4 種牧草種子在不同逆境下的萌發(fā)特性

高獻(xiàn)磊，包賽很那，周忠義，張佳慧，王傳旗，龍建廷，王向濤，苗彥軍

（1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院, 西藏 林芝 860000；2. 牙克石市林業(yè)和草原事業(yè)發(fā)展中心, 內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 022150；3. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院, 青海 西寧 810016）

干旱脅迫與鹽脅迫嚴(yán)重影響著牧草種子的萌發(fā)過程[1]。西藏位于青藏高原，平均海 拔4 000 m 以上，山體縱橫，有著“世界屋脊”之稱[2]。西藏是我國重要的生態(tài)安全屏障，也是我國土地沙化嚴(yán)重的地區(qū)之一[3]，面臨西藏高寒、旱和鹽堿化土壤環(huán)境問題，采用補(bǔ)播抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)價(jià)值高且改善土質(zhì)的牧草極具研究價(jià)值[4]。因此，探究具有較強(qiáng)抗旱性、耐鹽性的牧草對(duì)以上問題的解決至關(guān)重要。

沙打旺(Astragalus adsurgens)是豆科黃芪屬多年生草本植物，富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，且具有防風(fēng)固沙、改善土質(zhì)、保持水土等功能，多種植生長于干旱沙區(qū)[5-6]；沙蒿(Artemisia desertorum)是菊科蒿屬植物，其植株富含多種營養(yǎng)成分，由于其根系粗壯，耐沙埋，可防風(fēng)阻沙，多應(yīng)用于干旱沙區(qū)環(huán)境[7]；黃花草木樨(Melilotus officinalis)為豆科草本植物，其植株富含粗脂肪和蛋白質(zhì)，且具有耐寒、耐旱性等特性，可適應(yīng)生長于貧瘠土質(zhì)，增加土壤肥力，為重要的飼草料、水土保持優(yōu)良植物[8]；黃花苜蓿(Medicago falcata)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，由于其營養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、粗纖維等，且根系發(fā)達(dá)、固氮能力強(qiáng)，不僅為高營養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)飼草，還是改善土質(zhì)的理想牧草[9]。

本研究以沙打旺、沙蒿、黃花草木樨和黃花苜蓿4 種牧草種子為供試物種，因4 種牧草普遍適應(yīng)西藏高寒、干旱環(huán)境，故對(duì)4 種供試牧草種子抗逆性規(guī)律進(jìn)行探究，旨在闡明不同牧草種子的抗逆能力，初步探究干旱脅迫與鹽脅迫環(huán)境下牧草種子的萌發(fā)適應(yīng)性能力，以期為西藏獨(dú)特的環(huán)境下引種提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料設(shè)計(jì)

選取4 種供試豆科材料分別為沙打旺、沙蒿、黃花草木樨和黃花苜蓿，其中沙打旺種子與黃花苜蓿種子均由寧夏德隆縣青山綠水生態(tài)草業(yè)專業(yè)合作社提供，沙蒿種子采購于江蘇沭陽禾之綠種業(yè)有限公司，黃花草木樨種子采購于陜西泗水范學(xué)浩苗木場。供試牧草種子均于2020 年10 月份采收。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子處理

2021 年7 月，在西藏農(nóng)牧學(xué)院農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室開始試驗(yàn)。試驗(yàn)采用紙上發(fā)芽法。試驗(yàn)前將沙打旺、沙蒿、黃花草木樨和黃花苜蓿種子分別置于兩張砂紙之間，用砂紙對(duì)種子進(jìn)行適度打磨，破除種子的硬實(shí)。用0.5%的高錳酸鉀溶液浸泡消毒30 min 后取出[10]，使用超純水沖洗干凈并用濾紙吸干種子表面，備用。

1.2.2NaCl 處理

試驗(yàn)配制濃度為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的NaCl 溶液模擬脅迫環(huán)境。鋪雙層濾紙于發(fā)芽盒[19 cm (長) × 13 cm(寬) × 12 cm(高)]中，依次加入2 mL NaCl 溶液，并稱其重量。4 種牧草種子于人工氣候箱(RX2-300D，江蘇常州)中培養(yǎng)，發(fā)芽盒在人工氣候箱的存放方式為順序排列。每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)50 粒種子。種子發(fā)芽采用胚根長度達(dá)到種子一半作為標(biāo)志，萌發(fā)期間定時(shí)觀察并記錄種子發(fā)芽情況，除去發(fā)霉種子。為防止水勢變化，每隔2 d 更換1 次濾紙并加入等量的NaCl 溶液。試驗(yàn)周期14 d。人工氣候箱工作環(huán)境為：25 ℃，濕度40%，12 h 光照/12 h 黑暗。

1.2.3聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG-6000 處理

采用PEG-6000 溶液進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)，每種牧草設(shè)5 個(gè)濃度處理，分別為0、5%、10%、15%和20%，處理間進(jìn)行3 次重復(fù)，各重復(fù)選取50 粒種子觀察，試驗(yàn)周期為14 d。在消毒后的發(fā)芽盒[19cm(長)×13cm(寬)×12cm(高)]中放入雙層大小與發(fā)芽盒內(nèi)大小一致的濾紙，依次有序加入5 個(gè)不同濃度(0、5%、10%、15%、20%) PEG 溶液2 mL，浸濕濾紙并稱其重量。消毒后挑選籽粒大小適中、均勻一致且無病蟲害的供試種子50 粒，等間距擺放于發(fā)芽盒內(nèi)濾紙上。將發(fā)芽盒放入人工氣候箱(RX2-300D，江蘇常州)中培養(yǎng)萌發(fā)，發(fā)芽盒在人工氣候箱的存放方式為順序排列。定時(shí)觀察并記錄種子萌發(fā)，每隔2 d 更換1 次濾紙，并用電子天平稱量發(fā)芽盒的重量，控制水勢變動(dòng)。人工氣候箱工作環(huán)境為：25 ℃，濕度40%，12 h 光照/12 h 黑暗。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.4 牧草抗逆性評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)法綜合分析4 種牧草種子抗逆性。如果某一指標(biāo)與抗性指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系，則F= (Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)；如果某一指標(biāo)與抗性指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，則F= 1-(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)。式中：Xj為4 種牧草某一指標(biāo)中標(biāo)準(zhǔn)測定值的平均值，Xmax、Xmin為該指標(biāo)最大值和最小值，并將所求得隸屬函數(shù)值累加求其平均值，即為該指標(biāo)的隸屬函數(shù)度。隸屬度越大，抗逆性越強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)所測數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測定結(jié)果，分別對(duì)同一供試物種不同脅迫濃度處理、同一脅迫濃度處理不同供試物種進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對(duì)各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Oingin 2018 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫對(duì)種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

隨NaCl 濃度升高，4 種牧草種子的相對(duì)發(fā)芽率均表現(xiàn)為先升高后下降(圖1)。在0.6% NaCl 下黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽率最高，為74.34%，黃花草木樨的為44.34%，與沙打旺差異不顯著(P＞ 0.05)；在0.8%NaCl 下，黃花草木樨的相對(duì)發(fā)芽率為10.27%，顯著低于其他供試物種(P＜ 0.05)。與0 濃度組相比，0.2% NaCl 下，供試物種相對(duì)發(fā)芽率與0 濃度組差異性不顯著(P＞ 0.05)，0.4%～0.8% NaCl 下，供試物種相對(duì)發(fā)芽率均顯著低于0 濃度組(P＜ 0.05)。

圖1 不同濃度NaCl 脅迫下供試物種的相對(duì)發(fā)芽率Figure 1 Relative germination rate of tested species under stress at different NaCl concentrations

2.2 NaCl 脅迫對(duì)種子相對(duì)發(fā)芽勢的影響

隨NaCl 濃度升高下，供試物種的相對(duì)發(fā)芽勢均表現(xiàn)為先升高后下降(圖2)。在0.4% NaCl 下，沙打旺相對(duì)發(fā)芽勢與黃花草木樨和黃花苜蓿差異不顯著(P＞ 0.05)，沙蒿、黃花草木樨和黃花苜蓿之間差異不顯著；在0.6% NaCl 處理下，沙蒿和黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽勢顯著高于黃花草木樨(P＜ 0.05)；0.8%NaCl 處理下，黃花草木樨相對(duì)發(fā)芽勢顯著低于其他供試物種，此時(shí)黃花草木樨的相對(duì)發(fā)芽勢為10.27%。與0 濃度組相比，0.2% NaCl 下，沙蒿和沙打旺與0 濃度組差異顯著，0.6%和0.8% NaCl 下，供試物種相對(duì)發(fā)芽勢均顯著低于0 濃度組。

圖2 不同濃度NaCl 脅迫下供試物種的相對(duì)發(fā)芽勢Figure 2 Relative germination potential of tested species under stress at different concentrations of NaCl

2.3 NaCl 脅迫對(duì)種子相對(duì)發(fā)芽指數(shù)的影響

隨著NaCl 濃度的升高，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)降低，其他供試物種均表現(xiàn)為先升高后降低(圖3)。在0.2% NaCl 處理下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他供試物種(P＜ 0.05)；在0.4%和0.6% NaCl下，沙蒿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他供試物種(P＜0.05)；在0.8% NaCl 下，沙蒿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)最高，為31.99%，黃花草木樨相對(duì)發(fā)芽指數(shù)最低，為8.11%。與0 濃度組相比，在0.4% NaCl 下，沙蒿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)與0 濃度組差異不顯著(P＞ 0.05)，其他供試物種相對(duì)發(fā)芽指數(shù)均顯著低于0 濃度組(P＜ 0.05)。

圖3 不同濃度NaCl 脅迫下供試物種的相對(duì)發(fā)芽指數(shù)Figure 3 Relative germination index of tested species under stress at different concentrations of NaCl

2.4 NaCl 脅迫對(duì)種子相對(duì)活力指數(shù)的影響

隨著NaCl 濃度的升高，黃花苜蓿相對(duì)活力指數(shù)降低，其他供試物種均表現(xiàn)為先升高后降低(圖4)。在0.2% NaCl 下，黃花苜蓿相對(duì)活力指數(shù)顯著低于其他供試物種(P＜ 0.05)。在0.4% NaCl 處理下，沙蒿相對(duì)活力指數(shù)顯著高于其他供試物種；在0.6%NaCl 濃度處理下沙蒿和黃花苜蓿的相對(duì)活力指數(shù)顯著高于沙打旺和黃花草木樨。在0.8% NaCl 濃度處理下，沙蒿相對(duì)活力指數(shù)顯著高于沙打旺和黃花草木樨，此時(shí)供試物種相對(duì)活力指數(shù)均下降至10%以下，其中沙蒿相對(duì)活力指數(shù)最高，為9.19%，黃花草木樨最低，為1.90%。與0 濃度組相比，在0.2% NaCl 下，沙蒿和沙打旺顯著高于0 濃度組，黃花苜蓿顯著低于0 濃度組；在0.4%～0.8% NaCl 下，供試物種相對(duì)活力指數(shù)顯著低于0 濃度組。

圖4 不同濃度NaCl 脅迫下供試物種的相對(duì)活力指數(shù)Figure 4 Relative activity index of tested species under stress at different concentrations of NaCl

2.5 PEG 脅迫對(duì)種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

隨著PEG 濃度的升高，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽率下降，其他供試物種先升高后降低(圖5)。在5% PEG濃度下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽率與沙打旺、黃花草木樨差異不顯著(P＞ 0.05)；在10% PEG 濃度下，黃花草木樨相對(duì)發(fā)芽率最高，與沙蒿、沙打旺差異不顯著；在15% PEG 濃度下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽率顯著低于其他供試物種(P＜ 0.05)，其中沙蒿相對(duì)發(fā)芽率為最高；在20% PEG 處理下，沙打旺相對(duì)發(fā)芽率為19.70%，顯著高于其他供試物種，此時(shí)黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽率為0。與0 濃度組相比，在5% PEG 下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽率顯著低于0 濃度組，其他供試物種與0 濃度組差異不顯著；在10% PEG 下，沙蒿、黃花草木樨相對(duì)發(fā)芽率與0 濃度組差異不顯著；在15%和20% PEG 下，供試物種的相對(duì)發(fā)芽率均顯著低于0 濃度組。

圖5 不同濃度PEG 脅迫下供試物種的相對(duì)發(fā)芽率Figure 5 Relative germination rate of tested species under stress at different concentrations of PEG

2.6 PEG 脅迫對(duì)種子相對(duì)發(fā)芽勢的影響

隨著PEG 濃度的升高，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽勢下降，其他供試物種相對(duì)發(fā)芽勢先上升后下降(圖6)。在5%～15% PEG 下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽勢顯著低于其他3 種物種(P＜ 0.05)；在20% PEG 下，沙打旺相對(duì)發(fā)芽勢顯著高于其他供試物種，為15.30%，此時(shí)黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽勢為0。與0 濃度組相比，在5% PEG 下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽勢顯著低于0 濃度組，其他供試物種差異不顯著(P＞ 0.05)；在10%PEG 下，黃花草木樨相對(duì)發(fā)芽勢與0 濃度組差異不顯著，其他供試物種顯著低于0 濃度組；在15%和20% PEG 下，供試物種相對(duì)發(fā)芽勢均顯著低于0 濃度組。

圖6 不同濃度PEG 脅迫下供試物種的相對(duì)發(fā)芽勢Figure 6 Relative germination potential of tested species under stress at different concentrations of PEG

2.7 PEG 脅迫對(duì)種子相對(duì)發(fā)芽指數(shù)的影響

隨著PEG 濃度的升高，沙打旺和黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)下降，其他供試物種相對(duì)發(fā)芽指數(shù)先上升后下降(圖7)。在5%～15% PEG 下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他供試物種(P＜ 0.05)；在20%PEG 下，沙打旺相對(duì)發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他供試物種，為9.26%，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽指數(shù)最低，為0.33%。與0 濃度組相比，在5% PEG 下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽勢顯著低于0 濃度組，其他供試物種相對(duì)發(fā)芽指數(shù)與0 濃度組差異不顯著(P＞ 0.05)；在15%和20%PEG 下，供試物種相對(duì)發(fā)芽勢均顯著低于0 濃度組。

圖7 不同濃度PEG 脅迫下供試物種的相對(duì)發(fā)芽指數(shù)Figure 7 Relative germination index of tested species under stress at different concentrations of PEG

2.8 PEG 脅迫對(duì)種子相對(duì)活力指數(shù)的影響

隨著PEG 濃度的升高，沙蒿相對(duì)活力指數(shù)先上升后下降，其他供試物種相對(duì)活力指數(shù)均下降(圖8)。在5% PEG 下，黃花苜蓿相對(duì)活力指數(shù)顯著低于沙蒿和沙打旺(P＜ 0.05)；在20% PEG 下，沙打旺相對(duì)活力指數(shù)顯著高于其他供試物種，為4.99%，黃花苜蓿相對(duì)活力指數(shù)最低。與0 濃度組相比，在5% PEG下，黃花苜蓿相對(duì)發(fā)芽勢顯著低于0 濃度組；在10%～20% PEG 下，供試物種相對(duì)發(fā)芽勢均顯著低于0 濃度組。

圖8 不同濃度PEG 脅迫下供試物種的相對(duì)活力指數(shù)Figure 8 Relative activity index of tested species under stress at different concentrations of PEG

2.9 4 種牧草隸屬函數(shù)綜合分析

2.9.14 種牧草耐鹽性綜合分析

運(yùn)用隸屬函數(shù)對(duì)供試物種的發(fā)芽指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(表1)。根據(jù)隸屬函數(shù)的平均值進(jìn)行排序，得出供試物種的耐鹽性強(qiáng)弱依次表現(xiàn)為黃花苜蓿 ＞ 沙蒿 ＞ 黃花草木樨 ＞ 沙打旺。

表1 耐鹽指標(biāo)隸屬函數(shù)值及耐鹽性綜合評(píng)價(jià)Table 1 Membership function value of salt tolerance index and comprehensive evaluation of salt tolerance

2.9.24 種牧草抗旱性綜合分析

利用隸屬函數(shù)對(duì)供試物種的發(fā)芽指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(表2)。從隸屬函數(shù)的平均值排序中，得出供試物種的抗旱性強(qiáng)弱依次表現(xiàn)為黃花苜蓿 ＞ 黃花草木樨 ＞ 沙蒿 ＞ 沙打旺。

表2 耐旱指標(biāo)隸屬函數(shù)值及耐旱性綜合評(píng)價(jià)Table 2 Membership function value of drought tolerance index and comprehensive evaluation of drought tolerance

3 討論

3.1 NaCl 鹽脅迫對(duì)供試物種耐鹽性的影響

在NaCl 鹽脅迫作用下，一定范圍內(nèi)隨著NaCl濃度的增加，牧草種子萌發(fā)會(huì)受到抑制[12]。在牧草種子萌發(fā)過程中，NaCl 鹽脅迫主要包括離子的毒害作用和膜滲透作用[13]，Munns[14]研究表明，離子在細(xì)胞質(zhì)中迅速積聚并抑制酶活性，最后引起離子毒害發(fā)生。一方面，低濃度的鹽溶液中離子可滲入種子細(xì)胞內(nèi)，降低種子的滲透勢，促進(jìn)種子吸水發(fā)芽[15-17]；另一方面，NaCl 鹽溶液中的離子在種子內(nèi)部不斷積累并形成離子毒害，降低溶液滲透勢使種子吸收水分受到阻礙，抑制種子萌發(fā)。供試物種在不同的指標(biāo)下耐鹽性不同，本研究中供試物種發(fā)芽期隨NaCl 濃度的升高，發(fā)芽指標(biāo)均呈下降趨勢，說明鹽脅迫對(duì)供試物種的發(fā)芽起到了較大的抑制作用，這與鹽脅迫導(dǎo)致種子受到離子毒害，降低溶液滲透阻礙種子吸水萌發(fā)有密切關(guān)系。由于牧草種子萌發(fā)受多因素共同作用，難以用單一指標(biāo)準(zhǔn)確反映其耐鹽性強(qiáng)弱，因此運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[18]。4 種牧草種子的耐鹽性比較結(jié)果為黃花苜蓿的耐鹽性最強(qiáng)，其次是沙蒿和黃花草木樨，而沙打旺的耐鹽性最差?；鹦裉玫萚19]研究表明，草木樨的耐鹽性強(qiáng)于沙打旺；秦峰梅等[20]研究認(rèn)為黃花苜蓿耐鹽性要強(qiáng)于紫花苜蓿(Medicago sativa) ‘CW400’和紫花苜?！まr(nóng)2 號(hào)’，張?zhí)K江等[21]研究也發(fā)現(xiàn)了苜蓿的耐鹽性強(qiáng)于草木樨。

3.2 PEG 干旱脅迫對(duì)供試物種抗旱性的影響

聚乙二醇(PEG-6000)是一種具有很強(qiáng)親水性的非離子型高分子滲透劑，由于本身受細(xì)胞壁阻礙不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，溶于水后溶液中的滲透勢低于種子，引起種子失水不能正常萌發(fā)，因此PEG 常被應(yīng)用在干旱脅迫研究中[22-23]。相關(guān)研究表明，低濃度PEG 濃度能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，伴隨著干旱脅迫程度增加，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢等均呈現(xiàn)下降趨勢[24-25]；Zeid 和Shedeed[26]研究表明，苜蓿種子在經(jīng)過PEG處理后胚根的生長速度要高于對(duì)照組。孫清洋等[27]研究表明，隨著干旱脅迫程度的增加，老芒麥(Elymus sibiricus)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢等發(fā)芽指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢。本研究中供試物種隨著PEG 濃度增加，相對(duì)發(fā)芽率等相關(guān)指標(biāo)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，與上述觀點(diǎn)相似，運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析[18]，4 種牧草種子的抗旱性比較結(jié)果為黃花苜蓿的抗旱性最強(qiáng)，其次是黃花草木樨和沙蒿，而沙打旺的抗旱性最差。劉貴河等[28]研究表明，紫花苜蓿的抗旱性要強(qiáng)于草木樨；王亞楠等[29]研究也發(fā)現(xiàn)草木樨抗旱性強(qiáng)于沙蒿和沙打旺。

4 結(jié)論

供試物種的相對(duì)發(fā)芽指數(shù)等相關(guān)指標(biāo)在低濃度下有促進(jìn)萌發(fā)作用。0.2% NaCl 下4 種牧草種子相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢指標(biāo)均達(dá)到最大值，在0.4%～0.8% NaCl 下4 種牧草種子萌發(fā)受到顯著抑制(P＜0.05)；5% PEG 下黃花草木樨、沙蒿和沙打旺發(fā)芽率均有上升，在10%～20% PEG 下供試物種發(fā)芽率均下降。4 種牧草種子萌發(fā)期耐鹽性表現(xiàn)為黃花苜蓿 ＞沙蒿 ＞ 黃花草木樨 ＞ 沙打旺，黃花苜蓿和沙蒿種子萌發(fā)期耐鹽性較強(qiáng)；4 種牧草種子萌發(fā)期抗旱性表現(xiàn)為黃花苜蓿 ＞ 黃花草木樨 ＞ 沙蒿 ＞ 沙打旺，黃花苜蓿和黃花草木樨種子萌發(fā)期抗旱性較強(qiáng)。因生產(chǎn)實(shí)踐中干旱荒漠區(qū)多種植沙打旺和沙蒿，故種子萌發(fā)時(shí)期抗旱性結(jié)果并不足以證明供試物種苗期抗旱性指標(biāo)，仍需對(duì)供試物種苗期進(jìn)一步探究。