提高黔淫羊藿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

祝清燦，孫宜春，羅 倩，羅文平，劉 凱，李慧馨，王 杏，段 麗

國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴陽 550026

黔淫羊藿為小蘗科植物粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumSteam、氈毛淫羊藿EpimediumcoactumH.R.Liang et W.M.Yan及黔嶺淫羊藿EpimediumleptorrhizumStearn的干燥地上部分，無臭，味微苦，夏秋二季莖葉茂盛時(shí)采收，為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收錄的貴州省少數(shù)民族用藥[1]，主要分布于四川、貴州、云南、湖北、廣西等省區(qū)[2-4]，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效[5-7]，臨床主要用于治療陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣等癥[8]。研究表明，淫羊藿屬植物中主要含黃酮、木脂素、生物堿、揮發(fā)油、苯酚苷、多糖及微量元素等成分[9-10]，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、抗衰老、提高免疫力、抑制腫瘤、抑制骨吸收等藥理作用[11-14]。黔淫羊藿現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅收載性狀、薄層鑒別、含量測(cè)定等檢測(cè)項(xiàng)目。本研究增加了顯微鑒別、水分和灰分、浸出物檢查項(xiàng)目，改進(jìn)了薄層鑒別方法，用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Vanquish型高效液相色譜儀(在線脫氣，六元泵，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，工作站，賽默飛世爾科技有限公司)；ME204TE/02型電子天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；SB25-12DTS型數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Goodsee-Ⅱ型紫外分析儀(上海科哲生化科技有限公司)；202-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。色譜柱：太瑋科技JADE-PAK ODS-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)；安捷倫 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；菲羅門Superlu C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；依利特HypersilBDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；迪馬Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試藥

朝藿定C(批號(hào)110738-201905)，淫羊藿苷(批號(hào)110731-201518，含量94.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)；乙腈為色譜純，水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

粗毛淫羊藿、天平山淫羊藿、氈毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿原植物及樣品均由國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司種植部提供，且經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院何順志教授鑒定，分別為小蘗科Berberidaceae淫羊藿屬Epimedium植物粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumSteam、氈毛淫羊藿EpimediumcoactumH.R.Liang et W.M.Yan及黔嶺淫羊藿EpimediumleptorrhizumStearn的干燥地上部分。憑證標(biāo)本存放于國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司。樣品來源見表1。

表1 樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

將葉片用水浸泡后擦干，分別撕取上表皮及下表皮，制片，透化，置顯微鏡下進(jìn)行觀察。粗毛淫羊藿葉：表面觀，上、下表皮細(xì)胞垂周壁深波狀彎曲。下表皮氣孔眾多，圓形或類圓形，不定式。非腺毛多見，粗短，先端鈍圓，多數(shù)頂端細(xì)胞極長(zhǎng)，基部細(xì)胞較短。沿葉脈有異細(xì)胞縱向排列，內(nèi)含多個(gè)草酸鈣柱晶，形成明顯的晶鞘纖維。天平山淫羊藿非腺毛多見，細(xì)長(zhǎng)，先端較尖。氈毛淫羊藿非腺毛密集交錯(cuò)，柔軟，彎曲，基部細(xì)胞較小。黔嶺淫羊藿非腺毛少見。見圖1。

注：A.上表皮細(xì)胞；B.下表皮細(xì)胞；C.氣孔；D.草酸鈣柱晶；E.粗毛淫羊藿非腺毛；F.天平山淫羊藿非腺毛；G.氈毛淫羊藿非腺毛。

2.2 薄層鑒別

取黔淫羊藿粉末(過3號(hào)篩)1 g，加石油醚(60 ℃～90 ℃)20 mL，加熱回流30 min，濾過，棄去濾液，濾渣加乙醇25 mL，超聲提取30 min(功率600 W，頻率40 kHz)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使其溶解，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使其溶解，作為供試品溶液[15]。另取淫羊藿苷對(duì)照品、朝藿定C對(duì)照品，分別加甲醇制成1 mg·mL-1溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(TLC)實(shí)驗(yàn)操作[16]，分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶1∶0.5)為展開劑，預(yù)飽和20 min，展開，取出，晾干，噴以100 g·L-1的三氯化鋁乙醇試液，105 ℃下加熱3～6 min，置于紫外光燈365 nm處檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

注：1、2.粗毛淫羊藿；3、4.氈毛淫羊藿； 5、6.天平山淫羊藿；7、8.黔嶺淫羊藿；9.淫羊藿苷、朝藿定C對(duì)照品；10.淫羊藿苷對(duì)照品。

2.3 水分、總灰分和浸出物

按《中華人民共和國藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》)2020年版[16]，分別測(cè)定黔淫羊藿中的水分、總灰分和浸出物的含量(%)。12批樣品水分平均值為9.50%，以平均值的120%設(shè)限則為11.40%，故建議將水分標(biāo)準(zhǔn)定為不得大于12%；總灰分平均值為6.42%，以平均值的120%設(shè)限則為7.70%，故建議將總灰分標(biāo)準(zhǔn)定為不得大于8%；浸出物平均值為18.72%，以平均值的80%設(shè)限則為14.98%，故建議將浸出標(biāo)準(zhǔn)定為不得少于15%。結(jié)果見表2。

表2 黔淫羊藿水分、灰分和浸出物測(cè)定結(jié)果

2.4 淫羊藿苷和朝藿定C含量測(cè)定

2.4.1供試品溶液的制備 取本品粉末(過3號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 Hz)1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液[17-18]。

2.4.2混合對(duì)照品溶液的制備 取朝藿定C對(duì)照品及淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇，制成分別含朝藿定C 0.20 mg·mL-1、淫羊藿苷0.02 mg·mL-1的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4.3空白對(duì)照溶液的制備 取稀乙醇作為陰性樣品溶液。

2.4.4色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(30∶70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；流速為1 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；理論板數(shù)按朝藿定C峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

2.4.5專屬性 分別取2.4.1、2.4.2、2.4.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各10 μL，按2.4.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，陰性樣品無干擾，見圖3[19]。

注：A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；1.朝藿定C；2.淫羊藿苷。

用二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品溶液中的淫羊藿苷和朝藿定C色譜峰進(jìn)行峰光譜掃描和質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)，結(jié)果峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)角度<峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)閾值，供試品中淫羊藿苷和朝藿定C光譜圖與譜庫中淫羊藿苷和朝藿定C光譜圖匹配理想，說明淫羊藿苷和朝藿定C峰為純峰，專屬性強(qiáng)，符合要求。

2.4.6線性關(guān)系考察 精密吸取2.4.2項(xiàng)下朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品0.5、1、2、5、7、10 mL，分別置于10 mL的量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按2.4.4項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定各自峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得朝藿定C的回歸方程：y=31.619x+0.037 4，r2=0.999 9，線性范圍為10.27～205.38 μg·mL-1；求得淫羊藿苷的回歸方程：y=37.535x+0.0245，r2=0.999 9，線性范圍為2.50～49.95 μg·mL-1。結(jié)果表明，朝藿定C質(zhì)量濃度在10.27～205.38 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系；淫羊藿苷質(zhì)量濃度在2.50～49.95 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系；可用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。

2.4.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品混合溶液(朝藿定C 0.2 mg·mL-1，淫羊藿苷20 μg·mL-1)10 μL，按2.4.4項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，朝藿定C、淫羊藿苷峰面積之和的RSD值為0.12%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.4.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取黔淫羊藿(批號(hào)20170501)粉末(過3號(hào)篩)，混勻，取6 份，每份約0.2 g，精密稱定，按2.4.3供試品溶液制備方法及色譜條件測(cè)定。朝藿定C、淫羊藿苷峰面積之和的RSD≤3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.4.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)制備的供試品溶液，按2.4.4項(xiàng)下色譜條件，分別于0、4、8、12、16、24 h測(cè)定淫羊藿苷和朝藿定C的總峰面積[19]。結(jié)果表明，朝藿定C及淫羊藿苷之和的RSD 為0.89%，表明朝藿定C及淫羊藿苷在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.10色譜柱考察 取黔淫羊藿(批號(hào)20170501)，用5種品牌的色譜柱測(cè)定淫羊藿苷和朝藿定C的含量。色譜柱：太瑋科技JADE-PAK ODS-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)，安捷倫 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，菲羅門Superlu C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，依利特HypersilBDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，迪馬Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。結(jié)果顯示，2個(gè)色譜峰分離良好，含量測(cè)定結(jié)果無顯著差異，朝藿定C、淫羊藿苷峰面積之和的RSD值為2.3%，表明測(cè)定方法的耐用性較好。

2.4.11加樣回收實(shí)驗(yàn) 取已知含量的黔淫羊藿(批號(hào)20170501)，混勻，取6份，每份約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，每份分別加混合對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按2.4.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按2.4.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算朝藿定C和淫羊藿苷回收率，見表3、表4。朝藿定C平均回收率為101.62%，RSD為0.22%；淫羊藿苷的平均回收率為93.72%，RSD為0.21%；表明方法的準(zhǔn)確度較好。

表3 朝藿定C加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 淫羊藿苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.12樣品含量測(cè)定 取粗毛淫羊藿溶液、氈毛淫羊藿溶液、天平山淫羊藿溶液、黔嶺淫羊藿各3批，按2.4.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按2.4.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 黔淫羊藿中朝藿定C與淫羊藿苷含量之和測(cè)定結(jié)果

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，考慮到各種藥材原料含量的波動(dòng)，建議暫定粗毛淫羊藿含朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和不得少于0.2%；氈毛淫羊藿和天平山淫羊藿含朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和不得少于1.0%；黔嶺淫羊藿中朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和的平均值為0.05%，因含量過低，故對(duì)黔嶺淫羊藿中朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)暫不收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

3 討論

3.1 TLC供試品溶液制備

根據(jù)化學(xué)成分的溶解性，分別對(duì)以下條件進(jìn)行考察：提取溶劑(石油醚、甲醇、乙醇)，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(15、25、35 mL)，正丁醇萃取次數(shù)(1、2次)。結(jié)果表明，按本文2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液鑒別斑點(diǎn)最清晰[20]。

3.2 薄層色譜條件考察

根據(jù)展開樣品主要化學(xué)成分的極性，對(duì)以下條件進(jìn)行了考察：展開系統(tǒng)如：水飽和的正丁醇，石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶2)，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1.5∶4∶0.7)，正己烷-乙酸乙酯-甲酸(3∶1∶0.15)，乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1.3∶1)，三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(6.5∶3.5∶1.5∶0.5)；硅膠板種類(硅膠G板、硅膠H板，硅膠GF254板)；點(diǎn)樣量(3、5、10、15 μL)；條帶點(diǎn)樣寬度(5、6、7、8 mm)；薄層板預(yù)平衡時(shí)間(10、20、30 min)；展開溫度(10、20、30 ℃)[20]。結(jié)果表明，按2.2項(xiàng)下色譜條件，供試品與對(duì)照品及對(duì)照藥材在不同的檢視條件下色譜條帶數(shù)較多，展開效果較好，分離度較好。

3.3 高效液相色譜法(HPLC)供試品溶液制備

分別對(duì)以下條件進(jìn)行考察：提取溶劑(甲醇、不同濃度乙醇)，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(30、50、70 mL)，提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5 h)。結(jié)果表明，按2.4.1項(xiàng)下方法制備的供試品溶液峰面積最大[20]。

3.4 HPLC色譜條件選擇

分別考察以乙腈-水(25∶75)。乙腈-水(30∶70)和乙腈-水(35∶65)為流動(dòng)相時(shí)的分離情況，結(jié)果表明，以乙腈-水(30∶70)為流動(dòng)相，各色譜峰的分離效果較好。用二極管陳列檢測(cè)器對(duì)供試品溶液中淫羊藿苷和朝藿定C在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，淫羊藿苷在波長(zhǎng)為270 nm處的峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，峰面積最大，由此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

本研究對(duì)黔淫羊藿進(jìn)行了顯微鑒別，對(duì)水分、總灰分、浸出物進(jìn)行測(cè)定，改進(jìn)了薄層色譜鑒別方法，改用高效液相色譜法測(cè)定黔淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C含量，該方法專屬性較強(qiáng)，穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性較好，準(zhǔn)確度較高，為黔淫羊藿的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提高提供科學(xué)依據(jù)。