泰山海棠抗旱基因MhDREB2A的克隆與功能鑒定

黨明青，王京平，冉昆，劉加芬，李慧峰

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2.棲霞市寺口鎮(zhèn)綜合服務(wù)站，山東 煙臺(tái) 265300；3.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

轉(zhuǎn)錄因子作為一類關(guān)鍵的調(diào)控因子，通過(guò)結(jié)合下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。越來(lái)越多研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答逆境脅迫的信號(hào)途徑中起著重要的作用[1]。DREB轉(zhuǎn)錄因子（dehydration responsive element binding protein）是AP2/EREBP（APETALA 2/an ethylene responsive element binding protein）轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，此類轉(zhuǎn)錄因子含有保守的AP2結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地結(jié)合到抗逆基因啟動(dòng)子區(qū)域的DRE順式作用元件上[2-3]。在擬南芥中，DREB轉(zhuǎn)錄因子可分為DREB1/CBF和DREB2兩類，目前對(duì)DREB1/CBF類成員的功能研究比較透徹，主要與低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)有光；而DREB2類成員則主要參與干旱、高鹽、高溫等脅迫應(yīng)答反應(yīng)[4-6]。在逆境脅迫條件下，DREB2轉(zhuǎn)錄因子被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，然后與下游抗逆性相關(guān)的功能基因的啟動(dòng)子的DRE元件特異結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)，提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性[1-2,6]。例如，過(guò)量表達(dá)At-DREB2A能夠提高擬南芥的抗旱性[7]；OsDREB2A和OsDREB2B的轉(zhuǎn)基因水稻和大豆增強(qiáng)了植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性[8-9]；在小麥和大麥中過(guò)表達(dá)TaDREB2基因能夠提高植株在干旱條件下的存活率[10]。在蘋果中，Mp-DREB2A和MdDREB2A都能夠受到多種逆境脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因材料的抗旱能力也不同程度提高[11-12]。

泰山海棠（Malus hupehensis）是我國(guó)特有的蘋果屬種質(zhì)資源，具有抗旱等優(yōu)良性狀。研究組前期以泰山海棠為材料，分析了干旱和非干旱條件下泰山海棠的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)干旱條件下MhDREB2A基因明顯受到誘導(dǎo)表達(dá)。采用RACE方法成功克隆了完整的MhDREB2A基因，并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得MhDREB2A轉(zhuǎn)基因煙草植株，并對(duì)干旱脅迫處理下植株的表型和生理指標(biāo)變化進(jìn)行鑒定，為選育蘋果屬植物抗旱資源提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試泰山海棠（Malus hupehensis）保存在山東省果樹研究所。供試ABA（分析純）購(gòu)于博奧拓達(dá)公司。

1.2 方法

2018年盆栽定植，對(duì)8a生盆栽苗外源噴施脫落酸（100μMol·L-1ABA），處理后0，1，2，6，12，24h分別采集樣品；干旱脅迫以盆栽土壤相對(duì)含水量為70%時(shí)為干旱處理起始點(diǎn)，處理后0，1，2，3，4，5d取樣。每個(gè)處理大于5株盆栽苗，所有處理均在玻璃溫室中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為16h（光照）/8h（黑暗）和（25±1）℃。所有的樣品采集后，放入液氮中迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存。

1.2.1MhDREB2A的克隆及序列分析取泰山海棠幼苗0.1g，利用Trizol的方法提取總RNA，參照大連寶生物（TaKaRa）的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）的說(shuō)明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)之前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的序列信息，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增MhDREB2A全長(zhǎng)CDS（表1）。利用寶生物的高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase（R045Q），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：98℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸15s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)預(yù)測(cè)的目的條帶的大小，切下相應(yīng)的條帶，連接到pEasy（北京全式金）克隆載體進(jìn)行測(cè)序。

從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載所有擬南芥的AP2蛋白序列，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載AtDREB1A（ABD42992.1）、AtDREB2A（AED90871.1）、MdDREB2A（XP_008354169.1）、MpDREB2A（MG488272）、FvDREB2A（XP_004307690.1）、PbDREB2A（XP_009345422.1）、Pp-DREB2A（XP_020413813.1）和VvDREB2A（XP_002273838.1），使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.2 基因表達(dá)分析在8a生的泰山海棠樹上分別取根、莖、葉、花（盛花期）和果實(shí)（花后60d），將樣品放入液氮中速凍，然后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA后，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行組織表達(dá)分析。內(nèi)參基因選用MdActin[13]。煙草轉(zhuǎn)基因和野生型植株提取RNA和反轉(zhuǎn)錄方法同上，內(nèi)參基因選用NtActin[14]。

熒光定量分析參照ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix（Q711，Vazyme，南京）的說(shuō)明書，反應(yīng)體積為20μL：SYBR qPCR Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)條件為：95℃30s,95℃10s，60℃20s，40次循環(huán)。并采用2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[15]。試驗(yàn)設(shè)至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。引物序列見表1。

表1 供試引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 亞細(xì)胞定位將MhDREB2A的CDS序列（去掉終止密碼子）構(gòu)建到pRI101-eGFP載體上，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105，挑選陽(yáng)性克隆搖菌。將農(nóng)桿菌溶液注射到本氏煙的葉片中，放置2～3d后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光定位情況。

1.2.4 MhDREB2A過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建和煙草的轉(zhuǎn)化將MhDREB2A的CDS序列構(gòu)建到植物過(guò)量表達(dá)載體pRI101上，得到35S::MhDREB2A過(guò)量表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒通過(guò)冷凍法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。采用葉盤法[16]，將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草葉片中，經(jīng)過(guò)共生培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)后將抗性芽轉(zhuǎn)入1/2培養(yǎng)基中繼代、生根，獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株，移栽后，單株收種，選取T3代植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MhDREB進(jìn)化樹及序列比對(duì)分析

從NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥全部AP2蛋白序列，利用MEGA 6.0軟件，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明本研究中克隆得到的泰山海棠DREB屬于DREB2亞家族，與DREB2A親緣關(guān)系最近，因此將此基因命名為MhDREB2A（圖1A）。

將不同物種中的DREB2蛋白序列從NCBI中下載下來(lái)，包含擬南芥（AtDREB2A，AED90871.1），蘋果（Md-DREB2A，XP_008354169.1）、海棠（MpDREB2A，MG488272），草莓（FvDREB2A，XP_004307690.1）、白梨（Pb-DREB2A，XP_009345422.1）、桃（PpDREB2A，XP_020413813.1）和葡萄（VvDREB2A，XP_002273838.1）。利用DNAman軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果表明泰山海棠MhDREB2A和其他物種的DREB2A蛋白在N端有保守性的AP2結(jié)構(gòu)域（圖1B）。

2.2 MhDREB2A基因的表達(dá)分析

由圖2a和2b可知，干旱和100μMol·L-1ABA處理均可不同程度地誘導(dǎo)MhDREB2A基因的表達(dá)。Mh-DREB2A基因的表達(dá)量在干旱處理后3 d達(dá)到最高值（12.3倍），然后下降；100μMol·L-1ABA處理后，MhDREB2A基因的表達(dá)量在2h時(shí)達(dá)到最高值（15.8倍），6h降至最低；表明MhDREB2A可能在蘋果應(yīng)對(duì)干旱脅迫中起著重要作用。

進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)MhDREB2A在泰山海棠根、莖、葉、花（盛花期）和果實(shí)（花后60d）的相對(duì)表達(dá)水平。由圖2c可知，MhDREB2A在泰山海棠不同組織中均有表達(dá)，其中在花中的表達(dá)量最高，在葉中表達(dá)最低。

圖2 MhDREB2A的在泰山海棠中的表達(dá)水平分析Figure 2 Analysis in expression level of MhDREB2A in Malus hupehensis

2.3 MhDREB2A的亞細(xì)胞定位分析

將含有MhDREB2A基因的農(nóng)桿菌注射到本氏煙葉片中，利用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉肉細(xì)胞中的熒光信號(hào)分布，發(fā)現(xiàn)綠色熒光（GFP）標(biāo)記的MhDREB2A蛋白集中分布于細(xì)胞核上（圖3）。

圖3 MhDREB2A的亞細(xì)胞定位分析Figure 3 Subcellular localization of MhDREB2A

2.4 MhDREB2A轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性分析

為了快速驗(yàn)證MhDREB2A基因在植物抗旱中的作用，在煙草中過(guò)量表達(dá)MhDREB2A基因，qRT-PCR結(jié)果表明在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（L1、L2和L3）中MhDREB2A基因表達(dá)量均明顯高于對(duì)照（圖4a）。對(duì)生長(zhǎng)了35d的煙草植株進(jìn)行干旱處理，觀察其表型變化，結(jié)果表明，野生型煙草早于轉(zhuǎn)基因株系出現(xiàn)葉片萎蔫和變黃的現(xiàn)象（圖4b）。在對(duì)照組中，轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株中葉綠素總含量、電導(dǎo)率（EL）和丙二醛（MDA）均沒(méi)有顯著差別；而在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因株系中的葉綠素總含量明顯高于野生型植株，電導(dǎo)率（EL）和丙二醛（MDA）則明顯低于野生型植株（圖4c～圖4f）。

圖4 MhDREB2A轉(zhuǎn)基因煙草干旱處理表型及葉綠素含量、電導(dǎo)率和丙二醛含量分析Figure 4 Phenotype of the transgenic tobaco with MhDREB2A and analysis on Chl,electrolyte leakages and MDA contents

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草逆境相關(guān)基因的表達(dá)分析Figure 5 Expression analysis of resistance-related genes in transgenic tobacco

為了進(jìn)一步揭示MhDREB2A基因提高植物抗旱性的機(jī)制，檢測(cè)了脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。由圖5可知，正常條件下逆境相關(guān)基因NtDREB3、NtERD10C、NtERD10D、NtNCED1和NtLEA5在轉(zhuǎn)基因煙草和野生型中表達(dá)量沒(méi)有差異；在干旱處理下，NtDREB3、NtERD10C、NtERD10D、NtNCED1和NtLEA5的表達(dá)均有所增強(qiáng)，且轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)水平均顯著高于野生型植株。綜上可知，過(guò)量表達(dá)MhDREB2A能夠顯著提高植物的抗旱性。

3 討論與結(jié)論

AP2/ERF家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含一個(gè)或者多個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，該家族廣泛參與調(diào)控植物干旱、高鹽或低溫、高溫等非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程[6]。本試驗(yàn)中對(duì)泰山海棠MhDREB2A在干旱脅迫方面的作用進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)泰山海棠DREB和擬南芥AP2/ERF蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)該泰山海棠DREB蛋白屬于DREB2亞家族，與AtDREB2A親緣關(guān)系最近，因此將此基因命名為MhDREB2A。隨后進(jìn)一步對(duì)MhDREB2A序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)MhDREB2A蛋白包含1個(gè)非常保守的AP2結(jié)構(gòu)域，起始于第79個(gè)氨基酸，結(jié)束于第130個(gè)氨基酸，屬于AP2類家族成員。

在無(wú)任何處理?xiàng)l件下，擬南芥DREB2A基因在根、莖、葉都有表達(dá)[17]，在本研究中，采用RT-PCR檢測(cè)Mh-DREB2A在根、莖、葉、花、果的表達(dá)情況，結(jié)果表明蘋果MhDREB2A基因主要在花和根中表達(dá)，這種表達(dá)的差異可能與草本和木本植物中DREB2A基因參與了不同組織抗性有關(guān)。不同物種的大多數(shù)DREB2基因都能夠響應(yīng)干旱、高鹽和高溫等脅迫，少數(shù)DREB2對(duì)低溫和ABA有響應(yīng)，并且不同物種以及在不同組織部位對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)是不一樣。例如，OsDREB2A基因的表達(dá)均受干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)；AtDREB2正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)較弱，但受干旱、極端溫度或高鹽的誘導(dǎo)[6]。本研究干旱脅迫處理時(shí)，MhDREB2A的表達(dá)量在處理后3d時(shí)達(dá)到峰值，同時(shí)其表達(dá)量還受ABA的誘導(dǎo)，暗示了MhDREB2A基因在蘋果響應(yīng)干旱脅迫起著重要作用。一般而言，轉(zhuǎn)錄因子大多數(shù)定位于細(xì)胞核中，在本研究中亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示MhDREB2A定位于細(xì)胞核中，但Mh-DREB2A發(fā)揮功能的機(jī)制目前還不清楚，可能與其他蛋白或者直接調(diào)控下游基因響應(yīng)干旱脅迫，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

多數(shù)報(bào)道顯示，DREB2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)生物和非生物脅迫具有正向調(diào)控作用。由于泰山海棠遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，所以本研究中將MhDREB2A轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)以探索其功能。當(dāng)干旱脅迫條件下野生型植株葉片萎蔫變黃時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系仍處于相對(duì)較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。電導(dǎo)率和丙二醛是研究植物抗性的關(guān)鍵指標(biāo)，反應(yīng)植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度及膜受損程度，植株丙二醛含量較低，表明膜脂受損較輕，具有較強(qiáng)的抗性[18-19]。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下的電導(dǎo)率和丙二醛含量均低于野生型（對(duì)照），表明其細(xì)胞膜的受損程度較低，其抗旱性相應(yīng)提高。另外，NtDREB3、NtERD10C、NtERD10D、NtNCED1和NtLEA5均是逆境脅迫相關(guān)基因，與植物細(xì)胞的耐逆性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理?xiàng)l件下這些抗逆相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量高于野生型，暗示MhDREB2A可能正調(diào)控這些基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)干旱脅迫，但對(duì)于MhDREB2A能否直接調(diào)控這些表達(dá)，還有待通過(guò)遺傳學(xué)及分子生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

ABA最重要的功能是作為信號(hào)分子激發(fā)一系列調(diào)節(jié)機(jī)制，提高植物在干旱、高溫、低溫、高鹽、重金屬等脅迫下的耐受力，因此又被稱為應(yīng)激激素或脅迫激素。低濃度ABA能夠增強(qiáng)水稻、馬鈴薯、番茄等作物對(duì)低溫、干旱、高鹽等逆境的耐受力。逆境脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)大量積累ABA，進(jìn)而增強(qiáng)植物體對(duì)逆境脅迫的抵抗能力。蘋果矮化基因MbDREB1可以通過(guò)依賴ABA和不依賴ABA的途徑以增強(qiáng)對(duì)低溫、干旱和鹽脅迫的耐受性[20]。

綜上所述，MhDREB2A基因過(guò)量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱脅迫的抗性，為干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中的正調(diào)控因子，可以作為蘋果抗旱育種的候選基因。