環(huán)肽的結(jié)構(gòu)多樣性及藥理作用

董家瀟 宋亞紅 李修政 嚴佳棟

幾十年來，肽一直是生物化學(xué)領(lǐng)域一個重要而多樣的研究方向。自然界中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)肽都以三維構(gòu)象折疊形式存在，特定的三維結(jié)構(gòu)為肽提供了獨特的活性和選擇性。隨著研究的不斷深入，科研人員發(fā)現(xiàn)了越來越多的獨特肽，其中游離的N和C末端與形成環(huán)狀骨架的常規(guī)肽鍵相連，普遍稱為“環(huán)狀”肽。環(huán)肽是自然界中最重要的生物分子之一，與傳統(tǒng)的直線肽相比具有更高的細胞滲透性和更好的生物學(xué)活性[1,2]，其具有的有限構(gòu)象柔韌性極大地增加了它們的代謝穩(wěn)定性，并提高了它們對靶標的結(jié)合親和力和特異性。另外，環(huán)肽的表面積較大，在降低吉布斯自由能的熵項中起著重要作用，使這些分子以非常高的親和力與多種不相關(guān)的受體結(jié)合[2]，并且環(huán)肽比直線肽缺少了氨基和羧基末端官能團，使整體結(jié)構(gòu)更耐降解，延長作用時間。在過去的幾十年中，自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1 000余種環(huán)狀肽，其中臨床上已經(jīng)批準了超過40種環(huán)肽藥物[3]，并且平均每年大約有一種新的環(huán)肽藥物進入市場，包括最早應(yīng)用于臨床的短桿菌肽S、萬古霉素、激素類、催產(chǎn)素等。在本文中，筆者結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，總結(jié)了目前已應(yīng)用或潛在應(yīng)用于臨床的環(huán)肽藥物，對環(huán)肽在抗菌，抗癌，抗真菌，抗病毒等藥理活性方面進行討論，因篇幅有限，部分相關(guān)環(huán)肽[4-14]本文并未詳細列舉。

1 抗菌環(huán)肽

1944年，英國科學(xué)家首次在土壤細菌 Bacillus brevis中發(fā)現(xiàn)短桿菌肽S(gramicidin S，GS)的存在，并在之后的幾年里確定其晶體結(jié)構(gòu)和作用機制[15]。繼GS之后，科研人員又發(fā)現(xiàn)許多天然抗菌環(huán)肽，萬古霉素是一種經(jīng)典而功能強大的環(huán)狀糖肽抗生素，于1958年被FDA批準上市，作為治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌血癥的一線抗生素用藥[16]。萬古霉素的結(jié)合靶標不是某些特定的酶，而是含有N-Ac-glucosamine (NAG) 和N-Ac-muramic acid (NAM)的肽。這種結(jié)合作用可能抑制NAG和NAM聚合物的生物合成，并進一步阻止形成細菌細胞壁的骨干結(jié)構(gòu)。此外，萬古霉素還可能影響交聯(lián)酶的功能，并進一步影響細菌細胞壁的交聯(lián)。目前萬古霉素已經(jīng)在臨床中廣泛使用了近60年[17]。達托霉素是一種從土壤細菌玫瑰鏈霉菌中分離出來的環(huán)狀脂肽抗生素[18]。自2003年獲得FDA批準以來，達托霉素一直被用于治療革蘭陽性細菌引起的嚴重感染。在臨床上，它被認為是抵抗耐藥病原體的最后手段。達托霉素包含13個氨基酸殘基，其中10個組成環(huán)狀骨架，其他3個殘基(L-Trp，D-Asn和L-Asp)與癸酰基脂質(zhì)體一起形成環(huán)狀長鏈。見圖1。

Teixobactin于2015年被Ling等[20]首次報道，屬于一類新的環(huán)肽抗生素，在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)該類環(huán)肽和大多數(shù)抗生素肽不同，teixobactin是通過一種名為“iChip”的新型多通道技術(shù)從以前無法培養(yǎng)的細菌中分離出來的。Teixobactin對革蘭陽性病原體具有顯著的抗菌活性，包括耐青霉素的鏈球菌肺炎(PRSP)，耐萬古霉素的腸球菌(VRE)和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)。Teixobactin包含11個氨基酸，其中4個氨基酸殘基形成十肽環(huán)。在所有殘基中，有5個非天然氨基酸，包括L-Allo-enduridineidine，N-Me-D-Phe，D-Gln，D-Thr，和D-Allo-Ile。許多機制研究證明，teixobactin與萬古霉素相似，為細胞壁合成抑制劑，并證實脂質(zhì)Ⅱ和脂質(zhì)Ⅲ是teixobactin的兩個結(jié)合靶點，所以該藥可能具有雙重抗菌功能，且很難對其產(chǎn)生耐藥性。見圖1。

除天然存在的環(huán)肽外，人們還通過化學(xué)修飾的方法合成一系列半合成的環(huán)狀脂糖肽[21]，包括特拉萬星，達巴萬星和奧利萬星等(以特拉萬星為代表)，這三種新抗生素與萬古霉素屬于同一種類，均包含5個固定殘基的共同七肽核心，這些核心充當(dāng)D-Ala-D-Ala靶標的主要結(jié)合位點，且均含有親脂性側(cè)鏈，這些藥物與其靶標的結(jié)合會阻止肽聚糖前體在細菌細胞壁中的轉(zhuǎn)肽作用。通過微調(diào)它們對不同細菌菌株或不同藥代動力學(xué)特性的活性，其結(jié)構(gòu)上的細微變化會引起藥理作用的細微差異。Armaganidis等[22]發(fā)現(xiàn)POL7080是作用于銅綠假單胞菌所特有的抗菌環(huán)肽，與其他環(huán)肽不同，它是通過肽庫合成和篩選增強抗菌活性的多次迭代開發(fā)的，通過D-Pro-L-Pro b-turn基序(Polyphor專有PEM技術(shù)的基礎(chǔ))穩(wěn)定其二級結(jié)構(gòu)后，并通過氨基酸取代進行了幾輪優(yōu)化，新的14個氨基酸的肽顯示出減少的細胞裂解，但對銅綠假單胞菌具有高活性和選擇性。對有效抗生素的分析顯示與膜蛋白LptD結(jié)合，參與膜生物的發(fā)生，因此證明了前體的新作用方式。一項1期臨床試驗確定了POL7080的臨床安全性和耐受性，目前該抗生素正在2期評估中，以治療銅綠假單胞菌感染[23]。見圖1。

Hover等[24]通過一種與培養(yǎng)無關(guān)的土壤微生物組篩選策略，發(fā)現(xiàn)了兩種鈣依賴性抗生素Malacidin A和B(Fig.1E)。它們對革蘭陽性細菌表現(xiàn)出廣泛的活性，包括耐多藥金黃色葡萄球菌USA300，耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌NRS146(VISA)和屎腸球菌(VRE)。Hashizume等[25]從土壤放線菌菌株Amycolatopsis sp.ML1-hF的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)帕加米星A，B，C和D抗菌環(huán)肽。其中帕加米星A和C對革蘭陽性細菌(包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素的腸球菌(VRE)顯示出優(yōu)異的抗菌活性，而帕加米星B和D對這些細菌的抗菌活較弱，但這四種環(huán)肽對革蘭陰性菌均沒有活性。Kitani等[26]發(fā)現(xiàn)從海洋放線菌菌株Streptomyces sp.GKU 220中分離出抗菌環(huán)二肽rakicidinF。在后期抗微生物活性測定中發(fā)現(xiàn)rakicidinF在劑量為25 μg的濃度時對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有抑制活性作用。見圖1。

圖1 抗菌環(huán)肽化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 抗癌環(huán)肽

臨床藥理學(xué)證明，抗腫瘤活性肽比傳統(tǒng)的藥物效果更好，更易于吸收且毒副作用小。一般由20～30個氨基酸殘基組成，可特異性的與腫瘤細胞結(jié)合，直接或間接抑制腫瘤細胞，誘導(dǎo)凋亡。嗜冷菌素A-H是從不同的青霉菌株中發(fā)現(xiàn)的環(huán)三肽[27]。有數(shù)據(jù)顯示，嗜冷菌素D對P388鼠白血病細胞(ID50=10.1 μmol/L)具有可接受的抗癌活性范；嗜冷菌素G顯示出對HepG2肝癌細胞具有明顯的降脂能力(IC50=10 μmol/L)；而嗜冷菌素E對HCT116(結(jié)腸)細胞系(IC50=28.5 μmol/L)表現(xiàn)出選擇性抗增殖活性，比順鉑(IC50=33.4 μmol/L)更有效[28]，其他嗜冷菌素沒有生物學(xué)活性。Wewakazole B是一種抗腫瘤環(huán)十肽，來自紅海Moorea Produces菌株的次生代謝產(chǎn)物[29]。在隨后的鐵載體檢測中，證明該環(huán)肽是非活性的，并使用MS和NMR技術(shù)驗證其結(jié)構(gòu)。裸藻肽A和B是從蘑菇裸藻(Gymnopus fusipes)中分離出的兩個高度N甲基化的環(huán)肽。Ványolós等[30]發(fā)現(xiàn)裸藻肽A和B在許多人類癌細胞系(例如皮膚表皮細胞系(A431)，宮頸細胞系(Hela)和乳腺癌細胞系(MCF7，T47D和MDAMB-231)中顯示出潛在的抗增殖活性。兩種環(huán)肽都比對照品順鉑至少高出兩個數(shù)量級。Reniochalistatin A-E是一種從中國南海永興島采集的海生海綿Reniochalina stalagmitis中分離的四種環(huán)七肽和一種環(huán)八肽[31]，對五種不同的人類癌細胞系(RPMI-8226，MGC-803，HL-60，HepG2和HeLa)測試了Reniochalistatin A-E。研究結(jié)果表明，環(huán)狀八肽Reniochalistatin E對骨髓瘤RPMI-8226和胃MGC-803細胞具有生物活性，IC50值分別為4.9 μmol/L和9.7 μmol/L。但是對白血病HL-60和肝癌HepG2(IC50> 20.0 μmol/L)和宮頸HeLa(IC50> 17.3 μmol/L)細胞無活性，另外四種七肽(A-D)對測試細胞顯示無活性。見圖2。

圖2 抗癌環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

ALRN-6924是一種基于訂書肽的MDM2和MDMX的雙重抑制劑，其作用之一是可中斷p53的抑制并恢復(fù)腫瘤細胞中正常p53介導(dǎo)的細胞活性[32]。該種環(huán)肽通過在同一面上橋接兩個氨基酸側(cè)鏈，以增加穩(wěn)定性，除此之外，該過程還可以促進肽細胞的滲透性。目前，ALRN-6924正在對p53蛋白干預(yù)的晚期實體瘤或淋巴瘤患者進行2期試驗，以及針對急性髓細胞性白血病或晚期骨髓增生異常綜合癥患者的1期試驗。

3 抗真菌肽

Nakamura等[33]從真菌菌株MF-347833.83的培養(yǎng)液中分離出一種抗真菌環(huán)狀六肽：ASP2397，該化合物的結(jié)構(gòu)類似于異羥肟酸酯鐵氧體，具有螯合鋁離子的能力，并對曲霉菌種表現(xiàn)出有效的抗真菌活性，在高濃度(50 μg/ml)下對哺乳動物細胞無細胞毒性作用，且ASP2397比其他衍生物更易溶，并顯示出更大的藥物開發(fā)潛力。Colisporifungin是一種在尚未報道過的Colispora cavincola液體培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的新型環(huán)狀去脂肽[34]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，劑量為2 μg/ml的Colisporifungin可誘導(dǎo)卡泊芬凈對病原性真菌產(chǎn)生很強的抗真菌活性，從而使卡泊芬凈的IC50從約33 nmol/L降至6.2 nmol/L，效能提高5.3倍。此外，當(dāng)針對白色念珠菌進行測試時，劑量為1 μg/ml的Colisporifungin會降低卡泊芬凈的IC50。Theonellamide G是從埃及洪加達紅海沿岸的海綿Theonella swinhoei中分離出來的一種雙環(huán)糖肽[35]，它對白色念珠菌和兩性霉素B的耐藥菌株表現(xiàn)出有效的抗真菌活性(IC50=4.49 μmol/L；2.0 μmol/L)。此外，它還對人結(jié)腸癌細胞系(HCT-116)具有優(yōu)異的細胞毒活性，IC50為6.0 μmol/L[36]。Ma等[37]在tamarii培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)二硫環(huán)-(Leu-Val-Ile-Cys-Cys)的環(huán)狀五肽，以及名為malformin E的五肽，該種環(huán)肽除了表現(xiàn)出有效的抗癌作用外，還顯示了對枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和大腸桿菌的潛在抗菌活性，對白色念珠菌和茄形鐮刀菌的抗真菌MIC值分別為0.91、0.45、1.82、0.91、3.62、7.24和7.24 μmol/L。見圖3。

圖3 抗真菌肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4 抗病毒環(huán)肽

Aspergillipeptide D是一種環(huán)狀五肽，是由真菌曲霉屬(Aspergillus sp.)的培養(yǎng)液中分離出來的[38]。Aspergillipeptide D在對Vero細胞系(IC50=9.5 μmol/L)的非細胞毒性濃度下，對1型單純皰疹病毒(HSV-1)表現(xiàn)出良好的抗病毒活性。它還顯示出對HSV-1-106和HSV-1-153(對阿昔洛韋有抗藥性的臨床分離株)具有近50%的抗病毒活性。Liang等[39]在深海衍生的真菌菌株Simplicillium中分離了一個新的線性肽Simplicilliumt I和4個新的環(huán)狀肽Simplicilliumtides J-M，發(fā)現(xiàn)環(huán)肽Simplicilliumtides J對Aspergillus versicolor和Curvularia australiensis表現(xiàn)出顯著的抗真菌活性和抗HSV-1作用，IC50值分別為14.0、16.7和15.6 μmol/L，并討論內(nèi)酯鍵和脂肪酸鏈片段的取代基對這些類型環(huán)肽的生物活性影響。Simplicilliumtides K是從深海來源的菌株Simplicillium obclavatum EIODSF 020.87中發(fā)現(xiàn)的[39]。它對HSV-1表現(xiàn)出有效的抗病毒活性，IC50值為14.0 μmol/L，并且還對黑云藻表現(xiàn)出明顯的抗真菌活性。有相關(guān)研究利用計算機篩選與人免疫缺陷病毒1型轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄激活因子(HIV-1 Tat)綴合的商業(yè)環(huán)肽配體，通過分子對接和分子動力學(xué)技術(shù)模擬與埃博拉病毒抑制劑的偶聯(lián)作用，該研究團隊從313個商業(yè)環(huán)肽和一個HIV-1 Tat肽中修飾了614個配體，最終得到配體023是與HIV-1 Tat結(jié)合來抑制埃博拉病毒的最佳環(huán)肽[40]。見圖4。

圖4 抗病毒環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

5 其他環(huán)肽

在過去的幾年中，還報道了許多具有其他生物活性的環(huán)肽。從鏈霉菌屬菌種的培養(yǎng)物中獲得了兩個環(huán)狀肽[41]，稱為Pentaminomycin A和B， Pentaminomycin A通過減緩酪氨酸酶，酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP-2)等黑色素生成酶的表達來抑制α-MSH刺激的黑色素的合成。從波羅的海藍藻提取物中提取的具有生物活性的環(huán)狀六肽Anabaenopeptins 1,該物質(zhì)包含Dolichospermun spp.(10%),Aphanizomenon flos-aquae (40%)和Nodularia spumigena (50%)。它們均對蛋白質(zhì)磷酸酶1和羧肽酶A表現(xiàn)出抑制作用，但對胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和凝血酶沒有抑制作用[42]。最后，F(xiàn)DA近年來批準上市的第一個從頭開發(fā)的藥物是peginesatide，該藥用于治療無法使用促紅細胞生成素[23]所導(dǎo)致的嚴重貧血。另有研究中通過針對紅細胞生成素的噬菌體逐級篩選而發(fā)現(xiàn)的受體[43]。

然后將其與聚乙二醇(PEG)發(fā)生二聚，從而增加血液中的親和力，效力和循環(huán)時間，但是遇到臨床試驗中的許多問題，在批準一年后自愿退出市場。除這些化合物外，最近還報道了許多其他生物活性環(huán)肽。例如，內(nèi)環(huán)化合物A和B是兩個環(huán)狀四肽[44]，分別對血管加壓素受體1A和5-羥色胺受體5HT2b表現(xiàn)出良好的親和力90，具有顯著的降脂作用。Kaneda等[45]發(fā)現(xiàn)環(huán)亞麻肽(CL)除了具有抗瘧和免疫抑制作用之外，還具有破骨細胞分化抑制活性，該小組利用TRAP活性作為破骨細胞分化的指標，篩選了在先前的植物化學(xué)研究中分離出的化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)亞麻肽所顯示出的破骨細胞分化抑制活性能力明顯強于陽性對照(姜黃素：IC50 7.50 lM，伊普黃酮：IC50 17.2 lM)。Dishon等[46]篩選出一種新型環(huán)肽蛋白模擬物c(MyD 4-4)來抑制TLR配體的炎性反應(yīng)以及對NF-kB進行激活，該種環(huán)肽可以特異性地阻斷髓樣分化因子(MyD88)，防止MyD88二聚化，以及降低小鼠多發(fā)性硬化癥。因此，使用c(MyD 4-4)調(diào)節(jié)MyD88依賴性信號傳導(dǎo)是降低自身免疫性CNS疾病先天性免疫不良反應(yīng)的潛在治療策略。見圖5。

綜上所述，長期以來，由于其治療潛力，人們一直對天然來源的環(huán)肽給予了極大的關(guān)注。天然環(huán)肽具有抵抗細菌和病毒感染的作用，從而克服了日益增加的抗生素耐藥性現(xiàn)象。但是在環(huán)肽治療劑的開發(fā)中仍然存在一些重要的挑戰(zhàn)，其中兩個最重要的挑戰(zhàn)是口服有效性和細胞通透性。近年來應(yīng)用的創(chuàng)新方法解決了這些挑戰(zhàn)中的部分問題，包括使用細胞穿透性肽、具有烴接頭的α-螺旋構(gòu)象穩(wěn)定化的肽、N-甲基化的體外進化肽等。根據(jù)目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，開發(fā)具有良好口服利用率并通過被動擴散有效進入細胞的環(huán)狀肽，可能有必要考慮分子量較小且肽鍵較少的肽。

圖5 其他環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式