葛根素對(duì)肥胖小鼠血壓和主動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響

郭夢(mèng)婷，呂孝旺，王志瑋，周婷婷，馬 鑫

(江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

高血壓是全球死亡率升高的主要原因之一，有11.3億人患有高血壓[1]。隨著生活水平的提高，飲食條件的改善，肥胖問題已成為影響公共健康的重要因素。肥胖是引起高血壓的主要原因，大約75%的高血壓發(fā)病率與肥胖(定義為體重指數(shù) ≥ 30 kg/m2)直接相關(guān)[2-3]。肥胖患者伴隨著糖脂代謝紊亂，引發(fā)血管內(nèi)皮功能異常，有研究表明肥胖與收縮壓升高呈正相關(guān)[4-5]。因此，單純針對(duì)降低血壓或降脂的治療已不能適應(yīng)當(dāng)前的治療，必須尋求既能改善心血管又能改善代謝指標(biāo)的藥物[6]。葛根是一種常見的中藥材，具有抗心血管疾病、抗高血壓、抗炎、抗心律不齊等藥理學(xué)性質(zhì)[7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，葛根素(puerarin，Pue)在高血壓等心血管疾病治療中有突出作用[8-9]。吳昀等[10]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以通過內(nèi)皮依賴性和非依賴性腸系膜動(dòng)脈的舒張功能降壓。玉從容等[11]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可明顯降低高脂高糖飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠的血脂和血壓。最近的研究表明[12]，高脂飲食誘導(dǎo)的C57 BL/6J雄性小鼠由于脂肪的積累易于發(fā)展為嚴(yán)重肥胖，使其成為研究人類肥胖的理想模型，但對(duì)主動(dòng)脈在高脂飲食所誘導(dǎo)的肥胖小鼠所發(fā)揮的作用研究頗少，因而本研究擬探討葛根素是否通過保護(hù)主動(dòng)脈內(nèi)皮功能而降低高脂飲食所誘導(dǎo)肥胖小鼠的血壓，同時(shí)也為臨床提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)♂ C57 BL/6J小鼠(上海斯萊克公司提供)，飼養(yǎng)于江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(倫理號(hào)：JN.No20201230c0600601[371])，進(jìn)行12 h晝夜交替，小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，溫度在18～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與藥物生理鹽水購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)(貨號(hào)：H34023609)、葛根素購(gòu)自美國(guó)阿拉丁公司(貨號(hào)：P111270-5 g)、甘油三脂(TG)測(cè)定試劑盒、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所(貨號(hào)：A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1)、左旋硝精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME，貨號(hào)：N109211)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，貨號(hào)：A2661)、HC-067047購(gòu)自英國(guó)Tocris Bioscience公司(貨號(hào):SML0143)、甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技(貨號(hào)：C0009M)、Krebs溶液成分(mmol·L-1)：NaCl 119 、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1、60 mmol·L-1KCl溶液成分(mmol)：KCl 60、NaCl 63、NaHCO325、MgCl · 6H2O 1、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1。

1.3 儀器BP-2000大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(美國(guó)II TC生命科學(xué)儀器公司)、Wire myograph 620 M(丹麥DMT公司)、全功能微孔檢測(cè)儀Synergy H4(美國(guó)伯騰儀器有限公司)、血糖儀(中國(guó)魚躍生物科技公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 將C57 BL/6J小鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，以45%高脂飼料喂養(yǎng)小鼠20周構(gòu)建肥胖小鼠模型(diet-induced obesity，DIO)，普通飼料喂養(yǎng)小鼠作為對(duì)照組，期間每周定時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠體重，模型組小鼠體重漲幅超過對(duì)照組20%。尾套法監(jiān)測(cè)小鼠收縮壓、舒張壓變化情況，20周后模型組收縮壓升至110～115 mmHg范圍。模型組小鼠采取隨機(jī)分組，分為肥胖小鼠模型組(DIO)、模型組+葛根素低劑量組Pue(L) 20 mg·kg-1·d-1、模型組+葛根素中劑量組Pue (M) 40 mg·kg-1·d-1、模型組+葛根素高劑量組Pue(H) 80 mg·kg-1·d-1，每組各6只小鼠，連續(xù)8周腹腔注射葛根素，在實(shí)驗(yàn)期間每周記錄體重和血壓。

1.4.2原代內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng) 使用高濃度CO2將小鼠安樂死，打開胸腔，取出主動(dòng)脈組織于無(wú)菌PBS中，在無(wú)菌超凈臺(tái)中將主動(dòng)脈組織用剪刀剪碎后溶于含有胰酶(2 g·L-1)的PBS中，在37 ℃水浴震蕩30 min后離心1 200 r·min-1，5 min；之后用ECM(Endothelial Cell Medium)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀種于6孔板中，2 h后換液，此為第一代細(xì)胞，傳代后的第二代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3血清指標(biāo)檢測(cè) 給藥8周末將小鼠禁食過夜，采取眼眶靜脈取血。將血樣室溫靜置2 h后，4 ℃離心4 000 r·min-1，15 min。之后取上清，用試劑盒測(cè)定甘油三脂TG、總膽固醇TC、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C，按照試劑盒法進(jìn)行檢測(cè)，最后于酶標(biāo)儀上測(cè)定。

1.4.4血壓測(cè)定 使用II TC無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量小鼠血壓，先將恒溫箱設(shè)為34 ℃，預(yù)熱30 min后將小鼠放于小鼠固定同筒中固定，腹部朝下，尾巴穿過橡皮圈，適應(yīng)30 min后進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)3次的平均值作為小鼠的血壓值。給藥期間每周測(cè)量小鼠血壓。

1.4.5小鼠離體主動(dòng)脈環(huán)的制備與內(nèi)皮功能檢測(cè) 取雄性小鼠裝入可通CO2的泡沫塑料盒中，向其中通入CO2等待約1 min，待小鼠安樂死后，打開胸腔迅速取出主動(dòng)脈組織，于4 ℃氧飽和的Krebs溶液中，小心分離出主動(dòng)脈，剔除脂肪和結(jié)締組織，操作過程中避免牽拉；主動(dòng)脈制備成2～3 mm血管環(huán)，每只小鼠制備四個(gè)血管環(huán)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，血管環(huán)用2根金屬絲(40 μm)連于張力換能器上，浴槽中加入5 mL Krebs溶液溫度為(37±0.5) ℃，持續(xù)通入5% CO2+95% O2，pH 7.4)。調(diào)節(jié)血管環(huán)的初張力，并穩(wěn)定在 0 mN，平衡約 60 min，調(diào)至3 mN平衡約30 min，每15 min換液1次。待血管環(huán)穩(wěn)定后，用60 mmol·L-1KCl預(yù)收縮血管3次，待血管恢復(fù)血管活力后，向浴槽中加入Phe(1 μmol·L-1)刺激血管收縮，到達(dá)收縮平臺(tái)后累積給藥法依次加入ACh(1 nmol·L-1～10 μmol·L-1)，注意在加入下一劑量時(shí)必須等上一劑量反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期。觀察血管環(huán)對(duì) ACh的反應(yīng)性，計(jì)算ACh引起的血管舒張率，舒張率%=(最大收縮張力值-ACh給藥后張力值)/(最大收縮張力值-基礎(chǔ)張力值) 100%，血管舒張85%以上表明內(nèi)皮功能完好，此為內(nèi)皮完整組(+Endo)

1.4.6去內(nèi)皮主動(dòng)脈環(huán)的制備與內(nèi)皮功能檢測(cè) 取已剔除結(jié)締組織和脂肪的主動(dòng)脈環(huán)，將粗細(xì)適當(dāng)?shù)拇笫蠛毚┻M(jìn)血管環(huán)，并來(lái)回摩擦去除血管段中的內(nèi)皮層，待血管穩(wěn)定后，加入60 mmol·L-1KCl刺激血管3次，待刺激達(dá)到坪值后，加入Phe(1 μmol·L-1)預(yù)收縮血管，穩(wěn)定后加入梯度濃度ACh，舒張率低于10%視為內(nèi)皮去除完全，此為去內(nèi)皮組(-Endo)

1.4.7L-NAME和HC-067047對(duì)葛根素舒張小鼠主動(dòng)脈的測(cè)定 內(nèi)皮完整的主動(dòng)脈環(huán)經(jīng)內(nèi)皮功能檢測(cè)后，分別敷育一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑L-NAME(100 μmol·L-1)和TRPV4抑制劑HC-067047(1 μmol·L-1)，30 min。對(duì)照組不敷育L-NAME和HC-067047。eNOS 通路是促進(jìn)大血管舒張的重要通路，加入其抑制劑以揭示在抑制eNOS活性后各組的反應(yīng)性是否仍存在差異；已有研究證實(shí)葛根素為TRPV4激動(dòng)劑，TRPV4也是血管舒張的重要通路之一[13]。在浴槽中加入其抑制劑以揭示抑制TRPV4活性后血管舒張差異。待血管恢復(fù)活力后，加入Phe(1 μmol·L-1)刺激血管收縮，收縮穩(wěn)定后加入梯度濃度ACh，計(jì)算ACh引起的血管舒張率。

1.4.8細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn) 將2 d內(nèi)分離的DIO小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞分別孵育25、50、100 μmol·L-1葛根素24 h，隨后使用胰酶消化處理，將4萬(wàn)個(gè)細(xì)胞重懸至200 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基后接種到小室中，24孔板中加入500 μL ECM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，用PBS洗兩次，再用4% PFA(多聚甲醛)固定，用PBS去除殘留的PFA后，用1%結(jié)晶紫染色15 min，最后用PBS清洗3～5次后，擦掉上室殘留細(xì)胞，使用正置顯微鏡拍攝小室的多個(gè)視野，使用Image J統(tǒng)計(jì)遷移率差異。

Tab 1 Effects of puerarin on blood lipid of obese mice induced by high fat diet

1.4.9血糖檢測(cè) 于8周末將小鼠禁食過夜，更換墊料進(jìn)行籠底清潔，小鼠進(jìn)行正常飲水，分別采集小鼠尾尖血液于血糖試紙上，采用血糖儀測(cè)定血糖濃度。

1.4.10MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將可用于實(shí)驗(yàn)的DIO小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞種于96孔板中，大約每孔5 000個(gè)細(xì)胞左右，并孵育25、50、100 μmol·L-1葛根素24 h，然后與 MTT溶液(0.5 g·L-1)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱下共敷育 4 h，然后加入DMSO以溶解甲臜晶體最后于570 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果

2.1.1葛根素對(duì)DIO小鼠體質(zhì)量、血清中血脂、空腹血糖的影響 如Fig 1A所示，45%高脂飼料喂養(yǎng)小鼠后體重明顯增加，與Con組相比體型肥胖；而低、中、高劑量葛根素處理8周后可明顯降低小鼠體質(zhì)量增加的幅度(P<0.0001)。如Fig 1B所示，DIO組空腹血糖與Con組相比明顯增高(P<0.0001)，與DIO相比高劑量組空腹血糖明顯降低，(P<0.0001)。如Tab 1 所示，DIO組TG、TC、LDL-C的水平明顯高于對(duì)照組，HDL-C 則明顯低于其他各組，高劑量葛根素組可有效逆轉(zhuǎn)高脂飲食所引發(fā)的TG、TC、LDL-C水平的升高以及HDL-C的降低。

2.1.2葛根素對(duì)DIO小鼠血壓的影響 如Tab 2-4所示，DIO組血壓明顯高于對(duì)照組，低劑量組SBP(systolic blood pressure)、DBP(diastolic blood pressure)、MAP(mean arterial blood pressure)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，中、高劑量組可明顯降低DIO組的高血壓(P<0.01)。

Fig 1 Effects of puerarin on body weight (A) ,fasting *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs DIO

Tab 2 Effects of puerarin on systolic blood pressure of obese mice induced by high fat

Tab 3 Effects of puerarin on diastolic blood pressure of obese mice induced by high fat

Tab 4 Effects of puerarin on mean arterial blood pressure of obese mice induced by high fat

2.2 葛根素改善DIO小鼠主動(dòng)脈舒張功能血管張力結(jié)果如Fig 2A所示，與DIO組相比，葛根素組主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh引發(fā)的舒張明顯降低。如Fig 2B所示，在ACh累積濃度為1 μmol·L-1時(shí)，對(duì)照組血管舒張率在50%左右，而葛根素組舒張率可達(dá)80%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明高劑量葛根素干預(yù)可明顯增強(qiáng)DIO小鼠主動(dòng)脈對(duì)ACh的舒張作用，從而改善血管舒張功能。

2.3 葛根素可改善DIO小鼠主動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張去內(nèi)皮組血管舒張結(jié)果如Fig 3A所示，去內(nèi)皮組(-Endo)主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh引起的舒張作用與對(duì)照組(+Endo)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。內(nèi)皮完整組加入L-NAME處理后血管舒張結(jié)果如Fig 3B所示，L-NAME組主動(dòng)脈對(duì)ACh引起血管舒張程度低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。內(nèi)皮完整組加入HC-067047處理后血管舒張結(jié)果如Fig 3C所示，HC-067047組主動(dòng)脈與對(duì)照組相比，血管舒張明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 葛根素可改善肥胖小鼠內(nèi)皮增殖遷移能力MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)如Fig 4A所示，50 μmol·L-1葛根素組細(xì)胞活性明顯高于DIO模型組(P<0.01),100 μmol·L-1葛根素組也會(huì)顯著增加細(xì)胞增殖能力，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。DIO小鼠內(nèi)皮細(xì)胞Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 4B所示，與模型組比較，25 μmol·L-1葛根素組對(duì)細(xì)胞遷移率無(wú)影響，50、100 μmol·L-1葛根素組細(xì)胞遷移率明顯增加(P<0.01)。

Fig 2 Puerarin treatment improved aortic diastolic function of DIO miceRepresentative traces (A) and effects of ACh-induced vasodilation in aorticl rings (B) ,n=6,from three mice

Fig 3 Puerarin improved endothelium-dependent vasodilation of aortaEffects of ACh-induced relaxation in Phe(1 μmol·L-1) in aorta with endothelium (Endo+)or without endothelium(Endo-)(A).Effects of Pue-induced vasodilation in DIO mouse aorta of endothelium (Endo+) with or without L-NAME(100 μmol·L-1).(B) Effects of Pue-induced vasodilation in DIO mouse aorta of endothelium (Endo+) with or without HC-067047(1 μmol·L-1).(C) n=6,from three mice **P<0.01 vs DIO

Fig 4 Puerarin improved proliferation and migration of endothelial cell isolated from obese miceMAECs were cultured with Pue (25,50,100 μmol·L-1) for 24 h,and then the cell viability was detected by MTT assay.(A)MAECs were cultured with Pue (25,50,100 μmol·L-1) for 24 h,and then conducted the Transwell assay.Representative images of migration assays.(B-C) Scale bar,20 μm **P<0.01 vs DIO

3 討論

肥胖會(huì)引發(fā)血脂血糖代謝異常、高血壓、高血脂且導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能改變。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成成分，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移有助于維持血管壁內(nèi)皮的完整性和細(xì)胞骨架的形成，從而改善血管內(nèi)皮功能降低血壓[14]。主動(dòng)脈中內(nèi)皮依賴性舒張主要由NO介導(dǎo)。TRPV4 通道介導(dǎo)內(nèi)皮依賴性引起的血管舒張，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO，NO可以擴(kuò)散到內(nèi)皮細(xì)胞周圍組織和平滑肌細(xì)胞中，然后通過平滑肌細(xì)胞介導(dǎo)主動(dòng)脈血管舒張作用[15]。當(dāng)TRPV4 通道打開會(huì)引起細(xì)胞內(nèi) Ca2+水平升高，激活eNOS引起血管舒張，TRPV4-eNOS信號(hào)傳導(dǎo)在內(nèi)皮功能中具有重要作用。葛根素是從葛根中提取的異黃酮類物質(zhì)，在心腦血管疾病、糖尿病及高血壓等臨床疾病中廣泛應(yīng)用[16]。已報(bào)道的研究多聚焦于葛根素對(duì)高血壓大鼠降壓機(jī)制的研究，但對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的降壓機(jī)制鮮有報(bào)道[17]。DIO小鼠隨肥胖而血壓升高其模型特點(diǎn)與因肥胖而造成的高血壓人群更為接近。

本文研究發(fā)現(xiàn)葛根素治療會(huì)降低肥胖小鼠的血壓，主要通過改善主動(dòng)脈血管功能。細(xì)胞水平的增殖和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葛根素能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葛根素能夠改善DIO小鼠的血管張力受損，并且內(nèi)皮依賴性性的NO途徑和TRPV4通道的激活參與上述調(diào)節(jié)。綜上所述，本文的研究發(fā)現(xiàn)葛根素是能夠增強(qiáng)主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，降低肥胖小鼠的血壓。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探究葛根素治療肥胖相關(guān)疾病包括血壓升高提供了理論依據(jù)，極大地豐富了中藥成分葛根素的在肥胖相關(guān)疾病的機(jī)制研究，說(shuō)明中醫(yī)藥在臨床中發(fā)揮的重要作用，同時(shí)也為未來(lái)中醫(yī)藥在肥胖相關(guān)性高血壓的治療及預(yù)防提供了更多的實(shí)踐基礎(chǔ)和有豐富的參考價(jià)值。