液質(zhì)聯(lián)用法測定不同地域種植的“華墨香5號”黑米中花青苷和酚酸類化合物含量

楊澤南，張慶路，李凱凱，陳浩

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室，武漢430070

隨著生活水平的提升，人們對于主糧健康的作用愈加關(guān)注。黑米是一種重要的有色稻米，“黑米主食化”不僅會大大提高人類的營養(yǎng)健康水平，還將減輕對糧食需求的壓力，保障糧食安全；同時還能有效減輕糧食生產(chǎn)對資源和環(huán)境的不良影響，促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展［1］。近些年，我國科學(xué)家逐步培育出多種口感食味俱佳的黑米品種。黑米籽粒的成熟過程中，花青苷在果皮大量積累，故呈現(xiàn)紫黑色。黑米中最主要的花青苷是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷。果蠅喂飼試驗證明，黑米具有延長壽命的功效［2］。除了肉眼看得見的“健康”成分外，黑米還有許多看不見的“健康”成分，如酚酸類化合物，其和花青苷一樣都具有顯著的健康效益［3-4］。在黑米中含量最高的酚酸類化合物是原兒茶酸（protocatechuic acid），具有抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗癌、抗炎等的多種生理功能［5-7］。因此，酚酸類化合物含量的高低也是影響黑米健康效應(yīng)的重要因素。

現(xiàn)已有較多對黑米的農(nóng)藝性狀、食味品質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)的研究報道［8-9］。通常特定黑米品種僅在2～3鄰近地理位置種植，而難以在不同地域廣泛種植，因此，對于特定黑米品種在不同地理環(huán)境下的營養(yǎng)物質(zhì)的定量比較分析較少見。“華墨香5號”是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主選育的黑米新品系，其稻米食味感官評價優(yōu)良，直接蒸煮的黑米飯香潤、軟、彈、滑、甜，具有特殊香氣。本研究在國內(nèi)不同地域種植黑米品種“華墨香5 號”，對不同地域“華墨香5 號”的花青苷含量和酚酸類化合物進(jìn)行比較，探究地域差異對“華墨香5 號”花青苷和酚酸含量的影響，以期為其適宜的產(chǎn)業(yè)化種植提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為黑米品種“華墨香5 號”。試驗于2021 年夏季在湖北省武漢市（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)）、潛江市、襄陽市南漳縣、襄陽市高新區(qū)、荊門市東寶區(qū)、石首市高基廟鎮(zhèn)、監(jiān)利市紅城鄉(xiāng)、咸寧市赤壁市、黃岡市羅田縣、黃石市陽新縣，浙江省寧波市慈溪市，陜西省西安市、漢中市，海南省陵水縣14個地區(qū)進(jìn)行大田種植，開花30 d后取成熟穗，保存于-20 ℃。

1.2 樣品前處理方法

1）黑米粉的制備。將黑米穗脫粒后置于冷凍干燥機(jī)中充分凍干，礱谷機(jī)去殼后得到黑糙米，取10 g黑糙米置于全自動組織研磨儀中研磨（60 Hz，2 min），將得到的黑糙米米粉過孔徑0.425 mm 篩，密封后放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2）游離酚酸和花青苷的提取。參照文獻(xiàn)［10-11］進(jìn)行，略有改動。稱取50 mg 左右米粉樣品于離心管A 中，加入1 m?純100%甲醇超聲抽提30 min，以8 000 r/min 離心后吸取上清液置于2 m?離心管B，再次加入1 m?70%甲醇（pH=1）于離心管A，重復(fù)上述抽提步驟1 次，上清液于離心管B 中合并，再用OASIS H?B SPE 小柱與真空萃取裝置中對樣品進(jìn)行凈化，將凈化后的樣品置于棕色進(jìn)樣瓶中，放于-80 ℃保存?zhèn)溆?。汲取每份黑米待測物20 μ?，混合后作為質(zhì)控樣品；以抽提液為空白對照。

1.3 儀器設(shè)備與試劑

1）儀器設(shè)備。高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（HP?C，Shim-pack UF?C SHIMADZU CBM20A system；MS，AB SCIEX Triple Quad 5500）、UVF 超聲波清洗機(jī)（小美超聲儀器昆山有限公司）、全自動組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）、真空萃取裝置（Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司）。

2）試劑。乙腈、乙酸（色譜純，Sigma-Aldrich）。OASIS H?B SPE 小柱（沃特世科技上海有限公司）。香草酸、原兒茶酸、龍膽酸、阿魏酸、異阿魏酸、對香豆酸、丁香酸、咖啡酸、間苯三酚、芥子酸、水楊酸、綠原酸、沒食子酸、對羥基苯乙酸、2，4-二羥基苯甲酸、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷（P3G）標(biāo)準(zhǔn)品（TRC，艾美捷科技有限公司）。

1.4 LC-MS/MS測定靶向代謝物

色譜柱為Shim-pack GIST 3.0 μm C18-AQ 2.1 mm×250 mm（HSS），使用VP-ODS C18 2.1 mm×150 mm 和Poroshell 120 EC-C18 2.1 mm× 150 mm進(jìn)行對比。

色譜條件設(shè)定。流速0.25 m?/min，柱溫40 ℃。流動相A 為水（0.25% 乙酸），流動相B 為乙腈（0.25%乙酸）。洗脫程序如表1 所示。質(zhì)譜元件參數(shù)如下：正離子模式離子噴霧電壓為5 500 V，負(fù)離子模式離子噴霧電壓為-4 500 V。氣簾氣為0.24 MPa，霧化氣為0.38 MPa，干燥氣為0.41 MPa。源溫度為550 ℃。質(zhì)譜運(yùn)行模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（multireaction monitoring，MRM）。使用Analyst 1.6.2 軟件處理數(shù)據(jù)。

表1 流動相梯度Table 1 The gradient of mobile phase

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜分析方法的優(yōu)化

由于幾種重要的酚酸類化合物存在同分異構(gòu)體，對色譜分離有更高的要求。酚酸類化合物的色譜流動相通常為甲醇-水和乙腈-水。本研究測試了不同的流動相體系和添加劑，發(fā)現(xiàn)添加有0.04%乙酸的乙腈-水體系分離效果良好。對Poroshell 120 EC-C18、GIST C18-AQ 和VP-ODS C18 色譜柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)使用GIST C18-AQ 色譜柱酚酸類化合物的分離效果和峰型更好。本研究在色譜柱選用相同填料的基礎(chǔ)上使用250 mm 的長柱，發(fā)現(xiàn)長柱分析時間加長但分離效果更佳（圖1），阿魏酸與異阿魏酸得到了較好的分離。

2.2 質(zhì)譜方法的優(yōu)化

通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中的多反映監(jiān)測模式，在正/負(fù)離子模式下利用標(biāo)準(zhǔn)品逐個對2 種花青苷和15 種酚酸化合物進(jìn)行掃描，確定Q1 和Q3，并優(yōu)化各項電離參數(shù)（表2），最終建立MRM檢測方法。

表2 靶向代謝物MRM參數(shù)Table 2 MRM parameters for target compounds

2.3 花青苷和酚酸類代謝物提取條件的優(yōu)化

為比較不同地域黑米花青苷和酚酸類代謝物的差異，采用酸水解法提取了可溶性糖苷型代謝物。由于沒有使用堿水解法，淀粉以沉淀形式存在，未發(fā)生糊化，非常適合使用固相萃取小柱進(jìn)行純化。固相萃取法（H?B）純化后的樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)大幅度減少，有利于提高樣品的信號強(qiáng)度。另外，黑米樣品所富含的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷也會受到抽提過程的影響，其C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)部分發(fā)生斷裂生成酚酸類化合物，本研究選擇在pH=1的酸水解條件下提取30 min。

2.4 不同種植地域黑米中花青苷和酚酸類化合物含量比較

使用Analyst 1.6.2 對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計分析，獲得了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷和14 種酚酸類化合物的定量結(jié)果（圖2），其中，綠原酸含量較低未能檢出。含量從高到低的前6 種次生代謝物為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷＞芍藥素-3-O-葡萄糖苷＞原兒茶酸＞香草酸＞龍膽酸＞阿魏酸。在不同地域種植的黑糙米中C3G 含量為865.2～2 855.7 μg/g，P3G 為218.6～490.7 μg/g，原兒茶酸為47.5～88.4 μg/g，香草酸為37.1～52.0 μg/g，龍膽酸為6.6～18.4 μg/g，阿魏酸為6.5～14.1 μg/g，異阿魏酸為0.3～0.6 μg/g，對香豆酸為0.8～2.1 μg/g，丁香酸為0.2～0.5 μg/g，咖啡酸為0.6～1.7 μg/g，間苯三酚為2.8～4.7 μg/g，芥子酸為0.2～0.4 μg/g，沒食子酸為0.3～0.7 μg/g，2，4-二羥基苯甲酸為1.8～2.8 μg/g，水楊酸為，1.6～2.4 μg/g，對羥基苯乙酸為1.8～4.6 μg/g。其中西安地區(qū)樣品含C3G 2.855 mg/g，P3G 0.491 mg/g，原兒茶酸0.088 mg/g，在所有樣品中是最高的；而黃石地區(qū)樣品檢出量最低，含C3G 0.865 mg/g，P3G 0.162 mg/g，原兒茶酸0.048 mg/g。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和部分酚酸的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，C3G 與原兒茶酸相關(guān)性較高，回歸方程R2為0.639 5（圖3）。這也間接證明C3G 在黑米中發(fā)生分解，得到較多酚酸類化合物（原兒茶酸是其降解產(chǎn)物之一）。因此，在鑒別黑米營養(yǎng)品質(zhì)時，把同樣具備豐富生物活性的原兒茶酸納入考查因素具有一定意義，可綜合兩者含量來進(jìn)行黑米品質(zhì)評價。

在不同地域種植的“華墨香5 號”黑米中所含的一些花青苷和酚酸類化合物差異較大，如西安種植的黑米中C3G、P3G、香草酸、原兒茶酸含量均最高。在襄陽市南漳縣、高新區(qū)種植的黑米樣品中無顯著性差異，但是在荊州、監(jiān)利、石首種植的3 份樣品間C3G 存在顯著性差異，含量變化較大。西安、武漢和陵水3 地的花青苷和酚酸類化合物都存在顯著性差異，但差異程度與緯度不相關(guān)。在西安和襄陽等海拔較高的地區(qū)，花青苷和酚酸類化合物相對較高。

3 討論

黑米中花青苷含量豐富，作為水稻重要的次生代謝產(chǎn)物，其在應(yīng)對環(huán)境脅迫方面起到重要作用，如紫外、低溫、干旱等都能誘導(dǎo)花青苷的合成。水稻花青苷的合成機(jī)制目前已基本被解析，普遍認(rèn)為花青苷的合成受到MYB 類轉(zhuǎn)錄因子或MYB-bH?HWD40 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體調(diào)控［12］。因此，花青苷的積累受到多種生物和非生物因素的影響。在本研究中，西安地區(qū)種植的黑米中C3G 等含量最高，我們推測這是高緯度帶來的低平均氣溫造成的；而黃石地區(qū)樣品C3G 等含量最低的原因則可能是土地肥力因素或田間管理等導(dǎo)致。

黑米中各種酚酸類化合物的生物合成途徑較為相似，都來自莽草酸、苯丙素和類黃酮合成途徑。這些酚類物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上被分為兩大類，一類具有羥基苯甲酸骨架，包括原兒茶酸、龍膽酸、沒食子酸、香草酸和丁香酸等；另一類具有羥基肉桂酸骨架，包括咖啡酸、芥子酸、對香豆酸、阿魏酸等［13］。本研究通過對不同地域種植的黑米酚酸類化合物含量進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)在西安種植的黑米樣品中羥基苯甲酸類酚酸的含量最高，但羥基肉桂酸酚酸含量并不是最高的。結(jié)合對羥基苯甲酸和羥基肉桂酸類酚酸的合成通路與花青苷斷裂模式分析發(fā)現(xiàn)，羥基苯甲酸的含量與花青苷含量相關(guān)。而羥基肉桂酸類酚酸則與木質(zhì)素合成通路等重疊較多，其含量受到多種通路的影響，積累規(guī)律也較為復(fù)雜。此外，黑米成熟后具有C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)的花青苷會自發(fā)緩慢降解，生成具有C6-C1 或C6-C3 骨架的化合物，這種現(xiàn)象也使得酚酸類化合物被間接積累［14］。因此，在生產(chǎn)高營養(yǎng)價值黑米時，需針對特定品種選擇合適的種植地域。

由于不同黑米品種間不可溶酚酸類差異較大，并且不可溶酚酸類多以衍生物形式存在，積累規(guī)律復(fù)雜，可能受到多種通路影響，因此，本研究對不可溶性酚酸類未做提取和分析，使操作方法更加便捷，不需要多次水解，極大地保護(hù)了提取出來的代謝物，防止其在提取過程中發(fā)生降解和氧化。前人研究發(fā)現(xiàn)，羥基肉桂酸類酚酸在酸水解條件下并不穩(wěn)定，如阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸等會發(fā)生降解［15］；本研究關(guān)注的是黑米中容易釋放、易被人體吸收的游離態(tài)和可溶性糖苷型化合物［16］，這部分化合物在人體內(nèi)利用率高，對營養(yǎng)健康貢獻(xiàn)更大。這種研究策略的優(yōu)點是可快捷、直觀地比較不同地域的酚酸類化合物差異，缺點是忽略了潛在的酚酸類衍生物差異。其中，本研究未能檢測到綠原酸，這可能與綠原酸的性質(zhì)和含量有關(guān)。綠原酸是咖啡酸和奎寧酸的衍生物，在結(jié)構(gòu)上存在熱不穩(wěn)定性，電離時容易發(fā)生源內(nèi)裂解；此外，綠原酸的含量極低，且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易水解成咖啡酸和奎寧酸，這也可能是未被檢測到的原因［17］。