包括同位素標(biāo)記的原子核,例如13C和15N,可用于獲取有關(guān)生物系統(tǒng)中代謝物平衡的有用信息,并監(jiān)測化合物通過代謝途徑的流動(dòng)。在短短幾分鐘內(nèi)就可以同時(shí)檢測到大量代謝物,這說明了核磁共振光譜在代謝組學(xué)研究中的進(jìn)一步優(yōu)勢。例如,單個(gè)質(zhì)子NMR光譜可以量化人體尿液樣本中的約100種代謝物,從而提供給定時(shí)間點(diǎn)的人體代謝狀態(tài)[12]。此外,高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)(high-resolution magic-angle spinning,簡稱HRMAS)NMR光譜可用于研究完整的組織樣本,從而無需預(yù)先準(zhǔn)備步驟(如提取)即可檢測組織中存在的代謝物。圖1顯示了過去12年中基于NMR和基于MS的代謝組學(xué)出版物數(shù)量的增加。

圖1 NMR代謝組學(xué)和MS代謝組學(xué)出版物的數(shù)量

總之,一個(gè)單一的分析平臺(tái)是不能夠?qū)悠分械乃蟹肿舆M(jìn)行完整的定量和識(shí)別。表1展示了核磁共振光譜與質(zhì)譜相比的優(yōu)勢和局限性。因此,除了一維和二維NMR實(shí)驗(yàn)外,還需要采用不同的技術(shù),例如不同的電離方法與液相色譜-質(zhì)譜(簡稱LC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜(簡稱GC-MS)相結(jié)合,可以最大限度地識(shí)別復(fù)雜樣品中不同代謝物的陽離子。例如,Wishart等采用不同的分析平臺(tái),如NMR、GC-MS、直接流動(dòng)注射質(zhì)譜(DFI/LC-MS/MS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)和高效液相色譜(HPLC)來鑒定人類尿液代謝物。結(jié)果表明,除了179種GC-MS、127 種DFI/LC-MS/MS、40 種ICP-MS 和10 種HPLC外,共有209種不同的代謝物可通過NMR進(jìn)行鑒定。本文重點(diǎn)介紹了NMR 和MS作為適用于代謝組學(xué)研究的工具的優(yōu)勢和劣勢。

表1 核磁共振光譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)和局限性

與MS相比,NMR光譜需要高技能和訓(xùn)練有素的操作人員,購買和維護(hù)成本更高;它還需要很大的儀器空間。因此,與NMR 光譜儀相比,MS器在臨床中心和醫(yī)院中更為常見。

2 方法

核磁共振光譜是一種功能強(qiáng)大的分析工具,主要用于化學(xué)鑒定和定量給定樣品的化學(xué)成分。NMR的應(yīng)用不僅限于液體樣品,還可以用于固體[12]、氣相[13]和組織樣品[14]。此外,除了在分子鑒定和結(jié)構(gòu)解析方面的主要應(yīng)用外,核磁共振光譜還可用于研究分子的物理和化學(xué)性質(zhì),如電子密度和分子動(dòng)力學(xué)[15-17]。因此,核磁共振已成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要工具,因?yàn)樗寡芯咳藛T能夠研究分子結(jié)構(gòu)以及生物條件下的分子動(dòng)力學(xué)。此外,核磁共振光譜已被廣泛用于眾多研究領(lǐng)域,包括結(jié)構(gòu)生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)、無機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)、聚合物和藥物發(fā)現(xiàn)。NMR已被認(rèn)為是代謝組學(xué)應(yīng)用中最重要的方法之一,例如,作為一種強(qiáng)大的人類疾病診斷方法。低靈敏度是核磁共振在生物醫(yī)學(xué)研究中的固有缺點(diǎn)和首要挑戰(zhàn)。隨著儀器的不斷發(fā)展,例如更高的磁場強(qiáng)度、低溫冷卻探針和微探針[18-19],大大提高了NMR的靈敏度。動(dòng)態(tài)核極化(DNP)方法是最有效的發(fā)展之一,已成功用于提高成像和NMR 靈敏度[20-23]。

2.1 核磁共振光譜

2.1.1 高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振光譜

核磁共振光譜的應(yīng)用不僅限于液體和固體樣品,而且可以通過使用高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)(HRMAS)核磁共振光譜擴(kuò)展到完整的組織樣品。通過以54.74°的角度(即“魔角”)旋轉(zhuǎn)樣品到磁場,并高速旋轉(zhuǎn),可以獲得與溶液狀態(tài)NMR 光譜分辨率相當(dāng)?shù)墓庾V。使用這種方法可以自發(fā)檢測組織樣本的化學(xué)成分,而無需提取等預(yù)處理步驟。在基于NMR 的代謝組學(xué)方法中,該技術(shù)有助于提供生物流體的代謝分析與特定組織的組織學(xué)之間的相關(guān)性。因此,HRMASNMR光譜已被用于研究小型完整組織樣本的代謝組學(xué)平衡,包括腦[24]、腎臟[25]、肝臟[26]和睪丸組織。HRMAS最近被用于腦膜瘤活檢,作為區(qū)分典型腦膜瘤和良性組織的潛在診斷工具。最近,趙英蘭及其同事將HRMAS光譜技術(shù)與主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)相結(jié)合,并用判別分析法(OPLS-DA)對(duì)127例患者的直腸癌組織的代謝特性進(jìn)行了研究,與47例健康對(duì)照者的樣本進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示,來自患者的樣本和來自健康對(duì)照受試者的樣本之間存在明顯的區(qū)別。研究人員發(fā)現(xiàn)了幾種不同的代謝物,與直腸癌組織的不同階段相關(guān),因此證明了使用代謝物生物標(biāo)記物跟蹤直腸癌進(jìn)展的可能性。此外,研究人員共成功鑒定出38種差異代謝物,其中16種被發(fā)現(xiàn)與直腸癌的特定階段密切相關(guān)。結(jié)果表明,與健康對(duì)照樣本相比,研究人員發(fā)現(xiàn)患者癌癥組織樣本中乳酸、蘇氨酸、醋酸鹽、谷胱甘肽、尿嘧啶、琥珀酸鹽、絲氨酸、甲酸鹽、賴氨酸和酪氨酸等幾種代謝物的濃度水平升高,而其他代謝物如牛磺酸、肌酸、甜菜堿、肌醇、磷酸肌酸和二甲基甘氨酸的水平降低。

2.1.2 一維核磁共振光譜

核磁共振光譜已被用于許多具有不同可探測核的多維實(shí)驗(yàn),其中一維質(zhì)子(1H)NMR實(shí)驗(yàn)是最重要的技術(shù),尤其是在代謝組學(xué)研究方面。然而,由于化學(xué)位移范圍很窄(5 000 Hz),重疊信號(hào)的1HNMR光譜通常持續(xù)存在,這導(dǎo)致譜分配的不確定性。其他原子核如碳和氮具有更寬的NMR化學(xué)位移,但也有其他缺點(diǎn)。一維磷(31P)NMR 光譜具有一些優(yōu)點(diǎn),例如31P核的天然豐度為100%,化學(xué)位移范圍寬,靈敏度高。因此,31P核磁共振光譜通常用于研究與能量代謝有關(guān)的磷脂和代謝物。然而,大多數(shù)代謝物不含磷是31PNMR光譜的主要限制。一般來說,一維碳(13C)NMR光譜的譜寬超過100 000 Hz,擁有更寬的譜。13CNMR光譜在分子鑒定和結(jié)構(gòu)解析方面尤其重要。然而,13C核的低天然豐度(1.1%)及低靈敏度限制了該同位素在基于NMR的代謝組學(xué)中的應(yīng)用。研究人員已經(jīng)開發(fā)了不同的NMR 方法來增強(qiáng)13CNMR信號(hào)。例如,(DEPT)譜是提高NMR 光譜靈敏度的有力手段,通過這種方法,13C信號(hào)強(qiáng)度可以增強(qiáng)4 倍。DEPT-NMR 實(shí)驗(yàn)也可用于區(qū)分CH2和(CH,CH3),例如,DEPT-135的13c核磁共振譜會(huì)產(chǎn)生具有負(fù)強(qiáng)度的ch2峰和具有正強(qiáng)度的ch和ch3峰。

15NNMR光譜在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中非常重要,包括研究蛋白質(zhì)、RNA和DNA 結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué),以及研究蛋白質(zhì)-金屬配位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配體相互作用。然而,由于15N 的自然豐度低,僅為0.37%且靈敏度低,預(yù)計(jì)這種方法在代謝組學(xué)研究中的用處不大。

2.1.3 二維核磁共振光譜

二維NMR光譜(2DNMR)可用于克服質(zhì)子一維NMR光譜中重疊共振的問題,與一維方法相比,可以檢測和分配更多的代謝物。二維核磁共振光譜基于空間自旋耦合或鍵耦合,前者主要用于結(jié)構(gòu)解析,后者用于分子識(shí)別。通過鍵相關(guān),核磁共振光譜分為兩大類:同核和異核。同核主要是(1H-1H)如相關(guān)光譜(COSY)和全相關(guān)光譜(TOCSY)[27],異核,如(1H-13C)。在基于核磁共振的代謝組學(xué)研究中,同核和異核的核磁共振光譜都被用于信號(hào)分離和代謝物分配。其他二維方法,如二維核磁共振光譜和擴(kuò)散有序光譜(DOSY)[28]已被用于核磁共振的代謝組學(xué)研究。COZY和DOSY結(jié)合用于研究從肌肉萎縮癥小鼠模型中收集的營養(yǎng)不良的心臟組織的代謝變化。單量子相干(HSQC)、異核多量子相關(guān)(HMQC)和異核多鍵相關(guān)(HMBC)的異核2D 實(shí)驗(yàn)具有很高的分辨率,已被用于代謝物鑒別和鑒定。

雖然2DNMR實(shí)驗(yàn)改善了NMR信號(hào)的分散性,但由于數(shù)據(jù)分析中增加的采集時(shí)間、數(shù)據(jù)大小和復(fù)雜性,這種方法不經(jīng)常使用。由于核磁共振儀器的不斷發(fā)展,以及新的更快的核磁共振信號(hào)采集和數(shù)據(jù)處理方法,因此,2D 技術(shù)在代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用日益增多。

2.1.4 相關(guān)光譜(COSY)

COZY是二維同核相關(guān)光譜的一個(gè)技術(shù),多年來一直用于分子鑒定和結(jié)構(gòu)解析[29-30]。COZY 已被用于代謝組學(xué)研究,實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短,只需幾分鐘即可運(yùn)行2D光譜,并提供遠(yuǎn)比1DNMR 光譜更多的信息。最簡單的COZY 脈沖序列由單個(gè)90°射頻脈沖和演化時(shí)間(t1)以及第二個(gè)90°脈沖和測量周期(t2)組成。COZY 光譜包括同核(1H-1H)相關(guān)光譜,其中2D光譜中的交叉峰通過核對(duì)之間的鍵耦合表示。交叉峰表示通過2個(gè)原子核之間的鍵磁化轉(zhuǎn)移。這為識(shí)別由許多分子組成的樣品中屬于同一分子的峰提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具,就像生物樣品中的代謝物一樣。由于鍵關(guān)聯(lián)僅發(fā)生在同一分子內(nèi),因此,COZYNMR光譜已廣泛用于基于NMR 的代謝組學(xué)應(yīng)用。

2.1.5 異核單量子相關(guān)譜(HSQC)

鍵關(guān)聯(lián)也可用于兩種不同類型的原子核(通常為1H,13C或15N)之間的關(guān)聯(lián),這兩種原子核由一個(gè)鍵隔開。例如,1H-13CHSQC光譜協(xié)調(diào)了質(zhì)子和相應(yīng)鍵合碳的化學(xué)位移,因此每對(duì)耦合原子只能獲得一個(gè)交叉峰。因此,HSQC 為信號(hào)分配提供了一種特別有用的方法,尤其是重疊質(zhì)子信號(hào)的分配。此外,HSQC光譜可用于分配質(zhì)子和碳NMR光譜。

2.2 質(zhì)譜

質(zhì)譜(MS)是一種強(qiáng)大的技術(shù),主要用于鑒定未知化合物和定量樣品中的已知分子[31-33]。至于NMR和X射線[34-35],它還可以用于結(jié)構(gòu)解析和研究材料的化學(xué)性質(zhì)。由于其高靈敏度和選擇性,MS為分析混合樣品(例如生物樣品)中的代謝物提供了一個(gè)重要的分析平臺(tái)。此外,MS可以檢測不含質(zhì)子或碳的離子,例如金屬離子。然而,MS方法不能完全檢測所有類別的代謝物,因此必須采用一種以上的方法來進(jìn)行全面的代謝分析。MS儀器的主要組件具有不同的電離源和質(zhì)量分析器類型,可用于檢測不同類別的分子。例如,GC-MS的優(yōu)點(diǎn)在于高分離效率和可重復(fù)的保留時(shí)間,這些保留時(shí)間可以在不同實(shí)驗(yàn)室之間交換,以使用保留指數(shù)概念和保留時(shí)間作為標(biāo)記進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。然而,GC-MS的固有局限性在于它只能檢測揮發(fā)性化合物或可以衍生為揮發(fā)性的化合物。此外,MS無法檢測所有代謝物,因?yàn)槟承┐x物不會(huì)通過某些電離方法電離。MS檢測器的動(dòng)態(tài)范圍仍然只有三到四個(gè)數(shù)量級(jí),而代謝物濃度的范圍通常要大得多,并且沒有可以檢測所有代謝物的檢測器。生物樣品代謝驗(yàn)證的一個(gè)難度是許多代謝物尚未完全鑒定。例如,在番茄中檢測到的869種不同代謝物中,有494種在常見代謝物數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)。

質(zhì)譜法可以檢測到的代謝物數(shù)量和種類取決于電離模式的選擇。一種單一的電離方法不能檢測所有代謝物類別,例如極性、非極性、中性離子。因此,應(yīng)獨(dú)立使用不同的電離方法以最大化檢測到代謝物數(shù)量。例如,在LC-MS分析中,正離子模式的電噴霧電離(ESI)是最常見的模式,可以有效電離各種中等大小的極性分子,而負(fù)離子模式對(duì)于某些代謝物類別更強(qiáng)大,例如碳水化合物和有機(jī)酸。據(jù)報(bào)道,大氣壓化學(xué)電離(APCI)和ESI的使用使紅細(xì)胞代謝組的覆蓋率增加了34%。通過使用GC-MS和LC-MS的一套不同的互補(bǔ)方法,在血液樣本的靶向分析方法中可以檢測多達(dá)100～500種代謝物,并且在一次檢測中可以檢測到約600～1 000種代謝物指紋模式。需要注意的是,LC-MS中的代謝物識(shí)別策略與GC-MS中的不同,GC-MS中通常只檢測到分子離子,需要額外的MS/MS實(shí)驗(yàn)來獲得代謝物的身份和結(jié)構(gòu)信息。

2.2.1 液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)

LC-MS包括2種強(qiáng)大的分析工具:高效液相色譜法(HPLC,又稱高壓液相色譜法)和質(zhì)譜法[36-37]。LC-MS作為一種非常強(qiáng)大的分析工具,用于分離、鑒定和量化混合樣品中的分子。HPLC技術(shù)首先根據(jù)不同的物理和化學(xué)性質(zhì)(例如分子大小、電荷、極性和與其他分子的親和力)分離分子。HPLC由固定相和流動(dòng)相組成。固定相使用硅膠等材料,根據(jù)分子大小在不同程度上減緩分子的運(yùn)動(dòng),從而根據(jù)大小差異分離分子。流動(dòng)相包括含有樣品混合物的溶液,并通過固定相(色譜柱)進(jìn)行分子分離。柱色譜法可用于從混合物中純化單個(gè)化合物。不同的樣品需要不同的柱、蛋白質(zhì)和肽樣品,例如,需要的柱與代謝組學(xué)研究中典型的小分子樣品所需的柱不同。一旦分析物被分離,它們就會(huì)通過質(zhì)譜分析儀,在那里根據(jù)質(zhì)量荷電比進(jìn)行檢測,每條合成線的強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于每個(gè)分子的相對(duì)濃度。

基于其分離和檢測多種分子的能力,LC-MS是應(yīng)用最廣泛的質(zhì)譜技術(shù),尤其是在生物科學(xué)領(lǐng)域。LC-MS是一種非常適用于進(jìn)行大多數(shù)代謝物分析研究的工具,可以高靈敏度進(jìn)行定量獲得結(jié)構(gòu)信息。不同的分離方法可用于分離不同類別的代謝物。例如,反相(RP)梯度色譜法一直是LC-MS研究中用于代謝物分析的最常用的分離方法[38-39]。然而,這不是最適合極性分子和離子的方法,其中包括許多重要的代謝物(有機(jī)酸或氨基酸)。這些代謝物代表了生化途徑中非常重要的成分,它們的評(píng)估對(duì)于檢測關(guān)鍵代謝狀態(tài)很重要,例如先天性代謝錯(cuò)誤和代謝綜合征。親水相互作用色譜(HILIC)是一種替代方法,可用于電離極性代謝物,從而增加檢測到的代謝物的范圍。為了最大限度地覆蓋所分析的代謝物,可以對(duì)樣品進(jìn)行兩次分析,分別使用RP 和HILIC 或在HILIC 和RP-LC的“正交”組合中使用二維分析的柱切換方法。盡管RP和HILIC的結(jié)合使用是許多代謝物的首選電離方法,但這種方法并未涵蓋生物樣品(如尿液)的整個(gè)代謝物極性范圍。因此,建議使用其他電離方法,例如正負(fù)電噴霧電離(ESI)模式和大氣壓化學(xué)電離(APCI),以最大限度擴(kuò)大生物樣品中不同代謝物的檢測范圍。考慮到所有這些可能性,需要以八種不同模式(八次單獨(dú)運(yùn)行)進(jìn)行分析,以全面分析代謝物。這些方法的結(jié)合使LC-MS在代謝組學(xué)中有更多的應(yīng)用,因此不同的LC-MS方法被應(yīng)用在靶向和非靶向代謝組學(xué)分析。

2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)

GC-MS是一種分析揮發(fā)性分子的新型工具,具有高分辨率和可重復(fù)的色譜分離,這些特點(diǎn)使其非常適合分析復(fù)雜的代謝混合物[40-42]。GC-MS包括2種強(qiáng)大的分析方法:氣相色譜法和質(zhì)譜法。這些方法提供了最重要的分離方法之一,可用于提供揮發(fā)性化合物的定性和定量信息。樣品首先經(jīng)過氣相色譜裝置,在氣相色譜裝置中完成混合物中揮發(fā)性有機(jī)化合物的高分辨率分離。氣相色譜裝置主要由色譜柱組成,其長度一般在2～60 m,直徑在10～30 cm。

不同種類的氣相色譜柱,如填充管和毛細(xì)管,用于分離不同種類的樣品。填充管可由不銹鋼、玻璃或熔融石英制成,通常形成線圈,以便在250℃左右的溫度下進(jìn)入烘箱進(jìn)行高溫實(shí)驗(yàn)。惰性氣體(如氦氣)吹入柱中,當(dāng)樣品被插入色譜柱時(shí),它會(huì)蒸發(fā),揮發(fā)性分子被氦氣推過色譜柱。一開始,所有的分子一起運(yùn)動(dòng),但根據(jù)分子量和大小,其中某些分子的運(yùn)動(dòng)速度比其他分子慢。較小的分子比較大的分子移動(dòng)得更快,當(dāng)它們通過色譜柱時(shí),分子繼續(xù)彼此分離,最終以不同的組分從色譜柱中分離出來,因此提供了一種有效的分離方法。

當(dāng)分子離開GC色譜柱時(shí),它們會(huì)被引入MS單元,在MS單元中使用電離方法(例如電子束)將它們電離。由特定分子形成的離子取決于該分子的性質(zhì),當(dāng)分子離開GC柱時(shí),它們被引入MS單元,在那里使用電子束等電離方法進(jìn)行電離。由特定分子形成的離子將取決于該分子的性質(zhì),電離分子和分子的離子片段都可用于根據(jù)質(zhì)量電荷比在分子水平上區(qū)分和識(shí)別混合物的成分。此外,可以通過測量峰值的絕對(duì)強(qiáng)度來獲得混合物成分的定性信息,其中最高峰值代表100%的豐度,并用作其他峰值的參考。因此,GC-MS是分析揮發(fā)性代謝物的首選分析工具,并已用于代謝組學(xué)研究的不同領(lǐng)域,包括植物代謝組學(xué)和先天代謝錯(cuò)誤篩查[40,43-44]。GC-MS還提供了高度可重復(fù)的片段,因此為代謝物的鑒定提供了有力的工具。GC-MS的其他優(yōu)點(diǎn)包括高靈敏度和分辨率、低成本以及儀器的易用性。GC-MS分析的主要局限性在于它僅限于揮發(fā)性小分子,這意味著這種方法在代謝分析研究中的應(yīng)用有限。此外,生物樣品(例如生物流體)的制備可能是耗時(shí)且重復(fù)的,這可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。在電離過程中可能會(huì)出現(xiàn)其他問題,例如產(chǎn)物形成和降解。此外,在衍生化反應(yīng)過程中,非揮發(fā)性代謝物可以轉(zhuǎn)化為不同形式的衍生物,從而使同一母體代謝物的不同形式同時(shí)存在。在分析真實(shí)樣本(例如在代謝物含量方面具有高度可變性的人尿)時(shí),衍生化可能會(huì)根據(jù)代謝物的不同特性以不同的轉(zhuǎn)化率發(fā)生,因此可能會(huì)顯著影響重復(fù)性和總體結(jié)果。為了克服定量不準(zhǔn)確等問題,標(biāo)準(zhǔn)化合物可用于衍生標(biāo)準(zhǔn)化合物和數(shù)據(jù)校正過程。為了生成可重現(xiàn)的質(zhì)譜和高度可轉(zhuǎn)移的EI-MS譜庫,建議使用70 eV 的標(biāo)準(zhǔn)化MS 電子電離能,以便通過質(zhì)譜庫匹配識(shí)別化合。

3 結(jié)束語

隨著強(qiáng)大的應(yīng)用與方法學(xué)的進(jìn)步,代謝組學(xué)領(lǐng)域正在迅速發(fā)展。本文涵蓋了NMR 和MS/NMR 方法在代謝組學(xué)中的應(yīng)用,特別強(qiáng)調(diào)了它們對(duì)靶向和非靶向代謝組學(xué)的貢獻(xiàn)。在過去的幾年中,快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的鑒定和定量技術(shù)一直在改進(jìn),預(yù)計(jì)這一趨勢將繼續(xù)下去。對(duì)于靶向代謝組學(xué),進(jìn)一步提高絕對(duì)代謝物定量的自動(dòng)化、速度和準(zhǔn)確性至關(guān)重要。MS/NMR方法顯然將有助于在代謝組學(xué)應(yīng)用研究中對(duì)越來越多的代謝物進(jìn)行定量分析。