高、低剩余采食量灘羊瘤胃微生物的差異

和東遷，陶金忠

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 寧夏 銀川 750021）

飼料成本占養(yǎng)殖總成本的65%～70%，增加養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，提高飼料效率是關(guān)鍵。剩余采食量(residual feed intake, RFI)為基于動(dòng)物體況和生產(chǎn)性能的實(shí)際飼料攝入量和其預(yù)期飼料攝入量之間的差異[1]，被廣泛應(yīng)用于評(píng)估各種家畜動(dòng)物飼料效率，RFI 較低的個(gè)體飼料效率更高。然而RFI 表型受許多因素影響，如日糧、喂養(yǎng)方式(如喂養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間和次數(shù))、瘤胃發(fā)酵、體況狀況(脂肪和蛋白質(zhì))、代謝過程、運(yùn)動(dòng)和飼喂時(shí)所產(chǎn)生的熱增耗[2]。目前鮮有研究報(bào)道性別與飼料效率間的差異關(guān)系，僅Ahmed 等[3]發(fā)現(xiàn)性別影響不同RFI 肉牛瘤胃上皮基因差異表達(dá)，對(duì)生長(zhǎng)性能和瘤胃細(xì)菌沒有顯著影響。

瘤胃是瘤胃微生物的主要發(fā)酵場(chǎng)所，短鏈脂肪酸是瘤胃發(fā)酵的最終產(chǎn)物，是反芻動(dòng)物能量的主要供應(yīng)來源。因此，瘤胃功能與飼料效率密切相關(guān)。瘤胃發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生一些不必要的能量損失。甲烷是造成溫室效應(yīng)的主要?dú)怏w之一，反芻動(dòng)物瘤胃產(chǎn)生的CH4約7.7 × 107t，絕大部分CH4氣體來源于反芻動(dòng)物。據(jù)報(bào)道，反芻動(dòng)物胃腸道CH4消耗占總能量攝入的5%～10%[4]。肉牛甲烷的日產(chǎn)率與RFI 正相關(guān)，低RFI 個(gè)體甲烷排放量少。因此，低RFI 動(dòng)物個(gè)體的選育不僅可以降低動(dòng)物的養(yǎng)殖成本，還可以減小養(yǎng)殖對(duì)環(huán)境的污染。Guan 等[5]報(bào)道了瘤胃微生物群及其發(fā)酵參數(shù)與牛的飼料效率之間的潛在聯(lián)系，低RFI 較高RFI 個(gè)體擁有特異性菌群。Deborah 等[6]通過16S rRNA 測(cè)序技術(shù)評(píng)價(jià)內(nèi)洛爾肉牛瘤胃微生物群與飼料效率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，低RFI 和高RFI 牛的細(xì)菌組成差異主要與Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Christensenellaceae 以及Prevotella的成員有關(guān)。對(duì)不同RFI 綿羊的16s RNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，低RFI 綿羊表現(xiàn)出更豐富和更多樣化的微生物菌群[7]。瘤胃微生物代謝網(wǎng)絡(luò)異常也與飼料效率密切相關(guān)[8]。對(duì)不同RFI 肉牛瘤胃微生物18s rRNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，原蟲群落的未分配類群和系統(tǒng)發(fā)育多樣性的差異可能是造成肉牛飼料效率表型差異的原因[9]。Liang 等[10]發(fā)現(xiàn)，低RFI 動(dòng)物擁有更低的pH，并且低RFI 瘤胃環(huán)境比高RFI 更穩(wěn)定，有利于飼料發(fā)酵。目前研究表明瘤胃菌群與飼料效率密切相關(guān)。因此，本研究選擇大群體公母灘羊，對(duì)其進(jìn)行不限定運(yùn)動(dòng)飼養(yǎng)，探究不同RFI 公母灘羊瘤胃微生物差異，確定影響飼料效率的關(guān)鍵微生物，為灘羊選育實(shí)踐提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)羊飼喂與管理

試驗(yàn)在寧夏鹽池灘羊育種選育場(chǎng)進(jìn)行。分別選擇6 月齡健康和具有良好系譜的灘羊公羊163 只，母羊182 只。試驗(yàn)采用單欄頸夾飼喂，在采食期間采用頸夾固定羔羊，采食完成后松開頸夾，讓其自由運(yùn)動(dòng)[11]。試驗(yàn)飼糧配方和加工飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參考肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[12]，試驗(yàn)飼糧按配方加工為顆粒飼料。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平與陳麗堯等[13]所報(bào)道一致(表1)。試驗(yàn)過渡期15 d，正試期50 d，試驗(yàn)期間飼喂同一種飼料。在試驗(yàn)開始前記錄綿羊初始體重，并且每10 d 稱重一次至試驗(yàn)結(jié)束。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets

1.2 RFI 表型計(jì)算

RFI 通過回歸模型計(jì)算，所用模型[13]如下：

式中：Yi為第i只動(dòng)物的DMI(干物質(zhì)采食量)；β0為回歸截距；β1為Mid-BW0.75對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)；β2為ADG(日增重)對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)；ei為第i只動(dòng)物的隨機(jī)誤差，Mid-BWi0.75為第i只動(dòng)物的中期代謝體重，ADGi為第i只動(dòng)物的平均日增重。

公、母灘羊的回歸方程依次為：

DMI預(yù)測(cè)= - 0.244 + 1.669Mid-BW0.75+ 0.079ADG。

DMI預(yù)測(cè)= 0.103 + 2.126 ×Mid-BW0.75+ 0.051ADG。

RFI=RFI實(shí)際-RFI預(yù)測(cè)。

當(dāng)個(gè)體RFI≥RFI平均值+0.5 時(shí)，劃分為高RFI組；當(dāng)個(gè)體RFI≤RFI平均值-0.5 時(shí)，劃分為低RFI 組。

1.3 瘤胃液采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后選取極高RFI 母羊和公羊各7 只，極低RFI 母羊和公羊各8 只。在第66 天晨飼前采用綿羊瘤胃導(dǎo)管體外抽取瘤胃液，并將瘤胃液分管裝入50 mL 凍存管，置于-20 ℃條件下保存，用于瘤胃微生物DNA 的提取。

1.4 瘤胃液DNA 提取

采用CTAB 法[9]提取樣本基因組DNA，然后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。

1.5 16S rDNA V4 區(qū)PCR 擴(kuò)增子測(cè)序

根據(jù)測(cè)序區(qū)域選擇，使用帶Barcode 的特異引物。16S V4 區(qū)域引物為515F-806R，上游引物F：CCTAYGGGRBGCASCAG/下游引物R：GGACTACN NGGGTATCTAAT。使用New England Biolabs 公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。對(duì)高效和高保真的酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用1 × TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，選擇主帶400～450 bp 的序列，割膠回收目標(biāo)條帶。使用Illumina 公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測(cè)，合格后，使用NovaSeq 6000 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.6 信息分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

剔除DNA 降解或不合格樣本后，獲得極高組RFI 母羊6 只和公羊5 只、極低組RFI 母羊6 只和公羊7 只的原始數(shù)據(jù)。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過濾，得到有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進(jìn)行OTUs (operational taxonomic units)聚類和物種分類分析，根據(jù)OTUs 聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTUs 的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時(shí)，對(duì)OTUs 進(jìn)行豐度、Alpha 多樣性計(jì)算、Venn 圖，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs 信息。對(duì)OTUs 進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，進(jìn)一步得到不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異，通過主坐標(biāo)分析(PCoA)和樣品聚類樹進(jìn)行展示。為進(jìn)一步挖掘分組樣品間的落結(jié)構(gòu)差異，選用T-test 和LEfSe 統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢。

利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。對(duì)OTUs 序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur 方法與SILVA138 (http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)。使用MUSCLE (Version 3.8.31， http://www.drive5.com/muscle/)軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。使用Qiime 軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Observed-OTUs，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree 指數(shù)，使用R 軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線、rank abundance 曲線、物種累積曲線，并使用R 軟件進(jìn)行α 多樣性指數(shù)組間差異分析；α 多樣性指數(shù)組間差異分析進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，選用agricolae包的wilcox 檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 Excel 2010 進(jìn)行整理，應(yīng)用SPSS 17.0 進(jìn)行獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，P＜ 0.05 時(shí)認(rèn)為差異顯著，結(jié)果均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤(means ± SEM)形式列出。PCoA基于unweighted unifrac 距離來分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌群測(cè)序量及序列長(zhǎng)度分布

對(duì)瘤胃液樣本的腸道菌群DNA 片段進(jìn)行雙端測(cè)序，篩選過濾后共產(chǎn)生2 063 628 條原始讀段，平均每個(gè)樣本85 970 條原始讀段。經(jīng)質(zhì)控篩選過濾后共產(chǎn)生2 028 835 條有效讀段，平均每個(gè)樣本84 535 條有效讀段。其中Q20 和Q30 (堿基質(zhì)量值≥20 或30所占的比例)平均值分別為98%和94% (附表1)。

2.2 OUT 聚類分析

OTUs 是人為設(shè)置的微生物分類單元，按照序列相似度≥97%歸為同一個(gè)OTU，即同一微生物物種的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類，經(jīng)測(cè)序后，基于97%物種相似性，將24 組瘤胃液樣品中獲得的序列進(jìn)行OTU 聚類，對(duì)樣品進(jìn)行OTU 的統(tǒng)計(jì)，剔除稀有OTU 后，Venn 圖顯示(圖1)，極低組公羊發(fā)現(xiàn)1 812 個(gè)OTUs，極高組公羊發(fā)現(xiàn)1 610 個(gè)OTUs，極低組母羊發(fā)現(xiàn)1 677 個(gè)OTUs，極高組母羊發(fā)現(xiàn)1 698 個(gè)OTUs。極高組公羊和極低組公羊兩組共有1 274 個(gè)OTUs。極高組母羊和極低組母羊共有1 327 個(gè)OTUs，極高組公羊和母羊共有1 303 個(gè)OTUs，極低組公羊和母羊共有1 377 個(gè)OTUs。

圖1 不同RFI 組OTUsVenn 圖Figure 1 OTUs Venn diagram of different RFI groups

2.3 微生物群落Alpha 多樣性分析

所有組觀測(cè)到的物種數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)和基因文庫覆蓋率均無顯著差異(P＞ 0.1)，EHM 與ELM 的PD_whole_tree 差異顯著(P＜ 0.1) (表2)。但是極高組公羊的PD_whole_tree 明顯高于其他組別。表明極高低組RFI 公羊和極高低組母羊之間菌群多樣性差異較小，菌群趨于一致性。

表2 不同剩余采食量對(duì)灘羊瘤胃微生物多樣性影響Table 2 Different residual feed intake on rumen microbial diversity of Tan sheep

2.4 微生物群落多樣性曲線

當(dāng)測(cè)序量達(dá)到3 500 時(shí)，不同RFI 組物種曲線趨向平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸合理。等級(jí)聚類曲線可直觀地反映樣本中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上，物種的豐富度逐漸變寬，物種的豐富度升高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向上，曲線逐漸變平緩，物種分布均勻性良好(圖2)。

圖2 不同RFI 瘤胃微生物群落多樣性曲線Figure 2 Rumen microbial community diversity curve of Tan sheep with different residual feed intake

2.5 微生物群落β 多樣性分析

β 多樣性組間差異分析的箱型圖(圖3)表明，公羊極高組與極低組之間存在極顯著差異(P＜ 0.01)，母羊極高組與極低組之間差異不顯著(P＞ 0.05)。極低組公羊和母羊之間差異極顯著(P＜ 0.01)，極高組公羊和母羊之間差異不顯著(P＞ 0.05)。

圖3 不同 RFI 公母羊組間微生物群落β 多樣性指數(shù)Figure 3 Box diagram of microbial community β diversity index between male and female sheep groups with different RFI

2.6 主坐標(biāo)分析

灘羊不同RFI 組間樣本具有部分重疊，但沒有明顯的分離，表明樣本組間和組內(nèi)微生物群落差異性較小(圖4)。

2.7 UPGMA 聚類

極高RFI 組公羊4 個(gè)樣本聚集在一起，聚類效果較好，其他RFI 組樣本聚類效果不明顯(圖4)。從整體結(jié)構(gòu)來看，不同RFI 組微生物結(jié)構(gòu)相似。

圖4 不同RFI 組微生物群落PCoA 得分圖Figure 4 PCoA score of microbial communities in different RFI Tan sheep groups

2.8 灘羊瘤胃微生物組成

灘羊瘤胃微生物在門和屬水平上公母羊優(yōu)勢(shì)菌屬不同，但是整體結(jié)構(gòu)相似。在門水平上，公羊優(yōu)勢(shì)菌門是擬桿菌門和厚壁菌門，母羊優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門和擬桿菌門 (表3)。在屬水平上，公羊優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、韋榮球菌UCG-002(Erysipelotrichaceae_UCG_002)， 母 羊 優(yōu) 勢(shì) 菌 屬 是Olsenella和普雷沃氏菌屬(表4)。

在門水平上(表3)，擬桿菌門公羊極高組與極低組之間差異顯著(P＜ 0.05)，極高組公羊顯著高于母羊。放線菌門公羊極低組明顯高于極高組，極高組母羊明顯高于公羊。廣古菌門公羊極高組顯著低于極低組(P＜ 0.05)。變形菌門極高組公羊顯著高于其他組(P＜ 0.05)。在屬水平上(表4)，Olsenella菌屬極高組母羊明顯高于公羊，極低組公羊明顯高于母羊。韋榮球菌科UCG-002 極高組公羊顯著高于其他組別(P＜ 0.05)。甲烷短桿菌極高組公羊與極低組公羊明顯高于其他組別。

表3 微生物相對(duì)豐度在門分類水平上排名前十的物種Table 3 Top 10 species at phylum taxonomic level in relative abundance of microorganisms

表4 微生物相對(duì)豐度在屬分類水平上排名前十的物種Table 4 Top ten species at genus taxonomic level in relative abundance of microorganisms

2.9 差異微生物的LEfSe 及功能富集分析

LEfSe 可以在各個(gè)水平上比較微生物豐度差異，以線性判別分析(LDA) 得分 ＞ 4 為符合生物標(biāo)記物的菌落。極高組公羊與極低組公羊比較發(fā)現(xiàn)梭菌綱、古菌域、廣古菌門、甲烷桿菌科、甲烷桿菌綱、甲烷桿菌目和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)在極低組公羊中高表達(dá)，Prevotella_DJF_cp65、Bacteria、普雷沃氏菌科、韋榮球菌科UCG-002 和韋榮球菌科SG0102 在極高組公羊中高表達(dá)(圖5)。極高組母羊和極高組公羊比較發(fā)現(xiàn)， Bacteroidia、Bacteroidales、B a c t e r o i d o t a、 P r e v o t e l l a c e a e、 P r e v o t e l l a、Succinivibrionaceae_UGG_001、 Aeromonadales、Succinivibrionaceae 在極高組公羊中高表達(dá)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、雙歧桿菌目、雙歧桿菌科、放線菌綱、Olsenella.umbonata、Olsenella、Atopobiaceae、Coriobacteriales、Coriobacteriia和Actinobacteriota在極高組母羊中高表達(dá)(圖5)。比較發(fā)現(xiàn)，月形單胞菌屬 (Selenomonas)在極低組公羊中高表達(dá)，梭狀芽胞 桿 菌UGG.014 (Clostridia_UGG_014)、Olsenella_umbonata在極低組母羊中高表達(dá)(圖6)。

圖5 不同RFI 組微生物群落UPGMA 圖Figure 5 UPGMA of microbial communities in different RFI Tan sheep groups

圖6 不同RFI 組灘羊LEfSe 功能富集分析Figure 6 LEfSe function enrichment analysis of Tidal sheep in different RFI groups

3 討論

本研究選擇較大的灘羊群體，具有較高的生物學(xué)重復(fù)性，并且選擇公母羊兩類群體作為研究對(duì)象，探究性別差異差異對(duì)瘤胃微生物的影響。Zhang等[14]在湖羊飼料效率的研究中采用單欄飼喂的方式，而這無疑忽略了動(dòng)物運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體造成的影響。研究發(fā)現(xiàn)，肉牛身體活動(dòng)量與RFI 表型相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.32，其中10%的RFI 變異由身體活動(dòng)所導(dǎo)致，這些活動(dòng)包括采食、反芻以及物理性運(yùn)動(dòng)[15]。在動(dòng)物不同生長(zhǎng)階段，性別對(duì)生物發(fā)育速度具有較大的影響，動(dòng)物生長(zhǎng)初期雌性動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育速度較快，而在生物生長(zhǎng)發(fā)育后期，雄性動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育速度則較快[16-17]，因此動(dòng)物性別也可能會(huì)對(duì)飼料效率有影響。

3.1 性別差異對(duì)微生物菌群的影響

近年來發(fā)現(xiàn)性別是影響機(jī)體代謝的重要因素。Verschuren 等[18]報(bào)道了性別是影響不同飼料效率豬腸道微生物的重要影響因素。Ahmed 等[3]報(bào)道了安格斯牛性別差異對(duì)飼料效率的影響，研究發(fā)現(xiàn)性別對(duì)不同RFI 動(dòng)物生長(zhǎng)性能和瘤胃微生物無顯著影響，但對(duì)瘤胃上皮基因表達(dá)差異顯著。在本研究中，極低組母羊和公羊PD_whole_tree 差異明顯，而其他公母灘羊性別對(duì)不同RFI 瘤胃微生物菌群α 多樣性無顯著影響。通過不同性別RFI 灘羊PCoA 和NMDS 圖分析發(fā)現(xiàn)，各組別差異較小，β 多樣性差異不顯著。α 和β 多樣性指數(shù)是反映樣本微生物豐富度和均勻度的兩個(gè)重要指標(biāo)。這表明性別對(duì)微生物生長(zhǎng)影響較小。從微生物組成來看，在門水平上，不同性別組別間優(yōu)勢(shì)菌群種類一致，極高組公母羊擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)差異顯著。在屬水平上，公母羊間第1 優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生變化，Olsenella菌屬為母羊第1 菌屬，普雷沃氏菌屬(Prevotella)為公羊第1 優(yōu)勢(shì)菌屬。極高組公母羊Olsenella、普雷沃氏菌屬和韋榮球菌屬UGG-002 (Erysipelotrichaceae_UCG_002)差異顯著。極低組公母羊月單胞菌屬(selenomonas)差異顯著。韓學(xué)平等[19]研究了不同性別間牦牛瘤胃微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)公母牦牛間微生物組成在種屬間組成一致，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，不同RFI 母灘羊在屬水平下優(yōu)勢(shì)種屬發(fā)生了變化。因此Olsenella菌屬可能與母羊RFI 有關(guān)，不同RFI 公母羊具有不同的優(yōu)勢(shì)，可能影響瘤胃微生物的不同發(fā)酵方式。

3.2 不同RFI 微生物菌群差異

瘤胃是反芻動(dòng)物的主要消化器官，棲居大量的微生物，并具有復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌群的變化直接影響動(dòng)物瘤胃發(fā)酵和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而導(dǎo)致不同飼料效率的差異[20-21]。為此，對(duì)不同RFI 灘羊瘤胃微生物進(jìn)行了研究。本研究選擇16S V3-V4，341F-806R 區(qū)域，分析瘤胃內(nèi)微生物多樣性。

本研究中，序列有效讀取率為98%，數(shù)據(jù)具有較高的完整性。其中極低RFI 公羊具有較高的OTUs 數(shù)目，公羊極高組(1 812)極低組(1 610) OTUs數(shù)目相差較大，極低組高于極高組，而母羊極高極低組OTUs 數(shù)目差異不顯著，極高組高于極低組。馬萬浩等[22]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，不同RFI 湖羊公羊中OTUs數(shù)目高RFI 組(394)高于低RFI 組(353)。造成這種差異的因素有很多，例如精粗比，隨著精料上升，菌群數(shù)量下降，也可能是動(dòng)物品種和飼喂環(huán)境的原因。α 和 β 多樣性指數(shù)是研究微生物多樣性的兩個(gè)重要參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，α 多樣性中物種數(shù)、Chao1、ACE 值、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和覆蓋率等參數(shù)在4 個(gè)群體間沒有差異，其中只有PD_whole_tree在極高和極低RFI 公羊中差異顯著，通過柱狀圖、PCoA 圖和UPGMA 等沒有聚類和分離。這與馬萬浩等[22]研究結(jié)果一致，同樣與Myer 等[23]通過肉牛平均日采食量和動(dòng)物體重來評(píng)估飼料效率研究結(jié)果一致，所有樣本和類群發(fā)現(xiàn)觀察到的OTUs、豐富度(Chao1)或多樣性沒有差異。這表明每個(gè)類群內(nèi)微生物群落之間的相似性。

在門分類學(xué)水平上，4 個(gè)組別具有相同的優(yōu)勢(shì)菌門，分別是擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門差異顯著，這與眾多研究結(jié)果一致[24-26]，其優(yōu)勢(shì)菌門差異的變化主要發(fā)生在厚壁菌 門 (Ruminococcus、Lachnospira、Lachnospira_NK3A20、Erysipelotrichaceae_UCG-002、Quinella、Selenomonas菌屬中)，Myer 等[23]恰好證明厚壁菌門的增加與ADFI 較高的動(dòng)物有關(guān)，這可能與飼料效率有關(guān)。Erysipelotrichaceae_UCG-002 和Selenomonas主要參與發(fā)酵代謝類型，參與丙酮酸、乳酸發(fā)酵和葡萄糖發(fā)酵主要產(chǎn)生乙酸和丙酸，為機(jī)體供能。在本研究結(jié)果中極高和極低母羊組中具有較高的放線 菌 門 中 的 菌 屬 (Olsenella、Bifidobacterium)，Bifidobacterium可以對(duì)葡萄糖進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵，生成L ( + )乳酸和乙酸(摩爾比為3 ∶ 2)，不產(chǎn)CO2，經(jīng)常作為益生菌的調(diào)節(jié)劑[27]。Perea 等[28]的研究表明，不同RFI 的閹羊在瘤胃內(nèi)纖維桿菌、瘤胃球菌、糖酵母菌、雙歧桿菌、變形桿菌存在顯著差異。占今舜等[29]報(bào)道，隨著精料比例增加瘤胃中放線菌門數(shù)量增加。研究報(bào)道，擬桿菌門豐度的高低可能與高纖維飼糧有關(guān)，擬桿菌門又是降解碳水化合物的組要微生物群[30]。本研究中，極高組公羊與極高組母羊擬桿菌門差異顯著，高RFI 公羊具有較高的擬桿菌門，因此高RFI 公羊具有較高消化纖維類飼料能力。在公羊不同RFI 表型中廣古菌門(Euryarchaeota)中的甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)和變形菌門差異顯著。廣古菌門在動(dòng)物胃腸道中主要以產(chǎn)甲烷菌的形式存在，Methanobrevibacter通常將無機(jī)或有機(jī)化合物厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳排放，造成巨大的能量損失和環(huán)境污染。眾多研究發(fā)現(xiàn)，甲烷排放與飼料效率有關(guān)[31-33]，Ellison 等[34]發(fā)現(xiàn)采用青貯料飼喂羔羊時(shí)，Methanobrevibactr在低RFI 羊瘤胃中豐度更高，這與本研究結(jié)果一致。然而，也有研究報(bào)道，瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的豐度在高RFI 動(dòng)物中更高，這似乎更符合理論事實(shí)[35]。造成這種原因的結(jié)果可能與其他菌群相互作用有關(guān)，董利鋒等[36]報(bào)道，Geobacterspp的存在能夠直接通過電子轉(zhuǎn)移與產(chǎn)甲烷菌形成協(xié)同作用，減少有機(jī)物發(fā)酵產(chǎn)物的積累而促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌的定植。Geobacterspp是屬于變形菌門Geobacteraceae 科的微生物，恰好在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)， 兩種變形菌門菌屬Olsenella、Bifidobacterium，并 且Olsenella和Bifidobacterium在極高RFI 母羊中的豐度均高于極低RFI 母羊，因此Olsenella和Bifidobacterium具 有 與Geobacterspp類似的作用。

4 結(jié)論

性別對(duì)極高或極低RFI 個(gè)體瘤胃微生物有顯著影響，Olsenella菌屬為母羊第1 菌屬，普雷沃氏菌屬(Prevotella)為公羊第1 優(yōu)勢(shì)菌屬異，但不同RFI灘羊群體間瘤胃菌群多樣化和豐富度相似，瘤胃微生態(tài)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。優(yōu)勢(shì)菌群的種類和豐度在不同RFI 組灘羊瘤胃微生物區(qū)系中基本一致，厚壁菌門菌群數(shù)量的增加可能與RFI 有關(guān)；不同RFI 公羊組廣古菌門中的Methanobrevibacter 菌群在低RFI 羊瘤胃中豐富度更高，不同RFI 母羊組微生物多樣性差異不顯著。