黃芪甲苷對低氧誘導(dǎo)小鼠血管損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

王 玥,魯美麗,王洪新

（錦州醫(yī)科大學(xué) 遼寧省心腦血管藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001）

健康人在高海拔地區(qū)或其他低氧環(huán)境中會出現(xiàn)缺氧的狀況。人們對低氧的適應(yīng)能力存在差異，無法迅速適應(yīng)高海拔低氧可導(dǎo)致肺水腫、中風(fēng)和心血管功能障礙，甚至死亡［1-4］。因此，對于暴露于高海拔缺氧的正常人和患有心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及溶血性疾病的患者，缺氧是一種非常危險(xiǎn)的狀況。而內(nèi)皮功能障礙和炎癥在因缺氧導(dǎo)致血管損傷中發(fā)揮重要作用。目前針對適應(yīng)缺氧分子機(jī)制的研究尚不多見，對抗缺氧的策略尚未完全闡明。

骨膜蛋白（periostin，POSTN）是發(fā)現(xiàn)于小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1cDNA文庫中的特異性表達(dá)基因，該cDNA編碼由811個氨基酸組成，被指定為骨細(xì)胞特異性因子2（osteoblast-specific factor 2，OSF-2），后 更 名 為POSTN［5］。研 究［6］表 明：POSTN可增加上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinase，ERK）/血 管 內(nèi) 皮 生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號促進(jìn)血管生成。缺氧是刺激血管生成的因素之一，在缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓小鼠模型中，肺血管中POSTN表達(dá)增加，過表達(dá)POSTN使內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）和VEGF生成增加［7］。核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞中。研究［8］表明：間歇性缺氧可激活NF-κB。在顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨中POSTN可 誘 導(dǎo)NF-κB抑 制 因 子α（inhibitory subunit of NF-κB alpha，IκBα）磷 酸 化 及 其 降 解，導(dǎo)致p65核移位。因此推測POSTN/NF-κB可能參與了缺氧引起的血管損傷發(fā)病機(jī)制。

黃芪甲苷（astragalosideⅣ，ASⅣ）來源于黃芪，是黃芪的主要活性成分之一。ASⅣ具有多種藥理作用，具有保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗炎和抗衰老等功能，其對內(nèi)皮功能障礙的改善作用也逐漸被證實(shí)［9-12］，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究探討ASⅣ對低氧誘導(dǎo)小鼠血管損傷的保護(hù)作用，闡明其POSTN/NF-κB信號通路機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥物、主要試劑和儀器健康雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量25～35 g，4～6周齡，由錦州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物使用許可證號：SYXK（遼）2019-007。ASⅣ（純 度≥98.0%），購自南京景竹生物科技有限公司。去甲腎 上 腺 素 （phenylephrine，PE）和 乙 酰 膽 堿（acetylcholine，Ach）購 自 美 國Sigma-Aldrich公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，β-actin、POSTN、磷酸化NF-κB（phosphorylated NF-κB，p-NF-κB）p65一 抗、鼠抗兔二抗、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）一抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，NF-κB p65一抗購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。低溫高速離心機(jī)購自美國Thermo Fisher公司，DMT 720M離體微血管張力測定儀購自丹麥Myotechnology公司，凝膠成像儀和半干轉(zhuǎn)印儀購自美國Bio-Rad公司，Leica DMI 3000B倒置顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組和造模60只昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為對照組、低氧組、低劑量（40 mg·kg－1）ASⅣ組、中劑量（80 mg·kg－1）ASⅣ組和高劑量（120 mg·kg－1）ASⅣ組，每組12只。低氧組和各劑量ASⅣ組小鼠均于低氧艙（氧濃度10%）中飼養(yǎng)，連續(xù)4周。ASⅣ采用0.5%羧甲基纖維鈉稀釋至所需濃度，各劑量ASⅣ組小鼠于低氧第2天灌胃給予相應(yīng)劑量ASⅣ。其余各組小鼠給予相同容積的羧甲基纖維鈉灌胃，造模期間密切觀察小鼠的健康狀況。

1.3 各組小鼠一般狀況觀察觀察各組小鼠的飲食情況、皮膚狀況和是否死亡，若死亡及時取出小鼠并解剖，分析小鼠死因。

1.4 離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠血管張力按照參考文獻(xiàn)［13］中的方法，采用無菌20%烏拉坦溶于PBS緩沖液麻醉各組小鼠，無菌環(huán)境中取出胸主動脈并迅速置于PSS溶液中，持眼科剪將血管剪為2 mm左右長度。將準(zhǔn)備好的血管環(huán)固定于DMT浴槽內(nèi)張力傳感器上，檢測血管張力變化并記錄。浴槽內(nèi)添加10－5μmol·L－1PE，當(dāng)收縮達(dá)平臺時，依次累計(jì)添加不同濃度（10－5、10－6、10－7、10－8和10－9μmol·L－1）Ach建立劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算Ach最大舒張率，作為血管張力變化評估依據(jù)。

1.5 ELISA法檢測各組小鼠血清中白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平小鼠眼眶取血，3 600 r·min－1離心5 min，吸取上清，－80℃保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中IL-6和TNF-α水平。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測各組小鼠胸主動脈組織中POSTN陽性細(xì)胞率小鼠胸主動脈組織切片預(yù)熱約2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，抗原修復(fù)，3%過氧化氫室溫氧化15 min，PBS緩沖液漂洗3次，每次4 min，山羊血清常溫封閉10 min后滴加POSTN一抗（1∶100），冰箱4℃過夜，PBS緩沖液漂洗3次，每次4 min，滴加二抗（1∶200）于37℃水浴30 min，PBS緩沖液漂洗3次，每次4 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察胸主動脈組織中陽性染色區(qū)域，采用Image J軟件計(jì)算POSTN陽性細(xì)胞率。

1.7 Western blotting法檢測各組小鼠胸主動脈組織中POSTN、ICAM-1、VCAM-1和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平取約50 mg小鼠胸主動脈組織，加入RIPA+1%PMSF裂解液裂解，于冰上剪碎，超聲粉碎30 s，4℃離心機(jī)靜置30 min，12 000 r·min－1離心20 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，雜交轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1.5 h，分別加入ICAM-1（1∶800）、VCAM-1（1∶1 000）、POSTN（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶800）、NF-κB p65（1∶800）和β-actin抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL顯色液顯影，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠Ach最大舒張率，血清中IL-6和TNF-α水 平，胸 主 動 脈 組 織 中ICAM-1、VCAM-1、POSTN和p-NF-κB p65蛋 白 表 達(dá) 水 平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠Ach最大舒張率與對照組比較，低氧組小鼠Ach最大舒張率明顯降低（P＜0.01）；與低氧組比較，低劑量ASⅣ組小鼠Ach最大舒張率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量ASⅣ組小鼠Ach最大舒張率明顯升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠血管張力Fig.1 Vascular tension of mice in various groups

2.2 各組小鼠血清中IL-6和TNF-α水平與對照組比較，低氧組小鼠血清中IL-6和TNF-α水平明顯升高（P＜0.01）；與低氧組比較，低、中和高劑量ASⅣ組小鼠血清中IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠血清中IL-6和TNF-α水平Tab.1 Levels of IL-6 and TNF-α in serum of mice in various groups [n=6,±s，ρB/（ng·L－1）］

表1 各組小鼠血清中IL-6和TNF-α水平Tab.1 Levels of IL-6 and TNF-α in serum of mice in various groups [n=6,±s，ρB/（ng·L－1）］

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with hypoxia group.

Group Control Hypoxia ASⅣLow dose Medium dose High dose IL-6 155.55±3.37 342.86±6.17*287.15±6.61△180.17±5.10△△212.52±5.59△△TNF-α 106.23±1.17 242.04±6.75*210.48±5.96△142.91±1.27△△155.31±1.61△△

2.3 各組小鼠胸主動脈組織中POSTN陽性細(xì)胞率對照組小鼠胸主動脈組織中POSTN陽性細(xì)胞率極低；與對照組比較，低氧組小鼠胸主動脈組織中POSTN陽性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.01）；與低氧組比較，低劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中POSTN陽性細(xì)胞率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中POSTN陽性細(xì)胞率明顯降低（P＜0.01）。見圖2和3。

圖2 各組小鼠胸主動脈組織中POSTN表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)，×400)Fig.2 Expressions of POSTN in aorta tissue of mice in various groups(Immunohistochemistry,×400)

2.4 各組小鼠胸主動脈組織中POSTN蛋白表達(dá)水平與對照組比較，低氧組小鼠胸主動脈組織中POSTN蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與低氧組比較，低劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中POSTN蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中POSTN蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組小鼠胸主動脈組織中POSTN蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖(B)Fig.4 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of POSTN protein in aorta tissue of mice in various groups

2.5 各組小鼠胸主動脈組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平與對照組比較，低氧組小鼠胸主動脈組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與低氧組比較，低劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組小鼠胸主動脈組織中ICAM1和VCAM1蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖(B，C)Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B，C)of expressions of ICAM1 and VCAM1 proteins in aorta tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠胸主動脈組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平與對照組比較，低氧組小鼠胸主動脈組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與低氧組比較，低劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組小鼠胸主動脈組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖(B)Fig.6 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of p-NF-κB p65 protein in aorta tissue of mice in various groups

3 討 論

血管內(nèi)皮組織在維持心血管穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，可生成并分泌多種物質(zhì)，其中一氧化氮（nitricoxide，NO）用于調(diào)節(jié)血管張力和結(jié)構(gòu)。在缺氧刺激下，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）磷酸化改變引起的eNOS活性降低可導(dǎo)致NO生物利用度受損，使血管發(fā)生內(nèi)皮功能障礙［14-16］。本課題組近期研究［13，17］證實(shí)：ASⅣ對血管損傷有一定保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示：與低氧組比較，中和高劑量ASⅣ組小鼠Ach最大舒張率明顯升高，中和高劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平降低，提示ASⅣ對低氧誘導(dǎo)小鼠血管內(nèi)皮功能障礙有保護(hù)作用；同時，經(jīng)ASⅣ治療后，小鼠血清中IL-6和TNF-α水平明顯降低，表明ASⅣ具有潛在的抗炎作用。

圖3 各組小鼠胸主動脈組織中POSTN陽性細(xì)胞率Fig.3 Rates of POSTN positive cells in aorta tissue of mice in various groups

POSTN可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移時血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處組織定植后的生存和增殖［18］。POSTN由細(xì)胞黏附分子整合素αvβ3和αvβ5分泌并傳遞信號［19-20］。POSTN誘導(dǎo)血管生成，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞整合素信號通路上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，F(xiàn)LK-1/KDR）。VEGF和FLK-1/KDR也被證實(shí)參與實(shí)體腫瘤發(fā)展過程中血管生成的誘導(dǎo)［21］。血管內(nèi)皮通透性的改變發(fā)生在動物模型和人的肺動脈高壓發(fā)病的早期。研究［7］顯示：過表達(dá)POSTN影響內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成能力。在缺氧條件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞核中累積的POSTN導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，而胞質(zhì)中分泌的POSTN進(jìn)入肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary vascular smooth muscle cells，PASMCs）外間隙可能促進(jìn)PASMCs增殖和遷移進(jìn)而誘導(dǎo)血管重構(gòu)。最近研究［7，22］顯示：缺氧誘導(dǎo)的PAH模型大鼠發(fā)生缺氧應(yīng)激后，肺組織和分離PASMCs中POSTN表達(dá)水平升高，且重組POSTN升高了大鼠右心室成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracelluar regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和NF-κB磷 酸 化 水 平。本研究結(jié)果顯示：與低氧組比較，中和高劑量ASⅣ組小鼠胸主動脈組織中POSTN和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低，表明ASⅣ對低氧誘導(dǎo)血管損傷模型小鼠的保護(hù)作用與POSTN/NF-κB信號通路有關(guān)。本研究尚未證實(shí)POSTN與p-NF-κB p65之間的關(guān)系，這也是本研究的不足之處，后續(xù)會進(jìn)行更深一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，ASⅣ會改善低氧誘導(dǎo)的小鼠血管內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應(yīng)，其潛在分子機(jī)制可能與抑制POSTN/NF-κB信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果為ASⅣ在血管損傷等心血管疾病中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。