歐亞類禽H1N1豬流感病毒研究進(jìn)展

李海玲，張世偉，馮亞莉，冷昊鈺，呂嘉銘，徐藝娜，蘇超凡，湯思淇，王永濤，張瑩

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，沈陽 110161）

豬的呼吸道上皮細(xì)胞中存在SA-α-2,3-Gal（禽）和SA-α-2,6-Gal（人）受體，對禽流感病毒和人流感病毒的敏感性增強(qiáng)，可以充當(dāng)甲型流感病毒（IAV）的中間宿主。并且在豬感染了豬流感病毒后，還可以同時感染禽流感病毒和人流感病毒，使豬、禽和人流感病毒之間發(fā)生重新組合，從而突破物種屏障，造成流感病毒的大流行。因此，豬被稱為是“流感病毒的混合容器”[1]。豬可以感染不同亞型的流感病毒，包括H1、H2、H3、H4、H5、H7和H9亞型，其中H1N1亞型在豬群中最為流行，其次是H1N2和H3N2亞型[2]。H1N1亞型的豬流感病毒又可分為經(jīng)典豬流感病毒（Classical swine H1N1,CS H1N1）、歐亞類禽H1N1豬流感病毒（Eurasian avian-like H1N1,EA H1N1）和2009年大流行H1N1病毒（2009 Pandemic H1N1,2009/H1N1）等。1979年，在比利時的豬群中發(fā)現(xiàn)了與1976～1977年間在南美和聯(lián)邦德國的野禽中分離到的H1N1病毒的抗原性上有緊密聯(lián)系的流感病毒。此后，該病毒便開始在歐洲和亞洲的豬群中流行，并形成了一個單獨的分支，將其稱為EA H1N1豬流感病毒[3-4]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，豬群的數(shù)量也逐漸龐大起來，流感病毒便有了更多數(shù)量的傳播媒介。VIJAYKRISHNA等[5]研究發(fā)現(xiàn)，自2005年起，EA H1N1豬流感病毒在豬群中就逐漸成為了流感病毒傳播的主力。通過在禽、豬和人類之間的跳躍，病毒自身也在不斷重組。針對其能夠在人群和豬群中傳播，且在豬流感病毒傳播過程中占據(jù)著主導(dǎo)地位，本研究對EA H1N1豬流感病毒在國內(nèi)外的流行狀況、基因片段的重組、在哺乳動物中發(fā)生適應(yīng)性突變而產(chǎn)生的功能影響和當(dāng)前對其較為有效的防治措施方面進(jìn)行綜述，闡明了EA H1N1豬流感病毒能夠在各個國家甚至世界范圍內(nèi)都占據(jù)主要的傳播地位的原因，并分析了主流防治策略的現(xiàn)狀。

1 歐亞類禽H1N1豬流感病毒的流行狀況

1.1 歐亞類禽H1N1豬流感病毒在國內(nèi)的流行狀況

中國是全球范圍內(nèi)最大的生豬養(yǎng)殖和豬肉消費國，因此更需關(guān)注豬群之間的病毒傳播。EA H1N1豬流感病毒在中國流行的時間軸如圖1。GUAN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在中國，除了1993年在豬群中分離得到的兩株“純禽源”豬流感病毒外，1998年之前所發(fā)現(xiàn)的豬流感病毒均屬于CS H1N1豬流感病毒譜系。通過主動檢測，于2001年首次在香港特別行政區(qū)的豬群中發(fā)現(xiàn)EA H1N1豬流感病毒。中國的豬群對這種病毒的抗體交叉反應(yīng)率在2000年僅為15%，2004年略微升高至26%，再加上EA H1N1豬流感病毒具有快速復(fù)制的能力，使其在中國豬群中的傳播逐漸占據(jù)了主導(dǎo)，取代了當(dāng)時流行的經(jīng)典豬流感病毒和三重排豬流感病毒[5]。2007～2008年，在中國部分省市（福建省、山東省和北京市）共分離出10株EA H1N1豬流感病毒，與當(dāng)時在歐洲地區(qū)流行的病毒（A/swine/Cotes d’Armor/1488/99）有著密切的聯(lián)系[7]?？梢姡珽A H1N1豬流感病毒在中國的傳播速度之快，分布范圍之廣。2009年5月，2009/H1N1豬流感病毒在中國首次被發(fā)現(xiàn)，并在全國范圍內(nèi)進(jìn)行傳播[8]，為EA H1N1豬流感病毒基因片段的重組提供了更多的選擇。2009～2010年在中國南方部分地區(qū)（廣西壯族自治區(qū)和廣東省）的屠宰廠內(nèi)，共分離得到19株EA H1N1豬流感病毒，其中10株的HA和NA基因來自EA H1N1豬流感病毒譜系；PB2、PB1、PA、NP、NS和M基因來自2009/H1N1豬流感病毒譜系。該重組病毒不僅能改變傳播方式，還可以在人類體外的肺部細(xì)胞中復(fù)制[9]。由于中國龐大的豬群數(shù)量以及較低的疫苗普及率[10]，不同亞型的豬流感病毒或多種基因型的EA H1N1豬流感病毒在豬群中共同傳播的現(xiàn)象時有發(fā)生[11-13]，這種共同傳播可能會加速豬流感病毒的重組，產(chǎn)生的重組EA H1N1豬流感病毒在病原學(xué)上發(fā)生了一定程度的改變。于2011年開始為期8年，對中國10個生豬密度較高的省份開展豬流感檢測項目。研究發(fā)現(xiàn)，中國豬群之間流行的流感病毒中，EA H1N1為最主要的亞型（179株豬流感病毒中占比92.2%）。并且根據(jù)其基因片段的差異可進(jìn)一步劃分成6種基因型（G1～6基因型，各自基因片段的來源如表1），其中，G4基因型的EA H1N1豬流感病毒的潛在危害較大，在人類中的感染率逐年增加，特別是18～35歲年齡段的年輕的豬養(yǎng)殖工作者，在所測樣本中的血清陽性率為20.5%（9/44）。這種基因型的豬流感病毒可以優(yōu)先結(jié)合SA-α-2,6-Gal（人）受體，在人群中的傳播能力增強(qiáng)，并且還可以通過氣溶膠的傳播方式感染雪貂。相較于G1基因型的EA H1N1豬流感病毒，其不僅在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出了更強(qiáng)的致病力[14]，在豬體內(nèi)還保持著更快的復(fù)制速率、更強(qiáng)的致病性和更高的聚合酶活性，逐漸成為EA H1N1豬流感病毒中的優(yōu)勢基因型[15]。CHEN等[16]在廣西省的犬體內(nèi)分離出1株G4基因型的EA H1N1豬流感病毒，證明其實現(xiàn)了從豬到犬的跨物種傳播。提示，犬相比于其他動物與人類活動更為密切，頻繁的接觸為流感病毒的擴(kuò)散提供了有利的條件，應(yīng)尤為注意。此外，李梓等[13]于云南分離出的G4基因型的EA H1N1豬流感病毒在氨基酸位點和抗原性上與現(xiàn)階段世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的疫苗株A/Hunan/42443/2015（G5基因型）有明顯不同，且目前存在的人流感病毒疫苗已無法提供有效的保護(hù)。因此，針對其具有威脅公共衛(wèi)生安全的潛力，及時組建更加合適的疫苗株，制定更加有效的防控措施很有必要。2011年，江蘇省出現(xiàn)了1例人類感染EA H1N1豬流感病毒的臨床案例，證實了EA H1N1豬流感病毒可以突破物種屏障，在人群中進(jìn)行傳播的猜想[17-18]。該病毒與2010～2011年間在江蘇省分離得到的部分EA H1N1流感病毒的8個基因片段的同源性為99.1%～99.8%，表明在中國的豬群中EA H1N1豬流感病毒的傳播具有地方性的特點[8]。值得一提的是，該地區(qū)屠宰場42.8%的豬血清對EA H1N1豬流感病毒呈陽性[19]。2012年12月，河北省出現(xiàn)人感染EA H1N1豬流感病毒的病例，該病毒與2011年在江蘇省發(fā)現(xiàn)的病毒同源性為98.9%～99.6%[20]。2015年，在湖南省發(fā)現(xiàn)的1株重組EA H1N1豬流感病毒，其HA、NA和M基因來自EA H1N1豬流感病毒譜系；PB2、PB1、PA和NP基因來自2009/H1N1豬流感病毒譜系；NS基因來自CS H1N1豬流感病毒譜系。這種重組的EA H1N1豬流感病毒在被感染的兒童身上表現(xiàn)出更明顯的臨床癥狀，在小鼠體內(nèi)也表現(xiàn)出更強(qiáng)的傳播和復(fù)制能力[21]。在這之后，將這一毒株分別接種于小鼠和雪貂，發(fā)現(xiàn)其在小鼠模型上的毒力比以往其他的分離株更強(qiáng)，并且具有通過空氣中的飛沫在雪貂之間傳播的能力[22]。2016年，在福建省1名患者的咽部分離得到的EA H1N1豬流感病毒（A/Fujian-cangshan/SWL624/2016），其HA和NA基因來自EA H1N1豬流感病毒譜系；PB2、PB1、PA、NP和M基因來自2009/H1N1豬流感病毒譜系；NS基因來自CS H1N1豬流感病毒譜系。這種基因型的EA H1N1豬流感病毒具有在人群中傳播的潛能，在哺乳動物體內(nèi)的毒力較強(qiáng)，并且產(chǎn)生了一定程度的耐藥性，有利于其傳播[23]。2018年，天津市疾控中心從1名伴有明顯流感癥狀的男孩身上分離出1株發(fā)生重組的EA H1N1豬流感病毒，其重組方式與A/Fujian-cangshan/SWL624/2016相似[24]，展現(xiàn)了EA H1N1豬流感病毒強(qiáng)大的跨地區(qū)傳播能力。ZHOU等[25]于中國南方的部分地區(qū)（廣東省、浙江省、云南省和福建?。┎杉?180個豬血清樣本，其中219個樣本對EA H1N1豬流感病毒的抗體呈陽性，這些省份都是禽類養(yǎng)殖的主要地區(qū)。由此可見，EAH1N1豬流感病毒的出現(xiàn)，不斷沖擊著生豬養(yǎng)殖行業(yè)，偶爾還會與不同譜系的豬流感病毒發(fā)生重組，產(chǎn)生不同的基因型，再一次鞏固了其在豬流感病毒傳播中的地位。

圖1 EA H1N1豬流感病毒在國內(nèi)流行的時間軸Figure 1 Timeline of the domestic epidemic of EA H1N1 swine influenza virus

表1 2011～2018年中國10個省份6種基因型的EA H1N1豬流感病毒Table 1 Six genotypes of EA H1N1 swine influenza virus in 10 provinces of China,2011-2018

1.2 歐亞類禽H1N1豬流感病毒在國外的流行狀況

圖2 EA H1N1豬流感病毒在國外流行的時間軸Figure 2 Timeline of EA H1N1 swine influenza virus epidemic in foreign countries

OTTIS等[4]研究發(fā)現(xiàn)，禽源的H1N1豬流感病毒株可以感染豬，并通過接觸在豬群中進(jìn)行傳播。歐洲地區(qū)（意大利）的豬群對EA H1N1豬流感病毒的適應(yīng)可以表明，與其他豬流感病毒相比，EA H1N1豬流感病毒在豬群中的傳播更有優(yōu)勢，其在抗原和基因上與人類H1N1流感病毒存在差異，這種差異將會導(dǎo)致疫苗間不能發(fā)生交叉保護(hù)，具有造成下一次流感大流行的潛力[26]。與此同時，由于豬群對禽類病毒較為敏感[27]，是來自禽源的EA H1N1豬流感病毒較為適宜的宿主，為EA H1N1豬流感病毒的生存和傳播提供了支持。EA H1N1豬流感病毒于1979年被發(fā)現(xiàn)后，在歐洲和亞洲豬群中便開始迅速傳播，偶爾可突破物種屏障造成人類感染（圖2）。1985年在意大利的豬群中出現(xiàn)，并在傳播過程中逐漸取代了當(dāng)時流行的CS H1N1豬流感病毒，在豬流感病毒的傳播中占據(jù)主要地位[28]。1986年，在瑞士和荷蘭的患者體內(nèi)[29]與1991年在德國的一個靠近豬群的火雞養(yǎng)殖場中都發(fā)現(xiàn)了EA H1N1豬流感病毒，進(jìn)一步證實了該病毒具有跨物種傳播的可能性[30]。1992年歐洲地區(qū)中流行的EA H1N1豬流感病毒侵入到了英國[31]。于1993年和1996年，先后兩次在荷蘭的豬群中分離得到了EA H1N1豬流感病毒，主要在豬群中傳播，暫時沒有與人類或禽類病毒發(fā)生重組，且并未出現(xiàn)抗原漂移的現(xiàn)象[32-33]，表明在該地區(qū)，病毒正進(jìn)行著穩(wěn)定且持續(xù)的傳播。通過在不同物種之間不斷地跳躍，EA H1N1豬流感病毒的傳播速度和范圍也在逐漸變大。2002年，瑞士1名豬養(yǎng)殖工作者的感染，在時間上展現(xiàn)了其較強(qiáng)的持續(xù)傳播能力[34]。2008年，在西班牙也發(fā)現(xiàn)1名豬養(yǎng)殖工作者感染EA H1N1豬流感病毒的臨床案例，通過基因測序發(fā)現(xiàn)其與2002年在瑞士分離得到的流感病毒株（A/Swiss/8808/2002）具有密切的親緣關(guān)系，在空間上則體現(xiàn)了其較廣的傳播范圍[35-36]。2016年，意大利的1名患者與一對在豬養(yǎng)殖場工作并且最近出現(xiàn)輕微呼吸道癥狀的兄弟接觸后，表現(xiàn)出了較為明顯的流感癥狀。對兄弟2人所在養(yǎng)殖場的豬群進(jìn)行病毒學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)呈IAV陽性，并分離得到1株EA H1N1豬流感病毒，其8個基因片段均來自EA H1N1豬流感病毒譜系[37]。2017～2018年，VANDOORN等[38]研究發(fā)現(xiàn)，比利時免疫功能正常的人群對于EA H1N1豬流感病毒的血清抗體反應(yīng)率普遍不高（≥24%），奠定了其在該地區(qū)流行的基礎(chǔ)。2019年，在荷蘭發(fā)現(xiàn)了人和豬群共同感染EA H1N1豬流感病毒的情況，但沒有進(jìn)一步人傳人的報告出現(xiàn)，未發(fā)生重組[39]。CHEPKWONY等[40-42]對從荷蘭和比利時分離出的89株豬流感病毒樣本進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，EA H1N1豬流感病毒占比最高，為44.9%（40株），且相較于歐洲類人H1亞型的豬流感病毒和CS H1N1豬流感病毒進(jìn)化得更快。同樣，在德國分離的850株豬流感病毒中占比35.7%[43]，在法國分離的887株豬流感病毒中占比69.6%[44]?？梢钥闯?，EA H1N1豬流感病毒在一些國家出現(xiàn)后，分布廣泛，承擔(dān)了主要的傳播責(zé)任。此外，與中國的觀察結(jié)果相似，2009/H1N1豬流感病毒在歐洲的出現(xiàn)，也提高了該地區(qū)EA H1N1豬流感病毒發(fā)生重組的概率。HENRITZI等[45]研究表明，其通過與來自2009/H1N1豬流感病毒的內(nèi)部基因片段組合，產(chǎn)生了多種不同的基因型，其中僅M基因被替換的病毒株占比高達(dá)12.9%（30/233），但其是否具有更大的威脅，還需要進(jìn)行更加深入的研究。綜上，相比于中國，EA H1N1豬流感病毒在這些國家的傳播相對穩(wěn)定，很少發(fā)生基因片段的重組，可能與不同國家針對豬養(yǎng)殖的策略或疫苗的普及程度有關(guān)。因此，鑒于各個地區(qū)流感病毒復(fù)雜的流行特點，為防止新的重組病毒的產(chǎn)生，應(yīng)在疾病出現(xiàn)前采取有效的預(yù)防措施或在發(fā)病初期及時施加合理的治療手段，以避免不同亞型或不同基因型的EA H1N1豬流感病毒的共同傳播。

2 在分子水平上分析為何歐亞類禽H1N1豬流感病毒具有適應(yīng)性優(yōu)勢

IAV是裂解性RNA病毒，其變異速度比逆轉(zhuǎn)錄病毒高出一個數(shù)量級。2009～2013年，將中國進(jìn)行的豬流感病毒檢測項目期間分離出來的屬于EA H1N1豬流感病毒譜系的3個毒株與用于疫苗研制的毒株進(jìn)行比較，發(fā)生了1～11個氨基酸位點突變[46]。這種改變產(chǎn)生的未知影響削弱了人們對EA H1N1豬流感病毒的控制，使其在傳播過程中逐漸掌握了主動權(quán)，本研究涉及到的關(guān)鍵氨基酸位點如表2。

2.1 HA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點

血凝素（HA）將含唾液酸的細(xì)胞表面糖蛋白識別為受體并與之結(jié)合，誘導(dǎo)膜融合并轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，從而引發(fā)感染[47]。HA蛋白由HA1和HA2兩種多肽組成。與HA2多肽相比，HA1多肽似乎更容易發(fā)生突變，對病毒在哺乳動物的適應(yīng)性方面有重要的影響[48]。并且與CS H1N1豬流感病毒相比，EA H1N1豬流感病毒的HA蛋白進(jìn)化的速度更快，優(yōu)先與SA-α-2,6-Gal（人）受體結(jié)合[10]，這種變化也可能是EA H1N1豬流感病毒在豬群中可以持續(xù)而又快速的傳播的因素之一[31]。WANG等[49]利用反向遺傳學(xué)的方法產(chǎn)生突變體并在豚鼠體內(nèi)進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)EA H1N1豬流感病毒的HA1中發(fā)生了G225E氨基酸位點的突變，這種改變使病毒的復(fù)制加快。該發(fā)現(xiàn)將會在豬流感病毒傳播能力強(qiáng)弱的預(yù)測中起關(guān)鍵作用。EA H1N1豬流感病毒的HA中存在著D127E和D222G氨基酸位點的突變，這兩種改變可使2009/H1N1豬流感病毒在小鼠體內(nèi)的適應(yīng)性增強(qiáng)[50-51]。除此之外，在中國流行的EA H1N1豬流感病毒的HA中還存在著E190D氨基酸位點的突變，攜帶這種突變氨基酸的病毒更易與SA-α-2,6-Gal（人）受體結(jié)合，使其在人群中的傳播變得更加高效[52]。HA1中氨基酸位點突變的積累通常會導(dǎo)致抗原漂移，持續(xù)的抗原漂移會促使流感病毒逃避宿主的免疫反應(yīng)，嚴(yán)重影響疫苗作用的發(fā)揮?？乖瓫Q定域Sa位于與受體結(jié)合的近端，其中G158E氨基酸位點的突變，降低了HA蛋白與抗體結(jié)合的親和力，且由于氨基酸的替換，HA蛋白的空間結(jié)構(gòu)上也發(fā)生了一定程度的改變，共同促使EA H1N1豬流感病毒發(fā)生抗原漂移，有利于其在豬群和人群中的傳播[53]。

2.2 PB2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點

PB2蛋白能夠識別并結(jié)合宿主mRNA，協(xié)助病毒mRNA的合成[54]。CAI等[55]通過產(chǎn)生重組病毒并進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)PB2蛋白是病毒在小鼠中致病性強(qiáng)弱的主要決定因素。通過進(jìn)一步分析表明，PB2-R251K氨基酸位點的突變可以增強(qiáng)EA H1N1豬流感病毒（A/swine/Guangdong/MS285/2017）的毒力。馮兆民等[56]經(jīng)序列分析并對比2株從人體內(nèi)分離出來的EA H1N1豬流感病毒發(fā)現(xiàn)，A/Hunan/42443/2015（H1N1,HuN）和A/Jiangsu/1/2011（H1N1,JS1）在PB2蛋白的第271位上的氨基酸不同，分別為A和T，從而得出結(jié)論，PB2-T271A氨基酸位點的突變增強(qiáng)了EA H1N1豬流感病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制能力、聚合酶活性和在小鼠體內(nèi)的致病力。病毒株（A/Hunan/42443/2015）上PB2-T588I氨基酸位點突變的出現(xiàn)，使其在哺乳動物體內(nèi)的復(fù)制效率提高，在小鼠體內(nèi)的致病性上也表現(xiàn)出了一定程度的增強(qiáng)，并且顯著提升了PB2蛋白抑制干擾素生成的能力，影響機(jī)體抗病毒反應(yīng)[57]。XU等[11]通過對比從中國遼寧省屠宰場的豬群中分離出來的兩株EA H1N1豬流感病毒[A/swine/Liaoning/ZD71/2015（ZD71）和A/swine/Liaoning/SY130/2015（SY130）]發(fā)現(xiàn)，ZD71病毒株P(guān)B2蛋白的氨基酸位點上出現(xiàn)了T431M突變，通過影響病毒核糖蛋白復(fù)合物（RNP）的聚合酶活性，使其在小鼠體內(nèi)的毒力增強(qiáng)，但在病毒的傳播方面是否有影響尚不清楚。此外，EA H1N1豬流感病毒的PB2蛋白上還存在著L89V、Q591R、E627K或D701N突變，同樣可以增強(qiáng)EA H1N1豬流感病毒在宿主細(xì)胞中的適應(yīng)性[23,58-60]。

2.3 PA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點

PA蛋白主要在流感病毒聚合酶復(fù)合物組建的過程中發(fā)揮作用，參與流感病毒RNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過程[61]。研究發(fā)現(xiàn)，分別于長沙市、福州市和天津市分離得到的3株EA H1N1豬流感病毒（A/Hunan/42443/2015、A/Fujian-cangshan/SWL624/2016和A/Tianjin-baodi/1606/2018）中都存在L336M、K356R和S409N氨基酸位點的突變，使病毒在小鼠體內(nèi)的聚合酶活性升高，增強(qiáng)其在哺乳動物體內(nèi)的適應(yīng)性[23-24]。

表2 EA H1N1豬流感病毒關(guān)鍵氨基酸位點Table 2 Key amino acid sites of EA H1N1 swine influenza virus

2.4 NP蛋白關(guān)鍵氨基酸位點

核蛋白（NP）和病毒基因組能與PB2、PB1和PA共同組成的流感病毒聚合酶復(fù)合物結(jié)合成RNP，在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和翻譯的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[62]。MxA蛋白有效的抑制了IAV和其他幾種人類RNA病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制[63-64]。M?NZ等[65]研究發(fā)現(xiàn)，所有能適應(yīng)人類的IAV，都會在其NP蛋白中發(fā)生適應(yīng)性突變，使它們能夠避開MxA蛋白的限制。EA H1N1豬流感病毒（A/Swine/Belzig/2/2001）NP蛋白中的K98R、K99R和Q48K突變使其突破了MxA蛋白的限制。因此，發(fā)生了這3個氨基酸位點突變的EA H1N1豬流感病毒可以突破物種屏障，在人群中傳播，擴(kuò)大了適合其寄生的宿主的范圍[66]。此外，NP蛋白中Q357K氨基酸位點的突變也是EA H1N1豬流感病毒逐漸適應(yīng)哺乳動物而產(chǎn)生的標(biāo)志，其在禽類中主要以NP-357Q的形式存在，在豬中則突變?yōu)镹P-357K。比較而言，攜帶NP-357K的EA H1N1豬流感病毒更容易在人體內(nèi)傳播，因此具有更大的潛在威脅[67]。

2.5 M蛋白關(guān)鍵氨基酸位點

流感病毒基質(zhì)蛋白（M）包括基質(zhì)蛋白M1與膜蛋白M2。M1蛋白位于包膜下方，是病毒中含量最豐富的蛋白質(zhì)，主要在病毒的組裝和萌發(fā)過程中發(fā)揮作用。M2蛋白作為離子通道，是金剛烷胺的作用位點[68]。其中，M1蛋白的P41A氨基酸位點的突變，使EA H1N1豬流感病毒的粒子形態(tài)發(fā)生了改變，提高了EA H1N1豬流感病毒的傳播效率[69]。其上的T215A氨基酸位點的突變則增強(qiáng)了EA H1N1豬流感病毒在小鼠體內(nèi)的毒力[24]。金剛烷胺是1種有效的抗病毒藥物，被批準(zhǔn)應(yīng)用于流感病毒的防治。EA H1N1豬流感病毒中M2蛋白的氨基酸位點上出現(xiàn)了S31N取代，使其產(chǎn)生了對金剛烷胺的抗性[70]。具有該適應(yīng)性突變的豬流感病毒株的出現(xiàn)，勢必會降低人類對EA H1N1豬流感病毒的可控性。

2.6 NS蛋白關(guān)鍵氨基酸位點

非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2由病毒RNA編碼，主要在流感病毒的發(fā)育增殖周期中發(fā)揮作用。NS1蛋白能夠抑制干擾素的抗病毒作用，阻抑宿主免疫反應(yīng)，NS2蛋白則與病毒的組裝相關(guān)[71]。LI等[72]研究發(fā)現(xiàn)，EA H1N1豬流感病毒中NS1蛋白A42S氨基酸位點的突變，能夠提高病毒的復(fù)制效率，且在調(diào)控宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

2.7 宿主蛋白關(guān)鍵氨基酸位點

酸性（含亮氨酸）核磷蛋白32家族可與流感病毒聚合酶相互作用，其中的ANP32A和ANP32B蛋白的存在對于IAV的復(fù)制來說是不可或缺的條件[73]。豬的ANP32A蛋白在ANP32蛋白中是一個獨特的存在，為禽流感病毒的聚合酶活性和病毒的復(fù)制提供了幫助[74]。ZHANG等[75]研究發(fā)現(xiàn)，由于豬的ANP32A蛋白出現(xiàn)了I106V和P156S氨基酸位點突變，因此，對禽流感病毒聚合酶活性的支持較ANP32B或其他哺乳動物的ANP32蛋白更強(qiáng)。證明了豬群在禽、豬和人3個物種之間的病毒傳播中承擔(dān)了橋梁的連接作用。EA H1N1豬流感病毒通過在豬群和人群之間的快速傳播，使得其氨基酸位點不斷發(fā)生突變，產(chǎn)生了與哺乳動物更加適合的基因型。

EA H1N1豬流感病毒在哺乳動物中產(chǎn)生的不同類型的適應(yīng)性突變使人們需要不斷調(diào)整對其的防控措施，所造成的功能上的影響也是動態(tài)的，暫時無法使用一種通用的手段將其完全遏制，其通過這種變化保證了在豬流感病毒傳播中的地位。

3 歐亞類禽H1N1豬流感病毒的診斷和防治

3.1 歐亞類禽H1N1豬流感病毒的診斷

通過對患病動物進(jìn)行流行病學(xué)的調(diào)查，并結(jié)合其臨床癥狀表現(xiàn)及病理解剖，有助于做出EA H1N1豬流感病毒感染的初步診斷（體溫升高并伴有呼吸系統(tǒng)癥狀等），基于此，還需結(jié)合更加準(zhǔn)確的實驗室診斷方法進(jìn)一步確診。其中應(yīng)用較為廣泛的包括病毒的分離與鑒定、血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等。傳統(tǒng)的診斷方法（病毒的分離和鑒定與HI和HA試驗等）在病毒的初步分離和鑒定中占重要地位，而分子生物學(xué)診斷技術(shù)（PCR、核酸探針技術(shù)與蛋白芯片等）則更加快速、準(zhǔn)確和便捷，但所需的試劑較為昂貴，不利于其推廣[76]。因此，在以后的研究中，需將兩者高效結(jié)合，為EA H1N1豬流感病毒的診斷提供更加有力的技術(shù)支持。

3.2 歐亞類禽H1N1豬流感病毒的防控

現(xiàn)階段，接種疫苗是防控豬流感病毒感染最主要的措施。大多數(shù)國家廣泛使用的流感病毒滅活疫苗（IIV）可有效預(yù)防與其同源或基因相似的病毒感染[77]，但是對于目前流行的EA H1N1豬流感病毒的防護(hù)仍然有限，其研發(fā)進(jìn)度落后于病毒抗原變化速度，且在不同亞型的病毒間不能提供良好的交叉保護(hù)[78]，主要應(yīng)用于繁殖母豬。研究表明，NS1和M1蛋白內(nèi)可能存在多個適合抗病毒藥物或疫苗開發(fā)的靶點[79-80]。一種通過修飾豬流感病毒NS1蛋白構(gòu)建的活疫苗（LAIV）已被批準(zhǔn)應(yīng)用于降低豬群中流感的發(fā)病率[81]，但其易與地方性病毒發(fā)生重組[82]，并且豬體內(nèi)流感病毒的多樣性也限制了LAIV作用的發(fā)揮，需因地制宜[83]。HERNANDEZ等[84]研發(fā)的亞單位疫苗，可以有效地抵抗豬流感病毒的感染，并能減少被感染動物肺部組織的損傷，擁有良好的安全性，但其缺點是制造成本高且所需疫苗劑量較大，因此需進(jìn)行更深入的研究并改進(jìn)。在免疫接種上，使用異源IIV加強(qiáng)免疫策略有助于保護(hù)豬群，減少病毒感染[85]。另外，在單次注射LAIV后，繼續(xù)提供多價異源IIV加強(qiáng)免疫也是有效的[86]。值得一提的是，由于非洲豬瘟的爆發(fā)，中國豬養(yǎng)殖場生物安全防控措施的規(guī)范，一定程度上也減緩了豬流感病毒的傳播[87]。

3.3 歐亞類禽H1N1豬流感病毒的藥物治療

目前，針對EA H1N1豬流感病毒，臨床上主要應(yīng)用金剛烷類藥物和神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物來控制其發(fā)展，前者為M2通道阻滯劑，抑制病毒的復(fù)制過程。后者可以黏附在病毒的神經(jīng)氨酸酶上，阻止聚集在宿主細(xì)胞表面的子代病毒的釋放。而較為嚴(yán)重的病例，還需采取額外的輔助治療（抗生素、腸外營養(yǎng)和靜脈補(bǔ)液等），控制繼發(fā)感染[88]。研究表明，部分EA H1N1豬流感病毒的M2蛋白上已發(fā)生S31N氨基酸位點的突變，使其對金剛烷胺敏感性降低[23-24,72]，但并未出現(xiàn)與神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物抗性有關(guān)的突變（NA蛋白上的H275Y和N295S氨基酸位點的突變），說明在治療早期使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物可以在一定程度上限制疾病的進(jìn)程。除以上兩種主流藥物外，還發(fā)現(xiàn)了其他抗病毒制劑，可用于作為治療流感病毒感染的備選藥品，如聚合酶抑制劑（利巴韋林）、透明質(zhì)酸抑制劑（阿比多爾）和NP抑制劑（姜黃素）等[89]。此外，出現(xiàn)PB2蛋白的T588I或NS1蛋白的A42S氨基酸位點突變的病毒株，可以通過抑制干擾素的抗病毒作用來調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)[57,72]。因此，應(yīng)高度關(guān)注并持續(xù)監(jiān)測此類氨基酸位點的變化，開發(fā)更加高效的新型藥物，在臨床治療中需選擇合適的抗病毒藥物，合理聯(lián)合用藥，以降低耐藥性產(chǎn)生的風(fēng)險。

4 結(jié)語

現(xiàn)階段，EA H1N1豬流感病毒在豬群中的傳播仍然占據(jù)著主導(dǎo)地位[5,25,40-44]。提示，與普通人群相比，豬養(yǎng)殖工作者患病的概率更大。SUN等[14]通過對照試驗發(fā)現(xiàn)，普通人群和豬養(yǎng)殖工作者對G4基因型的EA H1N1豬流感病毒的血清陽性率分別為4.4%和10.4%，對G1基因型的EA H1N1豬流感病毒的血清陽性率分別為2.2%和6.5%?？梢酝茢?，如果人類與豬群接觸越密切，被感染的概率也就越大。豬作為“流感病毒的混合容器”[1]，可以感染不同亞型的流感病毒，加大了重組病毒產(chǎn)生的概率，尤其是2009/H1N1豬流感病毒的出現(xiàn)，為EA H1N1豬流感病毒的重組提供了更多可以選擇的基因片段[8]。發(fā)生重組的EA H1N1豬流感病毒在傳播性和致病性上呈現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)[14,21]或產(chǎn)生耐藥性[23]，削弱了人們對其的控制能力，為EA H1N1豬流感病毒在人群和豬群中的傳播提供了幫助。在其不斷突破屏障跨物種傳播的過程中[17-18,30,37]部分氨基酸位點也發(fā)生了改變。這種變化使EA H1N1豬流感病毒更加適應(yīng)哺乳動物，如復(fù)制效率提高[49]、抗原漂移[53]和金剛烷胺抗性[70]等。與此同時，豬群和人群中還缺乏相應(yīng)的抗體[5,14,38]，且現(xiàn)階段針對其的防治手段也較為有限，多種因素共同促使EA H1N1豬流感病毒在傳播過程中占據(jù)了主導(dǎo)，逐漸取代了CS H1N1豬流感病毒，具有造成下一次流感大流行的潛力。

綜上，應(yīng)該繼續(xù)加深在EA H1N1豬流感病毒傳播機(jī)制、突變類型和藥物及疫苗預(yù)防等方面的研究，為下一次流感大流行的預(yù)測和防控提供更加有力的支持。