卵巢切除對高胰島素血癥MKR小鼠糖脂代謝的影響

姚 慶,王 丹,王小雙,吳英杰,冉麗媛

（1.大連醫(yī)科大學重大疾病基因工程模式動物研究所，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學 科技部基因工程模式動物國際聯(lián)合研究中心，遼寧 大連 116044）

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和生活水平提高，糖尿病、肥胖和脂肪肝等與糖脂代謝紊亂相關的疾病患病率逐年升高，2018年中國糖尿病患病率約12.4%，其中成人糖尿病前期比例占35.2%［1-3］。研究［4-6］顯示：性激素（如男性睪酮和女性雌二醇等）與機體糖脂代謝密切相關。卵巢具有分泌性激素，維持激素穩(wěn)態(tài)的重要功能，女性進入更年期后，卵巢功能逐漸退化，性激素產(chǎn)生減少，對體內(nèi)糖脂代謝穩(wěn)定造成影響，增加了絕經(jīng)后女性產(chǎn)生胰島素抵抗和罹患代謝綜合征的風險［7-9］。此外，患有糖尿病等基礎疾病或僅出現(xiàn)胰島素抵抗等亞健康的女性群體，在進入絕經(jīng)期后，雌激素水平的紊亂和缺乏可能成為威脅女性健康的重要因素［8-9］。因此，在多種病理生理條件下探討雌激素缺乏對機體糖脂代謝的影響，對于闡明雌激素相關代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的機制及篩選藥物干預靶點具有重要意義。

骨骼肌特異性胰島素樣生長因子1受體功能缺失 （loss of skeletal muscle-specific insulin-like growth factor-1 receptor function，MKR）小鼠是在骨骼肌中過表達人源胰島素樣生長因子1受體突變體而構建的2型糖尿病動物模型［10］。KIM等［11］發(fā)現(xiàn)：純合雄性MKR小鼠自出生起就產(chǎn)生嚴重的胰島素抵抗，8周齡時血液中葡萄糖水平達到糖尿病標準，同時表現(xiàn)高胰島素血癥、高血糖癥和高脂血癥；而雌性MKR小鼠在性成熟后，空腹血糖水平較低，僅表現(xiàn)出胰島素抵抗和高胰島素血癥。

既往研究［12-13］常采用卵巢切除方法探究雌激素對機體代謝功能的影響，但其通過高糖高脂飲食誘導小鼠肥胖和胰島素抵抗并結合卵巢切除的方法，無法排除外源糖脂水平對結果的影響。雌性MKR小鼠是非肥胖人源化胰島素抵抗小鼠模型，排除肥胖自身產(chǎn)生的影響，本研究通過對其進行卵巢切除術干預，探究高內(nèi)源胰島素水平下卵巢切除對機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的影響，為女性患者因雌激素缺失而導致代謝綜合征的臨床診斷及預防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器MKR小鼠（FVB/N）由美國西奈山醫(yī)學院Derek LeRoith教授饋贈，野生型（WT）FVB/N小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，6周齡SPF級MKR和WT FVB/N雌性小鼠各20只，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2013-0006。小鼠飼養(yǎng)于大連醫(yī)科大學SPF動物實驗中心屏障內(nèi)IVC系統(tǒng)，溫度22.5℃，12 h明暗交替，相對濕度50%～60%，自由進食和飲水。所有動物實驗流程均在大連醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會指導下進行（倫理審批號IACUC：AEE17065），實驗遵循3R原則。胰島素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），葡萄糖（美國Sigma公司），血糖試紙（瑞士Roche公司），HE染色試劑盒和糖原染色試劑盒（上海碧云天生物技術公司），油紅O染色試劑盒（上海歌凡生物科技公司），RNAiso Plus試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試 劑 盒（日 本TaKaRa公司），RT-qPCR引物（上海生工生物工程公司），激素敏感脂肪酶（hormone senitive lipase，HSL）和GAPDH抗體（中國Abbkine公司）。血糖儀（瑞士Roche公司），離心機（德國Eppendorf公司），高壓滅菌器（日本TOMY公司），超純水儀（美國Millipore公司），RT-qPCR儀（美國ABI公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗分組和小鼠卵巢切除模型建立6周齡雌性MKR小鼠20只隨機分為MKR假手術組（MKR組）和MKR卵巢切除組（MKR OVX組），每組10只；6周齡雌性WT FVB/N小鼠20只隨機分為WT假手術組（WT組）和WT卵巢切除組（WT OVX組），每組10只?；謴惋曫B(yǎng)2周后檢測各組小鼠體質量、空腹血糖和隨機血糖等指標。

WT OVX組 和MKR OVX組 小 鼠 采 用35 mg·kg－1戊巴比妥鈉麻醉，置于解剖墊上，酒精消毒暴露皮膚，于背部脊柱左側緣用眼科剪側切一個小的切口，輕柔撥開組織，結扎卵巢動脈，摘取卵巢后將其他組織回納，縫合切口。WT組和MKR組小鼠在麻醉打開切口后不做任何處理，縫合切口，恢復飼養(yǎng)。

1.3 葡萄糖耐量試驗（glucose tolerance test，GTT）檢測各組小鼠葡萄糖耐受能力術后6和12周，小鼠禁食不禁水，空腹12 h后檢測各組小鼠體質量及空腹血糖水平，根據(jù)小鼠體質量給予20%葡 萄 糖 溶 液（2 g·kg－1）腹腔注射，并開始計時。于注射后30、60、90和120 min分別檢測各組小鼠血糖水平，根據(jù)不同測量時間的血糖變化繪制曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC），檢測各組小鼠葡萄糖耐受力。GTT實驗完成后恢復小鼠飲食。

1.4 胰島素耐量試驗（insulin tolerance test，ITT）檢測各組小鼠胰島素敏感性術后6和12周，小鼠禁食不禁水，空腹4～6 h后檢測各組小鼠體質量及空腹血糖水平，0.75 U·kg－1胰島素溶液腹腔注射，并開始計時。于注射胰島素后15、30、45和60 min檢測各組小鼠血糖水平，根據(jù)不同測量時間的血糖變化繪制曲線并計算AUC，檢測各組小鼠胰島素敏感性。ITT實驗完成后恢復小鼠飲食。

1.5 計算各組小鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)稱取小鼠體質量、解剖后小鼠肝臟和脂肪濕質量，計算各組小鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)。肝臟系數(shù)=肝臟質量/體質量×100%，脂肪系數(shù)=脂肪質量/體質量×100%。

1.6 病理學染色觀察各組小鼠肝臟和性腺脂肪組織病理形態(tài)表現(xiàn)組織固定于10%甲醛溶液，48 h后取出部分固定組織，修剪后置于組織包埋盒中脫水、包埋。石蠟切片機切片，HE染色或糖原染色后，顯微鏡下觀察并拍照。取部分固定的肝臟組織，修剪后置于30%蔗糖中脫水24 h，置入冷凍包埋劑中，液氮緩凍。采用冰凍切片機于－16℃下切片，油紅O染色后顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 RT-qPCR法檢測各組小鼠性腺脂肪組織中脂質分解相關基因mRNA表達水平性腺脂肪組織剪碎后加入TRIzol試劑提取總RNA，采用反轉錄試劑盒獲取cDNA后將其作為模板進行RT-qPCR反應。PCR反應體系和反應條件依據(jù)試劑盒說明書。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct法計算脂質分解相關基因mRNA表達水平。PCR引物序列：脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triacylglyceride lipase，Atgl），正 向 引 物5′-GCTGTGGAATGAGGACATAGGA-3′，反 向 引 物5′-GCATAGTGAGTGGCTGGTGAA-3′；HSL正 向 引 物5′-TGTGTCAGTGCCTATTCAG-3′，反 向 引 物5′-GAACAGCGAAGTGTCTCT-3′；GAPDH，正 向 引 物5′-GGGCTGGCATTGCTCTCAATG-3′，反 向 引 物5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3′。

1.8 Western blotting法檢測各組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平取性腺脂肪組織剪碎加入蛋白裂解液裂解，勻漿后離心提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整上樣量使各組濃度一致，SDS-PAGE電泳后濕轉，將蛋白全部轉移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉后加入蛋白一抗（GAPDH或HSL）4℃孵育過夜，TBST漂洗后室溫孵育二抗2 h，TBST漂洗后ECL試劑顯色并拍照。采用Image J軟件分析目的蛋白HSL和內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析采用Graphpad prism8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠的體質量、血糖水平、肝臟質量、肝臟系數(shù)和和脂肪系數(shù)，性腺脂肪組織中Atgl、HSL mRNA及HSL蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量和血糖水平術后小鼠體質量檢測結果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠體質量增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），MKR組小鼠體質量明顯降低（P＜0.05）；與MKR組比較，MKR OVX組小鼠體 質 量 明 顯 增加（P＜0.05），但 與WT和WT OVX組比較，MKR OVX組小鼠體質量明顯降低（P＜0.05）。術后空腹血糖監(jiān)測結果顯示：OVX術后6周，各組小鼠空腹血糖無明顯變化；術后12周，WT OVX組和MKR OVX組小鼠空腹血糖水平逐漸升高，與MKR組比較，MKR OVX組小鼠空腹血糖水平明顯升高（P＜0.05）。術后隨機血糖監(jiān)測結果顯示：與WT和WT OVX組比較，MKR OVX組小鼠隨機血糖水平升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠的體質量（A）、空腹血糖水平（B）和隨機血糖水平（C）Fig.1 Body weights(A),levels of fasting blood glucose(B)and levels of random blood glucose(C)of mice in various groups

2.2 各組小鼠葡萄糖耐受力和胰島素敏感性與WT組比較，WT OVX組小鼠葡萄糖耐受力和胰島素敏感性降低（P＜0.05）；與WT組比較，MKR組小鼠本身存在胰島素抵抗，其葡萄糖耐受力和胰島素敏感性均明顯降低（P＜0.05）。與MKR比較，MKR OVX組葡萄糖耐受力和胰島素敏感性降低（P＜0.05），并隨術后飼養(yǎng)時間延長不斷惡化，術后12周出現(xiàn)嚴重的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗。見圖2和3。

圖2 各組小鼠葡萄糖耐受力指標Fig.2 Indicators of glucose tolerance of mice in various groups

圖3 各組小鼠胰島素敏感性指標Fig.3 Indicators of insulin sensitivity of mice in various groups

2.3 各組小鼠肝臟質量、肝臟系數(shù)和肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)各組小鼠肝臟濕質量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與WT組 和WT OVX組 比 較，MKR和MKR OVX組小鼠肝系數(shù)明顯升高（P＜0.05），見表1。HE染色結果顯示：與WT組小鼠比較，WT OVX組小鼠肝組織中肝細胞排列松散，部分區(qū)域出現(xiàn)輕度脂肪變性；MKR組小鼠肝臟有輕度脂質沉積；MKR OVX組小鼠肝組織中肝脂肪變程度較高，有明顯的脂滴空泡。油紅O染色與HE染色結果一致，與WT組比較，WT OVX和MKR OVX組小鼠肝組織中有更多的脂質成分著色。糖原染色結果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠肝糖原減少，MKR組小鼠肝糖原無明顯變化，MKR OVX組小鼠肝糖原進一步減少。見圖4。

圖4 各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)（×200）Fig.4 Pathomorphology of liver tissue of mice in various groups（×200）

2.4 各組小鼠脂肪系數(shù)和性腺脂肪組織病理形態(tài)表現(xiàn)與WT組比較，WT OVX組小鼠棕色脂肪、皮下脂肪和腎周脂肪系數(shù)升高但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），性腺脂肪和腸系膜脂肪系數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與MKR組比較，MKR OVX組小鼠棕色脂肪和腸系膜脂肪系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），皮下脂肪、性腺脂肪和腎周脂肪系數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肝臟質量、肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)Tab.1 Liver weight,liver index and fat index of mice in various groups （n=10,x±s,η/%）

選擇WT OVX組和MKR OVX組病理形態(tài)表現(xiàn)均有明顯改變的性腺脂肪觀察其形態(tài)表現(xiàn)。HE染色結果顯示：與WT組比較，MKR組小鼠脂肪細胞明顯縮小；WT OVX組和MKR OVX組小鼠脂肪細胞均增大，但與WT和WT OVX組比較，MKR OVX組小鼠脂肪細胞仍明顯縮小。見圖5。

圖5 各組小鼠性腺脂肪組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×200）Fig.5 Pathomorphology of gonadal adipose tissue of mice in various groups（HE,×200）

2.5 各組小鼠性腺脂肪組織中Atgl和HSL mRNA表達水平RT-qPCR檢測結果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠性腺脂肪組織中Atgl mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05），MKR組小鼠性腺脂肪組織中HSL mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與MKR組比較，MKR OVX組小鼠性腺脂肪組織中Atgl和HSL mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組小鼠性腺脂肪組織中Atgl和HSL mRNA表達水平Fig.6 Expression levels of Atgl and HSL mRNA in gonadal adipose tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平Western blotting檢測結果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達 水平明顯降低（P＜0.05），MKR組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與MKR組比較，MKR OVX組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expression of HSL protein in gonadal adipose tissue of mice in various groups

3 討 論

雌激素作為重要的內(nèi)分泌激素廣泛作用于全身靶器官，不僅調(diào)控性腺發(fā)育和生殖系統(tǒng)功能，同時還在機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［14-15］。胰島素是調(diào)節(jié)機體代謝過程的重要激素之一，是唯一可以促進細胞對葡萄糖的攝取和利用，并通過促進糖原合成抑制糖異生而降低血糖的激素；同時胰島素還可以促進脂質合成，抑制脂肪分解。外周器官（如肝臟、脂肪和肌肉組織等）對胰島素響應減弱則導致胰島素抵抗發(fā)生，是促使2型糖尿病、肥胖和非酒精性脂肪肝等疾病發(fā)生的重要危險因素［16］。而雌激素信號通路和胰島素信號通路在絕經(jīng)后女性糖脂代謝紊亂調(diào)控及相關疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關聯(lián)影響尚未完全闡明。

雌激素治療可逆轉高脂飲食誘導的小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良［17］。MKR雌性小鼠自身存在胰島素抵抗和高胰島素血癥，是研究雌激素和內(nèi)源胰島素水平調(diào)控機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的理想模型［13］。本研究結果顯示：MKR小鼠卵巢切除后，空腹血糖和隨機血糖水平均明顯升高，胰島素敏感性降低，而卵巢切除對WT小鼠血糖水平影響較小，其胰島素敏感性略有降低，提示在胰島素抵抗狀態(tài)下，雌激素缺失更易導致糖尿病的發(fā)生。

肝臟和脂肪組織在機體胰島素敏感性和糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究［18］顯示：絕經(jīng)后女性更易患脂肪肝。雌激素抑制劑他莫西芬可誘導小鼠肝脂肪變性，而臨床上使用他莫西芬的主要副作用之一為患者產(chǎn)生非酒精性脂肪肝［19］。此外，長期服用雌二醇可降低ob/ob小鼠肝臟脂質合成并改善胰島素敏感性［20］。本研究結果顯示：卵巢切除后，小鼠肝臟脂質沉積增加，MKR OVX組小鼠肝臟中出現(xiàn)大量的脂滴空泡，肝糖原水平降低，表明雌激素缺失會加重高胰島素血癥小鼠的肝脂肪變性和肝糖轉運。

脂肪組織是人體重要的代謝器官，不僅是機體的能量倉庫，而且作為循環(huán)中多種激素（如生長激素和胰島素等）及代謝物（如葡萄糖等）的靶器官，在機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［21］。雌激素受體α在脂肪組織中表達并控制雌激素活性，當雌激素或雌激素受體α缺失時，會導致脂質水平升高、肥胖和胰島素抵抗［22］。卵巢切除或女性絕經(jīng)造成雌激素水平降低，均可導致體質量增加和脂肪積聚［23-24］，與本研究結果一致。研究［25-26］顯示：絕經(jīng)期女性脂肪組織分布發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為腹部脂肪積聚。本研究結果證實：卵巢切除可通過下調(diào)脂質分解相關基因mRNA和蛋白表達水平導致小鼠性腺脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪等腹部內(nèi)臟脂肪明顯增加。既往研究常采用高糖高脂飲食誘導小鼠胰島素抵抗并結合卵巢切除研究雌激素對糖脂代謝的影響，而MKR雌鼠是非肥胖人源化胰島素抵抗小鼠模型，利用MKR小鼠進行雌激素調(diào)控脂代謝的相關研究，排除肥胖本身對脂肪產(chǎn)生的影響，使結果更具參考性。

綜上所述，本研究利用胰島素抵抗和高胰島素血癥的MKR小鼠模型，進一步探究內(nèi)源性胰島素及雌激素在機體糖脂代謝過程中的相互影響，為女性患者因雌激素缺失而可能產(chǎn)生代謝綜合征的臨床診斷及預防提供依據(jù)。