當歸紅芪超濾物對X射線引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其機制

武兵兵,張愛平,趙信科,李應東,劉 凱,

（1.甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 中西醫(yī)結(jié)合臨床重點實驗中心，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000）

放射治療（簡稱放療），是通過輻射所產(chǎn)生的能量使細胞染色體損傷，致細胞停止生長，達到快速消滅癌細胞的一種治療疾病方式。盡管放療對于治療腫瘤效果顯著，但對周圍正常組織造成的輻射損傷不容忽視，尤其是胸腔縱膈腫瘤放療后常導致放射性心血管損傷。研究［1-2］表明：心血管內(nèi)皮細胞對放療輻射的敏感性高于心肌細胞，長期放療的輻射對心血管內(nèi)皮細胞的損傷可誘發(fā)其功能障礙，從而促進多種心血管疾病發(fā)生。目前其確切的發(fā)病機制尚未闡明，而相關中醫(yī)藥防治機理研究尤為薄弱。中醫(yī)學研究［3］顯示：輻射為外來“毒邪”范疇，氣虛血瘀為其致病的基本病機。當歸和紅芪是我國傳統(tǒng)的益氣活血類中藥，本課題組前期研究［4-5］表明：復方制劑當歸紅芪超濾物（ultrafiltration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix，UFE-AH）對X射線輻射損傷心肌細胞有較強的防護作用，但其對X射線輻射導致心血管內(nèi)皮細胞損傷作用及其機制的研究尚未見報道。因此，本研究建立X射線輻射人臍靜脈內(nèi)皮細胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷模型，探討UFE-AH對輻射損傷HUVECs的保護作用及機制，為甘肅道地藥材的開發(fā)和臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器HUVECs（上海富衡細胞庫）。UFE-AH由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心和甘肅省膜科學研究院聯(lián)合制備。內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（美國ScienCell公司），細胞凋亡檢測試劑盒（上海翊圣公司），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體、磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinosital-3 kinase，PI3K）抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體、磷酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗 體 和 兔抗人GAPDH抗體（美國Gene Tex公司），兔抗人B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、兔抗人Bcl-2相關X蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體和兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋 白 水 解 酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）抗體（杭州華安生物技術有限公司），HRP標記的山羊抗兔IgG（美國Immuno Way公司）。酶標儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），流式細胞儀（型號：FACSVerse）（美國BD公司），細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），投射電子顯微鏡（型號：HT7700）（日本HITACHI公司），X射線輻照儀（美國Faxitron公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)常規(guī)復蘇HUVECs，將其接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，采用含5%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和1%青-鏈霉素的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長融合至80%～90%時，進行傳代。

1.3 CCK-8法檢測X射線輻射后HUVECs的抑制率取對數(shù)生長期的HUVECs，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每組設6個復孔，培養(yǎng)24 h后給予0、2、4、6、8和10 Gy不同劑量X射線輻射，于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48和72 h后 向 每 孔 加 入10 μ L CCK-8試 劑，37℃孵育2 h。采用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度（A）值，計算細胞抑制率。細胞抑制率=（未輻射孔A值-輻射孔A值）/（未輻射孔A值-空白孔A值）。

1.4 CCK-8法檢測不同濃度UFE-AH作用后HUVECs的存活率取對數(shù)生長期HUVECs，以每孔2.5×103個細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，分別加入0、50、100、200、400、600、800和1 000 μg·L－1UFE-AH，每個濃度組設置6個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h。采用酶標儀于450 nm波長處測定A值，計算細胞存活率，確定本實驗UFE-AH的最佳干預劑量。細胞存活率=（加藥孔A值－空白孔A值）/（未加藥孔A值－空白孔A值）。

1.5 CCK-8法檢測各組細胞存活率實驗分為空白組、模型組（6 Gy X射線）、低劑量UFE-AH組（6 Gy X射 線+100 μg·L－1UFE-AH）、中 劑 量UFE-AH組（6 Gy X射線+200 μg·L－1UFE-AH）和 高劑量UFE-AH組（6 Gy X射線+400 μg·L－1UFE-AH）。以每孔5×103個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，空白組和模型組正常換液處理，藥物干預組分別給予100、200和400 μg·L－1UFE-AH干預24 h，除空白組外其余各組均給予6 Gy X射線輻射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后采用CCK-8法檢測各組細胞A值，計算細胞存活率，每組設6個復孔。細胞存活率=（加藥孔A值－空白孔A值）/（未加藥孔A值－空白孔A值）。

1.6 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率各組HUVECs干預后采用無EDTA胰酶消化，收集各組細胞及上清液，1 000 r·min－1離心5 min；采用1×Binding Buffer重懸細胞，使細胞密度約為1×106mL－1，各 組 加 入AnnexinV-FITC（5 μ L）和PI（5 μL），避光孵育15 min后上機，1 h內(nèi)采用流式細胞儀分析。細胞凋亡率=（早期細胞凋亡數(shù)+晚期細胞凋亡數(shù)）/細胞總數(shù)×100%。

1.7 透射電子顯微鏡下觀察各組細胞超微結(jié)構收集各組HUVECs，戊二醛4℃避光固定，過夜，鋨酸固定，再經(jīng)梯度乙醇及丙酮脫水，浸透，包埋，切片，采用鈾鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 Western blotting法檢測各組細胞中PI3K、Akt、p-Akt、VEGF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平取各組HUVECs，預冷PBS緩沖液洗滌2次，加入組織細胞裂解液，12 000 r·min－1離心15 min，吸取上清液，取少量上清采用BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，SDS-PAGE電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜和5%脫脂奶粉封閉后，TBST洗膜3次，每 次8 min。然 后 一 抗4℃孵 育 過 夜（GAPDH 1∶5 000稀 釋，PI3K、Bcl-2、Bax和caspase-3 1∶1 000稀釋，Akt、p-Akt和VEGF 1∶500稀釋），TBST洗膜3次，每次8 min。二抗室溫搖床孵育2 h、TBST洗膜3次，每次10 min。采用ECL化學發(fā)光法和凝膠成像儀進行曝光，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞抑制率，細胞存活率，細胞凋亡率，細胞中PI3K、Akt、p-Akt、VEGF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以-±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 X射線輻射后各組細胞抑制率采用0、2、4、6、8和10 Gy X射線輻射HUVECs后，CCK-8法檢測結(jié)果顯示：在輻射后24 h，各組HUVECs的細胞抑制率為負值；輻射后48和72 h，當輻射劑量大于2 Gy時，與0 Gy X射線組比較，各組HUVECs的細胞抑制率呈劑量依賴性增加，其中4、6、8和10 Gy均可抑制細胞生長（P＜0.05或P＜0.01），6、8和10 Gy抑制細胞生長作用更明顯（P＜0.01）。因此，可選擇6 Gy作為輻射造模劑量。見表1。

表1 CCK-8法檢測X射線輻射后各組HUVECs的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of HUVECs after irradiated with X-ray detected by CCK-8 assay (n=6，-±s，η/%）

表1 CCK-8法檢測X射線輻射后各組HUVECs的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of HUVECs after irradiated with X-ray detected by CCK-8 assay (n=6，-±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with 0 Gy X-ray group.

Group 0 Gy X-ray 2 Gy X-ray 4 Gy X-ray 6 Gy X-ray 8 Gy X-ray 10 Gy X-ray Inhibitory rate（t/h)24 0－7.64±6.60－15.23±4.49－11.05±5.55－8.06±4.31－16.73±6.97 48 0 9.20±3.69 13.42±3.85*21.40±3.78**23.17±2.76**28.76±2.93**72 0 17.43±7.33 30.52±3.40**35.64±3.59**35.27±5.79**46.72±8.47**

2.2 UFE-AH促進細胞增殖最佳干預劑量不同濃度UFE-AH干預HUVECs 24、48和72 h后，與0 μg·L－1UFE-AH組 比 較，100、200、400和600 μg·L－1UFE-AH組細胞存活率升高（P＜0.05或P＜0.01），100、200和400 μg·L－1UFE-AH組細胞存活率明顯升高（P＜0.01）。因此，本研究選 擇100、200和400 μg·L－1UFE-AH為 最 佳 干 預濃度，并在X射線輻射前干預24 h，輻射后干預48 h。見表2。

表2 不同濃度UFE-AH作用后各組細胞存活率Tab.2 Survival rates of cells in various groups after treated with different concentrations of UFE-AH(n=6，-±s，η/%）

表2 不同濃度UFE-AH作用后各組細胞存活率Tab.2 Survival rates of cells in various groups after treated with different concentrations of UFE-AH(n=6，-±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with 0 μg·L－1 UFE-AH group.

Group 0 μg·L－1 UFE-AH 50 μg·L－1 UFE-AH 100 μg·L－1 UFE-AH 200 μg·L－1UFE-AH 400 μg·L－1 UFE-AH 600 μg·L－1 UFE-AH 800 μg·L－1 UFE-AH 1 000 μg·L－1 UFE-AH Survival rate(t/h)24 100.00±0.00 111.91±15.79 131.00±16.90**164.20±16.38**145.59±15.65**128.77±10.54*124.41±12.27*112.64±10.30 48 100.00±0.00 104.87±8.81 131.71±5.84**146.14±7.80**132.12±9.19**124.60±6.78*117.84±6.34 103.35±5.71 72 100.00±0.00 119.94±4.74 146.81±5.94**152.69±3.68**129.86±3.08**123.88±5.06*112.15±3.86 80.63±3.57

2.3 各組細胞存活率CCK-8法檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組細胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，中和高劑量UFE-AH組細胞存活率明顯升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 CCK-8法檢測各組細胞存活率Fig.1 Survival rates of cells in various groups detected by CCK-8 assay

2.4 各組細胞凋亡率AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低、中和高劑量UFE-AH組細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組細胞超微結(jié)構空白組細胞呈長梭形，細胞膜完整，胞質(zhì)較均勻，細胞核呈長圓形，核膜清晰，核周隙未見增寬，線粒體呈卵圓形，未見明顯腫脹，基質(zhì)較均勻，嵴略模糊，少量變短，胞內(nèi)可見少量溶酶體。與空白組比較，模型組細胞重度腫脹，細胞膜多處破損，胞質(zhì)稀松且出現(xiàn)多個空泡區(qū)，細胞核呈輕度不規(guī)則形，線粒體數(shù)量明顯減少，呈輕度或中度腫脹，基質(zhì)變淺且不均，線粒體少部分嵴局部斷裂、變短，胞內(nèi)可見大量自噬溶酶體（autolysosomes，ASS）。與模型組比較，低劑量UFE-AH組細胞中度腫脹，胞內(nèi)可見較多細胞器空泡，線粒體數(shù)量減少，部分出現(xiàn)輕度腫脹，嵴模糊，胞內(nèi)可見一定量ASS；中劑量UFE-AH組細胞輕微腫脹，線粒體數(shù)量較多，無明顯腫脹，基質(zhì)均勻，嵴排列較整齊，胞內(nèi)可見一定量ASS；高劑量UFE-AH組細胞輕微腫脹，胞內(nèi)局部可見細胞器空泡，線粒體輕微腫脹，基質(zhì)密度較均勻，嵴結(jié)構清晰，少量斷裂，胞內(nèi)可見一定量ASS。見圖3。

圖3 各組HUVECs超微結(jié)構(×7 000)Fig.3 Ultrastructures of HUVECs in various groups（×7 000）

2.6 各組細胞中PI3K、Akt、p-Akt、VEGF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平與空白組比較，模型組細胞中PI3K、p-Akt、Bcl-2和VEGF蛋 白 表 達 水 平 明 顯 降 低（P＜0.01），Bax和caspase-3蛋白表達水平及Bax/Bcl-2比值明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中和高劑量UFE-AH組細胞中PI3K、p-Akt、Bcl-2和VEGF蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），Bax和caspase-3蛋白表達水平及Bax/Bcl-2比值明顯降低（P＜0.01）。見圖4～7。

圖4 各組細胞中凋亡相關蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of apoptosisrelated proteins in cells in various groups

3 討 論

血管內(nèi)皮細胞是位于血管內(nèi)壁的單層細胞，在維持血管完整性、調(diào)節(jié)血管張力和血管通透性等方面具有重要作用。輻射引起的血管內(nèi)皮細胞損傷是引發(fā)心血管疾病的病理基礎，其可誘導血管內(nèi)皮細胞炎癥、氧化應激、DNA損傷和自噬等發(fā)生，致使血管內(nèi)皮細胞啟動細胞凋亡途徑，誘發(fā)輻射性心血管疾?。?］。近年來，中醫(yī)藥在防護輻射損傷方面具有突出優(yōu)勢，本課題組前期制備的UFE-AH由紅芪和當歸通過超濾截留獲取，其組方來源于益氣補血名方當歸補血湯，采用紅芪取代黃芪而成。紅芪是甘肅道地藥材，與黃芪功效相似，具有補氣生津和利水消腫作用，當歸補血活血，二藥合用，共湊益氣生津、補血活血和利水消腫功效［7-8］。電離輻射引起的細胞凋亡是輻射引起細胞毒性的機制之一。有研究［9-10］表明：當歸多糖具有促進心肌細胞增殖和抑制細胞凋亡作用，當歸紅芪多糖通過抑制心肌細胞凋亡，防治輻射性心肌損傷。研究［11］顯示：黃芪多糖通過下調(diào)相關因子水平，對12C6+輻射人骨髓間充質(zhì)干細胞具有促增殖作用，黃芪甲苷通過減少輻射所致肺組織細胞凋亡，對輻射肺損傷起到一定的保護作用［12］。當前認為當歸紅芪及其活性成分具有抗輻射損傷作用，但關于UFE-AH防治輻射后血管內(nèi)皮細胞損傷目前尚未見相關報道。因此，本研究旨在探討UFE-AH對輻射后HUVECs防護作用并闡明其相關機制。

圖5 各組細胞中凋亡相關蛋白表達水平Fig.5 Expression levels of apoptosis-related proteins in cells in various groups

圖6 各組細胞中PI3K、Akt、p-Akt和VEGF蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of PI3K,Akt,p-Akt and VEGF proteins in cells in various groups

PI3K/Akt信號通路對細胞存活和增殖等方面至關重要，PI3K激活后，引起下游蛋白Akt活化為p-Akt，p-Akt可促進細胞生長和抑制細胞凋亡［13］。Bcl-2蛋白家族中相關蛋白在細胞凋亡的調(diào)控中起重要作用，其中Bcl-2是最重要的抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，caspase-3是Bcl-2家族通過線粒體途徑調(diào)控細胞凋亡的下游促凋亡蛋白［14-15］。在線粒體凋亡調(diào)控通路中，Bcl-2與Bax形成異源二聚體抑制Bax基因的表達，從而抑制細胞凋亡，當Bax形成Bax-Bax同源二聚體時會促進 細 胞 凋 亡［16］。X射 線 輻 射 通 過 上 調(diào)Bax和caspase-3蛋白表達，下調(diào)Bcl-2的表達誘導細胞凋亡［17-18］。當Akt磷酸化激活時，線粒體途徑的Bcl-2接著也被激活，進而啟動抗凋亡作用。研究［19］表明：UFE-AH通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達和下調(diào)caspase-3蛋白表達對X射線引起的H9C2心肌細胞凋亡具有保護作用。本研究結(jié)果顯示：X射線輻射后中和高 劑量UFE-AH組HUVECs中PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax和caspase-3蛋白表達水平降低，細胞凋亡率降低，促進HUVECs增殖。因此，UFE-AH對X射線引起的HUVECs細胞凋亡具有一定的改善作用。

圖7 各組細胞中PI3K、Akt、p-Akt和VEGF蛋白表達水平Fig.7 Expression levels of PI3K,Akt,p-Akt and VEGF proteins in cells in various groups

VEGF是一種糖基化有絲分裂原，特異性影響血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞生長、遷移和抑制其凋亡，介導血管通透性增加和誘導血管生成［20-21］。血管內(nèi)皮細胞通過自分泌產(chǎn)生的VEGF對其生存和血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關重要，并可抑制輻射誘導的細胞凋亡［22-23］。而PI3K和p-Akt蛋白激活可誘導VEGF表達［24-25］。本研究結(jié)果顯示：中和高劑量UFE-AH能 上 調(diào)VEGF蛋 白 表 達 水 平，提 示UFE-AH可能通過上調(diào)PI3K和p-Akt蛋白表達水平，誘導血管內(nèi)皮細胞自分泌VEGF進而促進HUVECs存活。

線粒體能夠產(chǎn)生能量，維持細胞正常功能，也能參與細胞凋亡和壞死［26］。血管內(nèi)皮細胞中的線粒體數(shù)量有限，且其數(shù)量或形態(tài)的改變都會影響線粒體功能。SCHILLING等［27］研究發(fā)現(xiàn)：細胞或組織暴露于高劑量X射線輻射后可導致線粒體功能障礙和線粒體數(shù)量減少。研究［28］表明：X射線可引起冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞線粒體數(shù)量持續(xù)減少及功能障礙，導致血管內(nèi)皮細胞凋亡。本研究電鏡結(jié)果顯示：X射線輻射后HUVECs線粒體損傷嚴重且數(shù)量減少，細胞質(zhì)中出現(xiàn)較多ASS，而中和高劑量的UFE-AH使線粒體腫脹減輕和數(shù)量增加，ASS減少，提示UFE-AH可改善線粒體損傷，同時可能通過調(diào)節(jié)自噬來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，達到抗輻射損傷作用，然而其確切機制需要進一步研究。

綜上所述，UFE-AH對X射線引起的血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，其機制可能是通過上調(diào)血管內(nèi)皮細胞中PI3K、p-Akt、VEGF和Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax和caspase-3蛋白表達，抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡，減輕受損血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構改變，發(fā)揮其抗輻射損傷的作用，本研究結(jié)果為X射線輻射防護劑的研發(fā)和臨床應用提供了新的方向。