有絲分裂期DNA合成（MiDAS）及其介導(dǎo)的端粒復(fù)制*

余雨楊 侯凱龍 仝津愷 張艷多 賈舒婷**

（1）昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2）昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500）

1 有絲分裂期DNA合成（mitotic DNA repair synthesis，MiDAS）機(jī)制是保證基因組完整性的重要機(jī)制

1.1 復(fù)制壓力誘導(dǎo)MiDAS的發(fā)生，從而維持基因組的完整性

真核細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性主要依賴于細(xì)胞增殖過(guò)程中精確完整的基因組復(fù)制以及染色體的正確分離［1-3］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時(shí)，S期進(jìn)行的DNA復(fù)制會(huì)受到阻礙，造成復(fù)制叉的減緩或停滯，部分細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂時(shí)仍然存在復(fù)制不完全或DNA結(jié)構(gòu)異常的現(xiàn)象，這些都將威脅正常的細(xì)胞周期進(jìn)程［3-4］。機(jī)體為應(yīng)對(duì)可能威脅基因組穩(wěn)定性的因素，進(jìn)化出了檢查點(diǎn)系統(tǒng)來(lái)對(duì)復(fù)制不足或受損的DNA進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并且可以啟動(dòng)相應(yīng)的DNA修復(fù)機(jī)制［5］。過(guò)去人們普遍認(rèn)為DNA修復(fù)機(jī)制在有絲分裂期受到抑制［6-7］，然而近年的研究卻發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞能夠通過(guò)暫時(shí)減慢有絲分裂期進(jìn)程，為有絲分裂期的修復(fù)機(jī)制贏得時(shí)間［8-9］。人類(lèi)基因組的一些被稱(chēng)為脆性位點(diǎn)（fragile sites）的區(qū)域具有難以進(jìn)行復(fù)制的特性，對(duì)于染色體上累積的損傷高度敏感［10］，通常無(wú)法在S期內(nèi)準(zhǔn)確地完成DNA復(fù)制，從而產(chǎn)生復(fù)制不完全的DNA（un-replicated DNA，UR-DNA）［11］，不斷累積的UR-DNA會(huì)增加細(xì)胞的復(fù)制壓力（replication stress，RS），威脅基因組的穩(wěn)定。因此，進(jìn)入有絲分裂期之后UR-DNA的復(fù)制對(duì)維持基因組的穩(wěn)定至關(guān)重要。

盡管機(jī)體早已進(jìn)化出一系列緊密聯(lián)系的檢查點(diǎn)監(jiān)測(cè)機(jī)制，但是輕度的RS和DNA損傷所產(chǎn)生的UR-DNA往往很難觸發(fā)檢查點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，不能阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期［3］，此時(shí)的細(xì)胞仍然能夠繼續(xù)進(jìn)行染色體分離，研究發(fā)現(xiàn)，上文所描述的復(fù)制問(wèn)題頻繁地出現(xiàn)在脆性位點(diǎn)處。2015年Minocherhomji等［12］的研究首次發(fā)現(xiàn)，在脆性位點(diǎn)區(qū)域存在一種區(qū)別于傳統(tǒng)在S期進(jìn)行的復(fù)制，因?yàn)槭怯薪z分裂早期進(jìn)行的復(fù)制而被稱(chēng)作有絲分裂期DNA合 成 （mitotic DNA repair synthesis，MiDAS）。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)MiDAS是在有絲分裂早期進(jìn)行的基于同源重組（homologous recombination，HR）的修復(fù)途徑，并且在DNA聚合酶抑制劑Aphidocolin（APH）人為誘導(dǎo)RS時(shí)，能夠幫助端粒等脆性位點(diǎn)挽救復(fù)制進(jìn)程［13］。HR是修復(fù)DNA雙鏈斷裂的一種重要機(jī)制，而HR的子通路-斷裂誘導(dǎo)性修復(fù)（break-induced replication，BIR）能夠修復(fù)停滯的復(fù)制叉上的單個(gè)末 端DNA雙 鏈 斷 裂（double-strand breaks，DSBs）［14-16］。研究人員發(fā)現(xiàn)，酵母中的MiDAS與BIR具有許多相同的作用因子，需要單末端DSBs底物和具有同源序列的DNA模板生成，因此MiDAS也被認(rèn)為是一種類(lèi)似于BIR的修復(fù)途徑［17-18］。

1.2 MiDAS的發(fā)生機(jī)制

1.2.1 響應(yīng)復(fù)制壓力的MiDAS發(fā)生

人類(lèi)細(xì)胞中的MiDAS是一種依賴于RAD52及POLD3的DNA合成形式，表現(xiàn)出BIR的特征。過(guò)去的研究表明，MiDAS的發(fā)生常常伴隨著DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR），許多參與DNA損傷修復(fù)的因子都會(huì)參與到MiDAS的發(fā)生過(guò)程。

ATR（ataxia telangiectasia and Rad3-related protein，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3相關(guān)激酶）被認(rèn)為是調(diào)控MiDAS和有絲分裂之間的關(guān)鍵協(xié)調(diào)者。在RS的條件下，進(jìn)入有絲分裂期之前，ATR能夠介導(dǎo)其下游CHK1和PLK1的磷酸化，抑制CDK1活性或調(diào)控CDK1抑制激酶WEE1的活性，觸發(fā)修復(fù)機(jī)制或細(xì)胞程序性死亡來(lái)阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程（圖1a）［19］。當(dāng)受RS影響的細(xì)胞在S期積累了過(guò)多的DSBs而造成復(fù)制叉停滯時(shí)，損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)被及時(shí)招募（圖1b）。復(fù)制解旋酶和DNA聚合酶之間的解偶聯(lián)導(dǎo)致單鏈DNA（single-strand DNA，ssDNA）積累，復(fù)制蛋白A（replication protein A，RPA）被募集到停滯叉上，泛素連接酶TRAIP與增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）結(jié)合介導(dǎo)RPA對(duì)ssDNA的結(jié)合，形成的RPA-ssDNA復(fù)合體能夠促進(jìn)ATR激活所需調(diào)控因子的招募。除此以外，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合蛋白1（topoisomeraseⅡbinding protein 1，TopBP1）能 與RPA作 用 激 活A(yù)TR來(lái)響應(yīng)DNA損傷［20］。過(guò)去的研究揭示，ATR和FA核心復(fù)合物都能在損傷位點(diǎn)處募集以維持基因組的穩(wěn)定，其中FA核心復(fù)合物中的FANCD2（FA complementation group D2）在停滯的復(fù)制叉處穩(wěn)定ATR和FA核心復(fù)合物的停留，而具體機(jī)制仍不清晰。

事實(shí)上，部分損傷的細(xì)胞能夠越過(guò)檢查點(diǎn)監(jiān)測(cè)機(jī)制進(jìn)入有絲分裂期（圖1c），其中DNA解旋酶RECQ5在這一過(guò)程發(fā)揮重要作用。MiDAS的啟動(dòng)需要被CDK1磷酸化的RECQ5利用其ATP酶活性直接與HR相關(guān)的RAD51結(jié)合，去除停滯復(fù)制叉處ssDNA上的RAD51（圖1d），幫助停滯的復(fù)制叉離開(kāi)G2/M檢查點(diǎn)。CDK1作為有絲分裂的主要調(diào)控因子，在進(jìn)入有絲分裂期后能夠磷酸化EME1，促進(jìn)MUS81（MMS and UV-sensitive protein 81）和SLX4（synthetic lethal of unknown function 4）復(fù)合物的形成［21-23］，而停滯復(fù)制叉處的FANCD2能夠招募結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶SLX1-SLX4、XPFERCC1和MUS81-EME1來(lái) 幫 助DNA損 傷 的 修復(fù)［24］。值得注意的是，進(jìn)入有絲分裂期后，TRAIP被CDK1磷酸化，從而觸發(fā)UR-DNA的分解，使得復(fù)制叉處親本DNA鏈的暴露，將MiDAS相關(guān)因子招募到這些復(fù)制不完全的部位進(jìn)行MiDAS［25］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2作為MiDAS的關(guān)鍵因子被定位于停滯叉處，通過(guò)與支架蛋白SLX4共同作用對(duì)未復(fù)制的復(fù)雜DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理［26］，負(fù)責(zé)將MiDAS相關(guān)的多種結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶招募到損傷位點(diǎn)發(fā)揮功能。人們普遍認(rèn)為FANCD2是常見(jiàn)脆性位點(diǎn)（common fragile sites，CFSs）的標(biāo)志物［27-28］，被定位于中期染色體上缺口和斷裂處，但FANCD2的具體作用機(jī)制仍不清楚。SLX4能夠通過(guò)其SUMO相互作用基序被招募到染色質(zhì)處或與端粒結(jié)合蛋白TRF2（telomeric repeat-binding factor 2）相互作用而特異性定位于端粒處［23，29］，SLX4與FANCD2在這些位點(diǎn)招募MUS81-EME1切割復(fù)制中間體以產(chǎn)生DSBs（圖1d）［30-32］。RAD52能夠作用于暴露的親本ssDNA（圖1e），它與ssDNA和RPA相互作用的能力以及它多聚的特性使RAD52能夠幫助ssDNA進(jìn)行同源搜索并退火到模板鏈的微同源區(qū)域［33］，然而進(jìn)行微同源搜索前所需的鏈侵入及移位環(huán)（displacement loop，D-loop）的形成是否同樣由RAD52介導(dǎo)還需進(jìn)一步的研究證明。復(fù)制性DNA聚合酶δ的催化亞基和非催化亞基分別是POLD1和POLD3，兩者都與RS后的有絲分裂相關(guān)，但是只有POLD3的缺失會(huì)阻礙MiDAS的發(fā)生，并且導(dǎo)致中期染色體上DNA鏈的斷裂增加［12］，提示POLD3相關(guān)的DNA聚合酶δ復(fù)合物能夠促進(jìn)DNA從頭合成完成MiDAS（圖1f，g）。

1.2.2 損傷修復(fù)相關(guān)蛋白為MiDAS進(jìn)程提供保障

除上文所述的在MiDAS發(fā)生中起到主要作用的因子外，還有一些蛋白質(zhì)能夠?yàn)镸iDAS的準(zhǔn)確進(jìn)行提供保障。位于RAD52上游的DNA解旋酶RTEL1（regulator of telomere elongation helicase 1）可以被SLX4招募，依賴RTEL1的ATP酶/解旋酶活性解決DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)以避免復(fù)制-轉(zhuǎn)錄沖突的過(guò)度積累，端粒處的Bloom綜合征解旋酶（a complex of Bloom’s syndrome helicase，BLM）也能起到相似的作用，幫助MiDAS的有效進(jìn)行［34］。當(dāng)RS存在的情況下，位于ssDNA的RAD52能夠阻礙復(fù)制叉上叉重塑因子SMARCAL1的募集和隨后重組相關(guān)的MRE11所介導(dǎo)的新生鏈降解，保證停滯復(fù)制叉的完整性以進(jìn)行MiDAS修復(fù)［35-36］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，非癌細(xì)胞中RAD52的缺失能夠促進(jìn)MiDAS的發(fā)生，提示RAD52依賴的MiDAS主要在癌細(xì)胞中進(jìn)行，而FANCD2對(duì)于正常細(xì)胞及癌細(xì)胞中MiDAS的發(fā)生是不可或缺的，這意味著細(xì)胞可能適應(yīng)了一種不依賴RAD52的BIR機(jī)制［37］。隨著對(duì)MiDAS的研究更加深入，人們了解到RECQ5除了能分解RAD51之外，還能夠在進(jìn)入有絲分裂期后促進(jìn)MUS81-EME1對(duì)復(fù)制中間體的切割［38］。有研究提出，細(xì)胞遺傳學(xué)上觀察到的缺口或斷裂并非傳統(tǒng)意義上人們認(rèn)為的不完全復(fù)制DNA結(jié)構(gòu)的存在，而是由于斷裂誘導(dǎo)的復(fù)制過(guò)程中的切割作用［19］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞中敲除BIR相關(guān)的MUS81或POLD3后，觀察到染色體上CFSs的表達(dá)減少支持了這一結(jié)論［12］。此外，染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白SMC2（structural maintenance of chromosomes 2）和端粒處的SMC5/6（structural maintenance of chromosomes 5/6）能夠幫助染色質(zhì)纖維折疊成高度緊密的染色體［39］，與染色體黏合素 的 釋 放 因 子WAPL（wings apart protein-like，WAPL）負(fù)責(zé)維持有絲分裂期染色體特有的X形結(jié)構(gòu)［40-41］，保證各個(gè)細(xì)胞周期中準(zhǔn)確的染色體結(jié)構(gòu)同時(shí)促進(jìn)有絲分裂期姐妹染色單體的分離［42］，避免染色體異常事件的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)觀察到SMC2或WAPL的缺失導(dǎo)致有絲分裂前期姐妹染色單體難以分離，MUS81不能被招募到停滯復(fù)制叉的FANCD2處，阻礙MiDAS的發(fā)生［12］。有趣的是，最近的研究發(fā)現(xiàn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）能夠誘導(dǎo)DNA損傷的積累，進(jìn)而促進(jìn)RAD52和POLD3招募，從而促進(jìn)BIR［43］，這提出了一種可能性，即ROS的積累可能在某些癌癥中啟動(dòng)MiDAS的關(guān)鍵。

2 異常的MiDAS威脅基因組的穩(wěn)定

通常意義上，MiDAS是保證基因組完整性的重要機(jī)制，近年的研究主要集中于MiDAS。然而最近有人提出MiDAS并非始終發(fā)揮著穩(wěn)定基因組的作用。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)在檢查點(diǎn)激酶CHK1敲除的細(xì)胞中，UR-DNA、復(fù)制中間體和有絲分裂異常的細(xì)胞大量存在，造成RS的異常積累［13］，而當(dāng)超過(guò)機(jī)體所能承受的閾值時(shí)，如dNTP（deoxyribonucleoside triphosphate pool）不足以維持MiDAS的正常進(jìn)行。這時(shí)的MUS81-EME1不再只是切割復(fù)制中間體，而是在MiDAS的下游切割有絲分裂期合成的新生DNA，造成DSBs的積累，威脅染色體的穩(wěn)定性［44］。這意味著S期之后過(guò)多的UR-DNA可能會(huì)導(dǎo)致病理性MiDAS的發(fā)生，對(duì)于維持RS條件下基因組的穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)相當(dāng)不利，同時(shí)為人們對(duì)MiDAS的研究提供了新思路。

有絲分裂期的復(fù)制叉往往不受保護(hù)，此時(shí)的MiDAS就更像是一種DNA修復(fù)過(guò)程，作為細(xì)胞周期中對(duì)RS做出反應(yīng)的最后機(jī)會(huì)。先前積累的URDNA如果不能在有絲分裂期得到復(fù)制或解決，將造成染色體異常，如后期橋（anaphase bridge），滯后的染色質(zhì)（lagging chromosome），染色體斷裂/缺口及（ultra-fine anaphase bridges，UFBs）的形成（圖2）［45］。這些染色體異常事件的發(fā)生都將進(jìn)一步加劇RS及染色體不穩(wěn)定性，甚至造成基因組重排及非整倍體，其中未解決的UFBs導(dǎo)致染色體斷裂而產(chǎn)生微核，增加基因組的損傷，并可能因此導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［46］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，除了FANCD2持續(xù)存在于UFBs的末端，還有其他蛋白質(zhì)如BLM、plk1相互作用檢查點(diǎn)解旋酶（PICH）和RIF1可以定位在UFBs［47-48］。當(dāng)MiDAS受到阻礙時(shí)，RIF1能夠被招募到FANCD2標(biāo)記的超細(xì)后期橋UFBs上，分解UFBs避免微核的形成以維持機(jī)體的穩(wěn)定［46］。那些在有絲分裂期仍未得到分解的UFBs只能被當(dāng)作DNA損傷，在進(jìn)入到下一輪G1期時(shí)被包裹在53BP1核體（53BP1 nuclear bodies，53BP1-NBs）中，以期在新一輪細(xì)胞周期中能夠得以修復(fù)［49］。

3 MiDAS是維持端粒復(fù)制的重要機(jī)制

3.1 端粒的復(fù)制依賴于MiDAS的發(fā)生

端粒作為難以復(fù)制的位點(diǎn)，位于線性染色體末端以保護(hù)染色體不被降解和不受修復(fù)機(jī)制的影響［50］。在體細(xì)胞分裂的過(guò)程中，端粒會(huì)隨細(xì)胞周期的進(jìn)行而逐漸縮短，只有保證端粒末端的不斷復(fù)制，才能避免端粒磨損而引發(fā)的細(xì)胞衰老。

哺乳動(dòng)物的端粒由TTAGGG序列的串聯(lián)重復(fù)序列形成，這種富含G的性質(zhì)導(dǎo)致DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)如G4鏈體（G-quadruplexe）的形成［51］。TERRA是端粒/亞端粒區(qū)轉(zhuǎn)錄的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），能夠與端粒DNA的堿基配對(duì)形成DNA∶RNA雜交體（R-loop）阻斷復(fù)制的進(jìn)行［52］。此外，端粒處富含G的懸出末端回折后侵入端粒的雙鏈區(qū)，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)端粒環(huán)（telomere loop，T-loop）和D-loop［53］，負(fù)責(zé)復(fù)制的復(fù)制復(fù)合物（replisome）必須先將T-loop解開(kāi)才能到達(dá)染色體的末端合成DNA。T-loop和D-loop這兩種環(huán)狀結(jié)構(gòu)還可以被一種稱(chēng)為Shelterin的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合并穩(wěn)定，保護(hù)線性染色體的末端不被識(shí)別為DSBs［54］，從而避免非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和HR的修復(fù)。正是由于端粒特有的序列重復(fù)性及傾向于形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的特性，使得端粒更容易面臨復(fù)制叉停滯和復(fù)制叉崩解的情況，而不斷增殖的癌細(xì)胞，往往能夠克服端粒的縮短并維持端粒的長(zhǎng)度［43］。

在過(guò)去的研究中，人們了解到端粒維持機(jī)制的激活是穩(wěn)定基因組和建立細(xì)胞永生所必需的。端粒酶是一種可以延長(zhǎng)端粒的RNA模板酶，在大多數(shù)人類(lèi)癌癥中端粒酶被激活，幫助細(xì)胞繞過(guò)復(fù)制衰老。然而，在10%~15%的人類(lèi)癌癥中使用一種不依賴端粒酶的延長(zhǎng)機(jī)制端粒替代性延長(zhǎng)機(jī)制（alternative lengthening of telomeres，ALT）來(lái)維持端粒［17］。研究人員在ALT細(xì)胞系中首次檢測(cè)到了MiDAS，發(fā)現(xiàn)ALT細(xì)胞中存在更多的脆性端粒，并且能夠觸發(fā)MiDAS來(lái)保證端粒處復(fù)制的正常進(jìn)行，端粒酶陽(yáng)性的細(xì)胞中卻沒(méi)有MiDAS的發(fā)生［55］。隨后有研究進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中使用DNA聚合酶抑制劑APH人為的誘導(dǎo)RS后，端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞中也能夠檢測(cè)MiDAS發(fā)生，并且顯示出高度的非整倍體［56］，這意味著細(xì)胞的端粒酶的狀態(tài)并不影響RS誘導(dǎo)的MiDAS在端粒處發(fā)生。

3.2 ALT細(xì)胞端粒延伸依賴于MiDAS

引人注意的是，相較于端粒酶陽(yáng)性的細(xì)胞，ALT細(xì)胞中往往存在更多的MiDAS信號(hào)，并且那些具有更長(zhǎng)端粒的ALT細(xì)胞往往具有更高的MiDAS水平［56］，且MiDAS存在于絕大多數(shù)非整倍體癌細(xì)胞中［12］，也因此有人提出，非整倍體的存在似乎是決定受到RS的細(xì)胞是否使用端粒-MiDAS通路的關(guān)鍵因素。ALT端粒處高水平的MiDAS也引發(fā)人們思考，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生是否與ALT細(xì)胞中高水平的RS、DSBs及端粒脆性有關(guān)？

研究發(fā)現(xiàn)，ALT細(xì)胞在端粒處高水平的MiDAS往往發(fā)生在DSBs處［13］。相較端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞，ALT細(xì)胞端粒處染色質(zhì)凝縮更少，能夠提供疏松的結(jié)構(gòu)以保證修復(fù)的進(jìn)行。ALT細(xì)胞存在更多的TERRA和R-loop等二級(jí)結(jié)構(gòu)，造成ALT細(xì)胞端粒處更高水平的RS，RS也被證明是誘導(dǎo)或維持ALT表型的關(guān)鍵因素［13］。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，去除特異性降解R-loop的內(nèi)切酶RNaseH1會(huì)導(dǎo)致ALT細(xì)胞中的RS增加，同時(shí)伴有ALT活性增加［57］，提示RS誘導(dǎo)了ALT活性。在ALT癌細(xì)胞中重新引入ALT相關(guān)ATRX染色質(zhì)重塑蛋白后抑制了ALT活性，表現(xiàn)出端粒長(zhǎng)度減少、ALT相關(guān)PML小體（ALT-associated PML bodies，APBs）形成減少和C環(huán)（C-circles）水平降低［58］，提示了ALT活性與端粒的合成有關(guān)，RS誘導(dǎo)的ALT活性有助于端粒的延長(zhǎng)。除此以外，大多數(shù)ALT細(xì)胞沒(méi)有完整的G2/M檢查點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，停滯的復(fù)制叉或自發(fā)的端粒DNA損傷使得有絲分裂期的端粒和端粒聚集處存在持續(xù)的DDR，促進(jìn)了端粒內(nèi)和/或端粒間的重組，增強(qiáng)了ALT細(xì)胞中的復(fù)制和端粒延伸的活性［55，59］，而MiDAS的顯著激活為ALT端粒的維持提供了支持，同時(shí)促進(jìn)了ALT細(xì)胞的穩(wěn)定。因此，ALT細(xì)胞中存在較高水平的RS，使得ALT端粒處經(jīng)常面臨復(fù)制不完全的情況，需要更高水平的MiDAS進(jìn)行端粒處的復(fù)制“補(bǔ)償”。

關(guān)于MiDAS的研究使人們了解到盡管端粒及CFSs處的MiDAS有許多相同特性，例如對(duì)FANCD2、SLX4和POLD3的需求。與CFSs不同的是，端粒處MiDAS的發(fā)生并不需要MUS81-EME1進(jìn)行切割［13，56］，盡管其中的原因仍不清楚，但有研究猜想在接收到FANCD2的單泛素化信號(hào)后，可能由其他結(jié)構(gòu)性內(nèi)切酶如XPF-ERCC1和SLX1/SLX4復(fù)合物對(duì)受損的DNA鏈進(jìn)行切割以啟動(dòng)DNA合成，也可能是具有特殊結(jié)構(gòu)的端粒并不需要進(jìn)行切割［21，27-28］。其中，Shelterin復(fù)合物就是端粒所特有的，由雙鏈DNA相關(guān)因子TRF1和TRF2、POT1、TIN2、TPP1和RAP1組成［60］。當(dāng)使用低劑量的APH誘導(dǎo)端粒脆性時(shí)，TRF1以及兩種DNA解旋酶BLM和RTEL1能夠被招募到端粒上抑制這種端粒脆性［57］。除此之外，端粒上的TRF2能夠與BLM特異性相互作用［61］，ALT活性的誘導(dǎo)依 賴 于BLM與DNA2（DNA replication helicase/nuclease 2）相互作用介導(dǎo)ALT端粒的長(zhǎng)距離切除［62］，研究發(fā)現(xiàn)這種DNA切除的增加會(huì)導(dǎo)致有絲分裂發(fā)生停滯，為有絲分裂期進(jìn)行MiDAS提供時(shí)間基礎(chǔ)。染色體結(jié)構(gòu)維持復(fù)合物SMC5/6在細(xì)胞周期的所有階段都被定位于端粒，除了維持染色體的結(jié)構(gòu)，還能在HR過(guò)程中促進(jìn)重組中間體的分解［63］，并且它是端粒聚集所必需的［30］。SMC5/6復(fù)合物似乎通過(guò)其SUMO連接酶活性將端粒送到PML小體處，介導(dǎo)端粒聚集事件的發(fā)生，形成ALT相關(guān)PML小體（ALT-associated PML bodies，APBs）并促進(jìn)HR及ALT細(xì)胞的端粒延伸［64］。上文提到的SMARCAL1是一種依賴于ATP的DNA解旋酶，被認(rèn)為可以通過(guò)促進(jìn)停滯的復(fù)制叉逆轉(zhuǎn)來(lái)對(duì)抗RS。事實(shí)上，SMARCAL1可定位于ALT端粒并抑制ALT表型，在ALT中SMARCAL1缺失會(huì)增加端粒聚集事件、端粒損傷和端粒異質(zhì)性［36］。類(lèi)似于SMARCAL1，由TIMELESS及其伴侶蛋白TIPIN組成的復(fù)制叉保護(hù)復(fù)合物（the fork protection complex，F(xiàn)PC）也能對(duì)抗RS。最近的遺傳學(xué)研究表明，釀酒酵母中TIMELESS/TIPIN的同源基因Tof1/Csm3通過(guò)抑制斷裂誘導(dǎo)的復(fù)制過(guò)程，防止端粒重復(fù)序列的不穩(wěn)定［65］。FPC的缺失往往優(yōu)先影響基因組中那些晚復(fù)制區(qū)域的復(fù)制，相關(guān)實(shí)驗(yàn)觀察到，在ALT細(xì)胞中FPC的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致端粒聚集顯著增加，APBs的形成和端粒-MiDAS，提示端粒在ALT細(xì)胞中的聚集可能源于端粒復(fù)制叉保護(hù)的缺陷，而TIMELESS和TIPIN可能是通過(guò)保護(hù)端粒處的復(fù)制叉來(lái)抑制端粒MiDAS。

4 展 望

盡管人們?cè)絹?lái)越多地關(guān)注到發(fā)生在有絲分裂早期這一狹窄時(shí)間窗口的MiDAS，但關(guān)于端粒-MiDAS還有許多需要進(jìn)一步探明的地方，例如，端粒處不需要MUS81進(jìn)行切割，那么是否由其他組分替代MUS81的功能？當(dāng)癌細(xì)胞中MiDAS發(fā)生所必需的底物被耗盡時(shí)，造成的病理性MiDAS是否會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡？MiDAS是否如人們猜想的能夠被非整倍體驅(qū)動(dòng)？

除此以外，在非整倍體癌細(xì)胞中觀察到了高水平的MiDAS，因此可以針對(duì)MiDAS開(kāi)發(fā)一種靶向癌細(xì)胞的治療手段。目前的研究發(fā)現(xiàn)依賴于MiDAS的癌細(xì)胞對(duì)癌基因激活所造成的RS更加耐受［12］，而ATR激酶抑制劑聯(lián)合MiDAS抑制劑增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力，ATR抑制劑造成癌細(xì)胞中的RS增加到毒性水平，從而降低細(xì)胞活力，而遭受過(guò)度的RS會(huì)導(dǎo)致ATR缺陷的癌細(xì)胞更加依賴MiDAS來(lái)完成DNA復(fù)制［17］。ALT細(xì)胞中顯著的MiDAS水平使人們對(duì)ALT端粒維持機(jī)制產(chǎn)生了更多疑問(wèn)，例如，在G2期甚至是有絲分裂細(xì)胞的APBs處均能夠檢測(cè)到ALT活性，這是否與MiDAS有關(guān)？就目前的研究而言，還有許多未解的難題等待著人們?nèi)ヌ剿鳌?/p>