腸桿菌植酸酶基因的克隆及重組表達(dá)

程琪，趙東瑩，李楊，包永明,

（1.大連理工大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221；2.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024）

植酸酶，又稱肌醇六磷酸水解酶，可水解植酸，產(chǎn)物為磷酸及肌醇衍生物[1]。植酸酶添加到飼料中，不僅可以提高動(dòng)物對飼料中磷和其他元素的利用率，還可以減少動(dòng)物糞便中磷含量，降低對土壤環(huán)境的污染[2-3]。根據(jù)最適pH值可將植酸酶分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶；根據(jù)立體專一性可分為3-植酸酶、5-植酸酶和6-植酸酶；根據(jù)催化機(jī)理和結(jié)構(gòu)可分為組氨酸酸性植酸酶（HAPhy）、β—螺旋槳植酸酶（BPP）、半胱氨酸磷酸酶植酸酶（CPhy）和紫色酸性磷酸酶植酸酶（PAPhy）。植酸酶在自然界中廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，其中由于動(dòng)植物體內(nèi)植酸酶產(chǎn)量和酶活性相對較低[4]，相關(guān)研究也較少。目前工業(yè)化生產(chǎn)的植酸酶多來自于真菌，其中曲霉菌屬的黑曲霉應(yīng)用較多，其植酸酶活性雖較高，但pH值適用條件較苛刻，限制其在動(dòng)物飼料和酶制劑領(lǐng)域的應(yīng)用[5]。20世紀(jì)80年代陸續(xù)篩選出產(chǎn)植酸酶的細(xì)菌，且產(chǎn)生的植酸酶往往有一些特性，如枯草芽孢桿菌植酸酶的活性與穩(wěn)定性需要與Ca2+聯(lián)用才能體現(xiàn)等[6]。由于細(xì)菌植酸酶具有較高的熱穩(wěn)定性及蛋白酶水解穩(wěn)定性，有良好的開發(fā)空間[4]。然而，由于細(xì)菌植酸酶表達(dá)量較低限制其規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用，因此克隆細(xì)菌植酸酶基因，構(gòu)建高效表達(dá)的工程菌進(jìn)行異源表達(dá)可獲得高產(chǎn)量的酶，酶學(xué)特性也因其易分離純化而得到更好的解析。

前期從土壤中篩選出一株可以水解有機(jī)磷的菌株，經(jīng)鑒定為阿氏腸桿菌，命名為Enterobacter asburiaeZSH Y1。本研究利用PCR技術(shù)，從其基因組克隆植酸酶基因phyE，構(gòu)建重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)植酸酶；分析植酸酶PhyZSHY1-nsp與報(bào)道植酸酶的同源性，分離純化重組植酸酶PhyZSHY1-nsp，研究其酶學(xué)性特性，為工業(yè)酶制劑的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：本研究中所使用的產(chǎn)植酸酶菌株為前期實(shí)驗(yàn)室篩選獲得，經(jīng)過生理生化及分子生物學(xué)鑒定確定為Enterobacter asburiaeZSH Y1[7]。重組表達(dá)使用菌株E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

質(zhì)粒：pET28a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：（1）蒙金娜培養(yǎng)基。10.0g·L-1葡萄糖，0.3g·L-1KCl，0.3g·L-1NaCl，0.5g·L-1(NH4)2SO4，0.03g·L-1Mn-SO4·4H2O，0.3g·L-1MgSO4·7H2O，0.03g·L-1FeSO4·7H2O，2.0g·L-1植酸鈉，pH值7.0，115℃滅菌20min。（2）LB液體培養(yǎng)基。10.0g·L-1蛋白胨，10.0g·L-1NaCl，5.0g·L-1酵母浸粉，pH值7.5，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基在其基礎(chǔ)上添加20.0g·L-1瓊脂粉。

硫酸卡那霉素：配置母液濃度50mg·mL-1，使用終濃度為50μg·mL-1，置于-20℃保存。

IPTG：配置母液濃度為1mol·L-1使用終濃度為1mM，置于-20℃保存。

Tris-HCl緩沖液母液：1mol·L-1Tris-HCl，pH值7.4。

細(xì)胞破碎液：50mmol·L-1MTris-HCl，50mmol·L-1NaCl，pH值7.4。

Ni-NTA純化平衡緩沖液（Binding Buffer）：20mmol·L-1Tris-HCl，pH值7.4。

Ni-NTA純化清洗緩沖液（Wash Buffer）：20mmol·L-1Tris-HCl，0.5mol·L-1NaCl，25mmol·L-1咪唑，pH值7.4。

Ni-NTA純化洗脫緩沖液（Elution Buffer）：20mmol·L-1Tris-HCl，0.5mol·L-1NaCl，0.5mol·L-1咪唑，pH值7.4。

透析緩沖液：50mmol·L-1Tris-HCl，40%蔗糖，pH值7.4。

Q柱純化緩沖液（A液）：20mmol·L-1Tris-HCl，pH值7.4。

Q柱純化緩沖液（B液）：20mmol·L-1Tris-HCl，1mol·L-1NaCl，pH值7.4。

以上緩沖液均過膜后，121℃滅菌20min，室溫保存。

儀器：酶標(biāo)儀SpectraMax M2e（美國Molecular Devices）、全溫振蕩培養(yǎng)箱ZQPL-200（天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋SS-325（日本TOMY）、超聲破碎儀UP 200H(德國Dr.Hielscher)等。

試劑、酶和試劑盒：植酸鈉購于Sigma公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker、BSA標(biāo)準(zhǔn)品購于Solarbio公司；DL10000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase（2×）購于Takara公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、Quick Ligation?快速連接試劑盒購于New England Biolabs公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購于上海生工公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于北京天根公司；其余試劑購于天津大茂。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取采用天根公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取E.asburiaeZSH Y1的全基因組，具體操作步驟與細(xì)節(jié)參照試劑盒說明書。

1.2.2 菌株E.asburiaeZSH Y1植酸酶基因克隆基于已報(bào)道的腸桿菌植酸酶基因進(jìn)行多重序列比對，選取高度保守的N端與C端區(qū)域，設(shè)計(jì)上下游引物并組合成4對引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為上下游引物各1μL，模板DNA1μL，高保真酶Prime STAR Max DNA Polymerase（2×）25μL，ddH2O22μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s(1kb·min-1),30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。

表1 E.asburiae ZSH Y1植酸酶基因克隆引物Table 1 Cloning primer for E.asburiae ZSH Y1 phytase gene

通過NCBI比對分析克隆得到的腸桿菌植酸酶部分基因序列，顯示其與數(shù)據(jù)庫中提交的腸桿菌全基因組序列具有較高的相似性，選擇、設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增植酸酶全長基因序列的引物（表2），以E.asburiaeZSH Y1基因組為模板，PCR擴(kuò)增E.asburiaeZSH Y1的植酸酶全長基因，PCR擴(kuò)增體系和程序同上，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收擴(kuò)增片段，送上海生工測序；測序得到的序列分別進(jìn)行開放框閱讀分析，確定植酸酶編碼基因phyE。

表2 植酸酶全基因phyE擴(kuò)增引物Table 2 Primers for phyE amplificarion

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)測序獲得E.asburiaeZSH Y1植酸酶全長無信號肽基因序列phyE-nsp，設(shè)計(jì)帶有限制性酶NdeⅠ、XhoⅠ位點(diǎn)的引物Fnsp和Rnsp（表3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，雙酶切phyE-nsp PCR片段和pET28a(+)質(zhì)粒，T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

表3 無信號肽基因phyE-nsp帶酶切位點(diǎn)擴(kuò)增引物Table 3 Primers with restriction site for no signal peptide gene phyE-nsp

1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化采用熱激法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB的抗性平皿，培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng)12～16h。挑取平板上單一菌落至5mL的抗性LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h。

1.2.5 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證提取單一菌落的質(zhì)粒，雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)酶切片段與連接前片段大小一致后，重組質(zhì)粒送至測序公司測序。

1.2.6 重組植酸酶的表達(dá)測序正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)-phyE-nsp轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布平皿37℃培養(yǎng)12h，挑取菌落接種于抗性LB液體培養(yǎng)基中，搖床37℃，180r·min-1培養(yǎng)3h，加入IPTG至終濃度為1mmol·L-1，于16℃搖床中180r·min-1培養(yǎng)16h。

1.2.7 重組植酸酶的純化培養(yǎng)菌液于4℃冷凍離心機(jī)中，10000g離心10min，收集菌體，細(xì)胞懸浮洗滌兩次后，加入適量細(xì)胞破碎液和溶菌酶，室溫放置15min后超聲破碎，破碎液12000g離心10min，收集上清液，0.22μm無菌濾膜過濾后，獲得樣品。（1）Ni柱親和層析分離，使用5倍柱體積（CV）的純水沖洗Ni柱，再用5CV的Binding buffer平衡Ni柱后，樣品上樣后，用2CV的Wash buffer洗脫未結(jié)合的雜蛋白，用2CV的Elution buffer洗脫Ni柱，收集洗脫液，收集樣品經(jīng)濃縮透析脫鹽后，測定酶活與蛋白濃度。（2）陰離子交換（Q FF離子）分離，采用Purifier 10（GE Healthcare）使用5CV的純水沖洗Q柱，再用A液平衡層析柱，Ni柱純化樣品上樣，用A液平衡后，采用0～1mol·L-1NaCl梯度洗脫，在線監(jiān)測OD280值，收集分離組份，樣品測定酶活與蛋白濃度后，12.5%SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.8 植酸酶活力檢測按照國標(biāo)《飼用植酸酶活性的測定—分光光度法》（GB/T 18634—2009）測定樣品植酸酶活性。酶活單位定義為：在37℃、pH值5.5的條件下，每分鐘從濃度5.0mmol·L-1植酸鈉溶液中釋放1μmol無機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位（U）。

1.2.9 重組植酸酶酶學(xué)性質(zhì)表征（1）最適溫度和溫度穩(wěn)定性。在pH值5.5條件下，分別在20～70℃的溫度范圍內(nèi)測定純酶酶活，確定酶的最適溫度。將純化的植酸酶分別在20～60℃孵育180min后，于37℃測定酶活，分析植酸酶的熱穩(wěn)定性。（2）最適pH值和pH穩(wěn)定性。在37℃條件下，分別在pH值2.0～10.0測定酶活，確定酶的最適pH值。將純化的植酸酶分別與pH值2.0～10.0的緩沖液孵育1h后測定酶活，分析植酸酶的pH穩(wěn)定性。所用緩沖液為：pH值2.0～3.5，0.1mol·L-1甘氨酸—HCl緩沖液；pH值4.0～6.0，0.1mol·L-1乙酸—乙酸鈉緩沖液；pH值6.5，0.1mol·L-1檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液；pH值7.0～9.5，0.1mol·L-1Tris—HCl緩沖液；pH值10.0，0.1mol·L-1甘氨酸—NaOH緩沖液。（3）金屬離子和潛在抑制劑。在最適溫度和pH的條件下，分別將純化的植酸酶與終濃度1mmol·L-1和5mmol·L-1的金屬離子和潛在抑制劑孵育1h后，測定酶活。（4）酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。在37℃、pH值5.5的條件下，分別以不同濃度（0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8，10mmol·L-1）的植酸鈉為底物，測定植酸酶活力，通過Lineweaer-burk雙倒數(shù)曲線獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和kcat。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均設(shè)置3組平行，數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差組成，利用Origin 2017制圖。采用SPSS 26軟件中的ANOVA的單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05時(shí)表示存在顯著差異；p＜0.01時(shí)，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株E.asburiae ZSH Y1植酸酶基因克隆

利用腸桿菌來源植酸酶的N-端和C-端保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物的4對引物，以E.asburiaeZSH Y1基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1。引物F1R1與F2R1擴(kuò)增出與保守序列大小一致的片段，結(jié)合菌株在蒙金娜固體培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)溶磷圈，證明菌株E.asburiaeZSH Y1有植酸酶的基因，可以表達(dá)植酸酶。

圖1 E.asburiae ZSH Y1植酸酶基因克隆Figure 1 Cloning of E.asburiae ZSH Y1 phytase gene

引物TF1TF2、TR1TR2以E.asburiaeZSH Y1的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2。將片段分別純化回收并測序，對擴(kuò)增產(chǎn)物1-X（2399bp）、1-S（1735bp）和A1427（1427bp）這3個(gè)序列進(jìn)行開放閱讀框分析（Open Reading Flame），在NCBI數(shù)據(jù)庫BlastX分析后，確定了全長植酸酶PhyZSHY1的全基因序列phyE（1359bp）與氨基酸序列(452aa)，得到菌株E.asburiaeZSH Y1的理論全長植酸酶基因（圖3）。

利用在線軟件SignalP 5.0對植酸酶PhyZSHY1的氨基酸序列進(jìn)行分析，確定了其在N-端包含一個(gè)長度為20aa的信號肽序列，信號肽的切割位點(diǎn)在氨基酸A20和A21之間。將去除信號肽的PhyZSHY1-nsp氨基酸序列進(jìn)行InterPro保守域結(jié)構(gòu)分析后，確定序列含有1個(gè)植酸酶家族保守域序列PF13449（P53—F391），表明其具有磷酸二酯酶的活性，屬于植酸酶超家族cl26171的一員。在UniProt中比對植酸酶（登錄號：Q328Q5）與PhyZSHY1-nsp同源性達(dá)88%；基于氨基酸序列多重比對(圖4)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，植酸酶PhyZSHY1-nsp與E.hormaechei來源的植酸酶（登錄號：WP_157970380）具有100%的同源性，但未見植酸酶（登錄號：WP_157970380）的酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能報(bào)道。

選取植酸酶（登錄號：Q328Q5）為模板在SWISSMODEL中對植酸酶PhyZSHY1-nsp進(jìn)行同源建模（圖6），它的結(jié)構(gòu)包括31個(gè)β折疊，9個(gè)310螺旋和1個(gè)α螺旋，判斷為α+β類蛋白質(zhì)。

圖2 引物TF1、TR1擴(kuò)增結(jié)果（1-X、1-S）與引物TF2、TR2擴(kuò)增結(jié)果（A1427）Figure 2 DNA 1-X and 1-S from primer TF1TR1 and A1427 from TF2，TR2

圖3 ORF分析全長植酸酶PhyZSHY1的全基因序列phyE與氨基酸序列Figure 3 phyE and amino acid sequence of PhyZSHY1 by ORF

2.2 重組菌株構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

2.2.1 PhyZSHY1重組菌株構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-phyE-nsp采用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳如圖7，酶切產(chǎn)物的兩條片段，長度分別與目的基因phyE-nsp和pET28a(+)一致，測序結(jié)果證明目的基因正確。

2.2.2 重組質(zhì)粒pET28a(+)-phyE-nsp誘導(dǎo)表達(dá)及純化重組菌株pET28a(+)-phyE-nsp/BL21(DE3)經(jīng)低溫誘導(dǎo)16h后，離心收集菌體，破碎菌體、離心收集上清液，HisTrap分離純化后，收集活性組分，進(jìn)行第二步Q Sepharose Fast Flow分離純化，洗脫曲線如圖8，活性峰為0.1mol·L-1NaCl的洗脫峰。經(jīng)SDS-PAGE分析，獲得純化的重組植酸酶PhyZSHY1-nsp（圖9）。

圖4 植酸酶PhyZSHY1多重序列比對Figure 4 Alignment of amino acid sequences for PhyZSHY1

圖5 植酸酶PhyZSHY1-nsp的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree base on amino sequences of PhyZSHY1-nsp

圖6 植酸酶PhyZSHY1-nsp同源建模三級結(jié)構(gòu)Figure 6 Homology modeling structure of Phytase phyZSHY1-nsp

2.2.3 植酸酶PhyZSHY1-nsp精確分子量測定 通過在線軟件ExPASy對重組植酸酶PhyZSHY1-nsp分析，得到其理論分子量和等電點(diǎn)分別為48817.21Da和5.72。將獲得的純化樣品進(jìn)行四極桿-靜電場軌道阱高分辨液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析，得到其實(shí)際分子量為48817.87Da（圖10），與預(yù)測結(jié)果一致，證明獲得純化的植酸酶。

2.3 重組植酸酶PhyZSHY1-nsp的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 最適溫度與溫度穩(wěn)定性以5℃的梯度考察溫度對PhyZSHY1-nsp活性的影響，PhyZSHY1-nsp的最適作用溫度為60℃（圖11）。

圖7 重組質(zhì)粒pET28a(+)-phyE-nsp酶切驗(yàn)證Figure 7 Identification of recombinant plasmid pET28a(+)-phyE-nsp by enzyme digestion

圖8 重組植酸酶PhyZSHY1-nsp離子交換層析洗脫曲線Figure 8 Ion exchange chromatography elution curve of PhyZSHY1-nsp

圖9 純化重組植酸酶PhyZSHY1-nsp的SDS-PAGE電泳圖Figure 9 SDS-PAGE analysis of the purified PhyZSHY1-nsp

植酸酶PhyZSHY1-nsp的溫度穩(wěn)定性如圖12，在低于40℃的溫度下較穩(wěn)定，其活性保持在60%以上，50℃孵育后，植酸酶活性維持在最大活性的50%以上，60℃孵育30min后失活，證明植酸酶PhyZSHY1-nsp為中溫植酸酶。

2.3.2 pH值對重組植酸酶PhyZSHY1-nsp活性的影響植酸酶PhyZSHY1-nsp的最適pH值為4.5。當(dāng)pH值小于4.0或大于7.0時(shí)，活性顯著降低（圖13）。當(dāng)PhyZSHY1-nsp在pH值4.0～5.5范圍內(nèi)的緩沖液中孵育1h后，酶的相對活力均保持在90%以上，在酸性緩沖液中酶活力明顯高于堿性緩沖液中，并且活力相對穩(wěn)定（圖14），說明PhyZSHY1-nsp是酸性植酸酶。

2.3.3 金屬離子和抑制劑對植酸酶PhyZSHY1-nsp活性的影響PhyZSHY1-nsp與1mmol·L-1和5mmol·L-1的金屬離子和潛在抑制劑分別孵育后（表4），Cu2+、Co2+對植酸酶有抑制作用，其中Cu2+濃度越高抑制作用越強(qiáng)。Na+、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+對植酸酶有促進(jìn)作用，其中Na+、Ca2+在濃度為5mmol·L-1時(shí)激活作用強(qiáng)于1mmol·L-1；而K+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+在濃度5mmol·L-1時(shí)激活作用弱降低；EDTA對植酸酶活性影響不大；SDS會(huì)明顯抑制活性。

圖10 植酸酶PhyZSHY1-nsp的精確分子量Figure 10 Accurate molecular weight of PhyZSHY1-nsp

圖11 植酸酶PhyZSHY1-nsp的最適溫度Figure 11 Optimal temperature of PhyZSHY1-nsp

圖12 植酸酶PhyZSHY1-nsp的溫度穩(wěn)定性Figure 12 Thermostability of PhyZSHY1-nsp

圖13 植酸酶PhyZSHY1-nsp的最適反應(yīng)pHFigure 13 Optimal pH of PhyZSHY1-nsp

圖14 植酸酶PhyZSHY1-nsp的pH穩(wěn)定性Figure 14 pH stability of PhyZSHY1-nsp

2.3.4 植酸酶PhyZSHY1-nsp的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)在37℃，pH值5.5的條件下，利用不同濃度的植酸鈉為底物測定植酸酶的反應(yīng)初速率，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，經(jīng)線性回歸計(jì)算反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)（圖15）：植酸酶對植酸鈉的水解作用符合米氏方程，求得植酸酶的米氏常數(shù)Km為0.86mmol·L-1，最大反應(yīng)速率Vmax為0.62μmol·min-1mgprotein-1，kcat為16.04s-1，kcat/Km為18.66L·s-1·mmol-1。

表4 金屬離子與潛在抑制劑對PhyZSHY1-nsp活性的影響Table 4 Effect of metal ions and potential inhibitor on activity of PhyZSHY1-nsp

3 討論與結(jié)論

目前，來源于微生物的植酸酶多數(shù)是組氨酸酸性磷酸酶植酸酶（HAPhy），其空間構(gòu)象中，活性部位的一些保守氨基酸形成一個(gè)可以與底物結(jié)合的口袋，活性部位通常包括兩個(gè)功能部位，一是位于N端的“RHGXPXP”元件的“結(jié)合部位”，另一個(gè)是位于C端的“HD”元件的“催化部位”[8]。桿菌植酸酶通常不存在保守元件“RHGXPXP”，其活性和穩(wěn)定性由Ca2+保持[9]，來自B.amyloliquef aciens植酸酶的活性部位有4個(gè)Ca2+，且還有兩個(gè)不同作用的磷酸位點(diǎn)（Pho1和Pho2）[10]。解析植酸酶PhyZSHY1-nsp的氨基酸序列，未發(fā)現(xiàn)HAPhy植酸酶常規(guī)的活性部位。根據(jù)同源建模得到的三維結(jié)構(gòu)分析，PhyZSHY1-nsp活性中心為His17，活性中心位于N端一個(gè)β折疊鄰近的loop環(huán)區(qū)[11]。

圖15 植酸酶PhyZSHY1-nsp LineWeaver-Burk圖Figure 15 Lineweaver-Burk graph of PhyZSHY1-nsp

由于植酸分子的特殊立體構(gòu)象，植酸酶水解又具有立體專一性，國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)-國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC-IUBMB）目前認(rèn)可3類植酸酶：3-植酸酶、6-植酸酶和5-植酸酶。3-植酸酶首先釋放C3位的磷酸基團(tuán)開始水解植酸，隨后釋放其他位置的磷酸基團(tuán)，絕大多數(shù)微生物可產(chǎn)3-植酸酶[12]，如Aspergillus niger[13]和Klebsiellasp.ASR1[14]菌株產(chǎn)3-植酸酶，且水解植酸終產(chǎn)物為2-磷酸肌醇單酯。通過在UniProt數(shù)據(jù)庫中與腸桿菌科Shigella dysenteriae植酸酶[15]（登錄號：Q328Q5）保守性比對達(dá)88%，發(fā)育樹分析也處于同一分支，植酸酶Q328Q5屬于3-植酸酶，因此植酸酶PhyZSHY1-nsp可能屬于3-植酸酶，后續(xù)需進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)其水解產(chǎn)物判定植酸酶PhyZSHY1-nsp的分類。

細(xì)菌植酸酶因其產(chǎn)量低限制其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，分離新的植酸酶基因，構(gòu)建篩選高產(chǎn)量的重組菌株仍是目前植酸酶研究領(lǐng)域的重點(diǎn)[16-20]。利用大腸桿菌作為宿主菌株異源表達(dá)植酸酶已有報(bào)道，如GULATI等[21]優(yōu)化培養(yǎng)基后使得芽孢桿菌植酸酶活性可達(dá)到2.9573U·mL-1，芽孢桿菌MD2植酸酶通過生物反應(yīng)器高效表達(dá)，酶活性達(dá)327U·mL-1[22]。植酸酶PhyZSHY1-nsp的酶活為1.74U·mL-1，后續(xù)可通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)如理化設(shè)計(jì)等提高酶活性。

本研究中，以E.coliBL21(DE3)菌株作為宿主菌株獲得的植酸酶PhyZSHY1-nsp為可溶性表達(dá)的。經(jīng)過Ni-NTA和Q FF純化后，獲得了電泳純的植酸酶，經(jīng)四極桿-靜電場軌道阱高分辨液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析后，分子量為48817.87Da，與報(bào)道的大多數(shù)細(xì)菌植酸酶（37～55kDa）一致[23-25]。

植酸酶PhyZSHY1-nsp的最適反應(yīng)溫度為60℃，高于來源于Bacillus subtilis US417植酸酶最適溫度為55℃[26]；而Pedobacter nyackensis植酸酶最適溫度僅為45℃[27]。在中低溫的環(huán)境中，PhyZSHY1-nsp酶活性，即使在50℃孵育3h后，仍能保持50%的活性，可以認(rèn)為是中溫植酸酶。

在酸性環(huán)境（pH值4.0～7.0）中，PhyZSHY1-nsp可以發(fā)揮60%以上酶活，但在堿性環(huán)境中活性驟減，穩(wěn)定性也不如酸性條件下。多數(shù)細(xì)菌植酸酶最適pH為酸性，如植酸酶E.coliappA-Q258N/Q349N的最適pH值為4.5[28]，PhyZSHY1-nsp的最適pH值為4.5，屬于酸性植酸酶。

通過測定不同金屬離子對PhyZSHY1-nsp的影響，發(fā)現(xiàn)螯合劑EDTA對酶的活性（5mmol·L-1）沒有顯著影響，表明該酶不是金屬酶[29]。變性劑SDS抑制PhyZSHY1-nsp活性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[29]。一般來說，除了芽孢桿菌植酸酶活性依靠Ca2+，如B.subtilis植酸酶PhyC必須依靠Ca2+才能發(fā)揮催化活性[30-31]；植酸酶活性不需要金屬離子[29]，這類植酸酶屬于β-螺旋槳植酸酶（BPP），通常是堿性植酸酶[12]。二價(jià)金屬離子Fe2+和Cu2+對PhyZSHY1-nsp的抑制作用與報(bào)道的其他植酸酶一致[24;32]。

植酸酶的開發(fā)利用中，將植酸酶制成酶制劑添加進(jìn)動(dòng)物飼料中仍是主流，在制粒過程中，高溫加熱會(huì)損害植酸酶的一定活性，因此開發(fā)耐熱植酸酶依舊是研究的重點(diǎn)。進(jìn)一步的研究中，可以考慮對重組植酸酶PhyZSHY1-nsp進(jìn)行定向進(jìn)化，對其序列中的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，提高酶的高溫穩(wěn)定性。

本研究基于腸桿菌E.asburiaeZSH Y1降解植酸的特性，篩選、設(shè)計(jì)引物通過PCR技術(shù)克隆植酸酶基因，構(gòu)建pET28a(+)重組表達(dá)質(zhì)粒，在E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。重組植酸酶PhyZSHY1-nsp，采用Ni-NTA和Q-Sepharose Fast Flow進(jìn)行柱層析純化；酶學(xué)分析表明植酸酶PhyZSHY1-nsp屬于3-植酸酶，包含432個(gè)氨基酸，重組植酸酶的分子量為48817.21Da，等電點(diǎn)為5.72；酶催化反應(yīng)的最適溫度60℃，最適pH值為4.5，Mg2+、Cu2+、Zn2+、Al3+等金屬離子及SDS對酶促反應(yīng)有抑制作用；底物為植酸鈉時(shí)，植酸酶Km為0.86mmol·L-1，kcat為16.04s-1，kcat/Km為18.66L·s-1·mmol-1。