植物花青苷代謝調(diào)控機理研究進展

應(yīng) 震，周 莊

(浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325000)

花青苷(Anthocyanin)屬黃酮類化合物，由花青素(Anthocyanidin)和糖類(Saccharides)通過形成糖苷鍵合成?；ㄇ嘬兆鳛樘烊簧?，廣泛分布于植物多種組織器官中，是使植物組織呈黃、紅、紫、藍和黑(深紫)等多種顏色的重要色素?；ㄇ嘬胀瑫r也具有抗癌、抗炎等藥用及保健作用，并廣泛應(yīng)用到藥、食品領(lǐng)域。目前在植物中已檢測到上百種花青苷，而其特殊的生物學(xué)功能也吸引了科學(xué)家的關(guān)注，并提出了很多關(guān)于其功能的假說，如光保護、防輻射及植物抗逆等功能。早在1916年，Whldale就曾提出花青苷的合成可能是植物在強光下的一種自身保護行為，通過對光合作用的研究表明，過強光線照射下會使植物葉片中天線色素和聚光色素產(chǎn)生大量的質(zhì)子，這些質(zhì)子會對光合作用發(fā)生的類囊體有較強的傷害作用，而花青苷由于其特殊的光譜性質(zhì)則可以吸收紅色光譜，在植物細胞內(nèi)部減弱光照的強度，這就使紅色或紫色葉植物可以更適合在強光下生存[1]。除上述功能以外，花青苷積累也與植物繁衍后代有密切的關(guān)系，通?；ㄇ嘬兆钜追e累的部位是植物生殖器官，如花和果實，尤其是蟲媒花，通常顏色非常深，這有助于被蜜蜂，蝴蝶，蜂鳥等動物識別，在采集植物花粉和花蜜的同時，也可以協(xié)助其進行傳粉，而果實在被食用后，其種子也有機會被帶到更遠的地方，這就有利于該植物擴大自身的分布面積和范圍[2]。

盡管植物花青苷合成途徑已經(jīng)研究得較為清晰，也發(fā)現(xiàn)了MYB、bHLH、WD40和DELLA蛋白等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控花青苷的合成?；ㄇ嘬罩饕邗r艷花朵花瓣中積累，但是很多復(fù)色花瓣的斑色形成機理是什么？哪些轉(zhuǎn)錄因子能在局部對花青苷合成進行調(diào)控？黃色玫瑰(Rosa)花瓣中積累天竺葵素類花青苷，而紅色月季花瓣中積累矢車菊素類花青苷，是什么因素導(dǎo)致了這兩種月季表型的差異？這顯然不能用現(xiàn)行花青苷合成途徑以及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控理論進行合理解釋。山茶科(Theaceae)、樟科(Lauraceae)、薔薇科(Rosaceae)等植物的葉片在生長初期積累了大量的矢車菊素類或飛燕草素類花青苷，而隨著葉片生長發(fā)育，紅色會迅速褪去，葉片恢復(fù)成綠色，花青苷的降解機理又是什么？與此同時，環(huán)境因素是如何調(diào)控植物花青苷積累的問題也尚未明確。本文主要綜述近期花青苷生物合成及分子調(diào)控機理的研究進展，為解釋上述問題提供研究方向和參考。

1 植物花青苷合成途徑

圖1 花青苷化學(xué)合成途徑Fig 1 The synthesis pathway of anthocyanin

(1)PAL:Phenylalanine ammonia-lyase苯丙氨酸裂解酶;(2) C4H: Cinnamic acid 4 - hydroxylase 肉桂酸-4-羥化酶;(3)4CL: 4 - coumaric Acid-COA ligase;4-香豆酸-輔酶A連接酶;(4) CHS: Chalcone synthase 查爾酮合成酶;(5)CHI: Chalcone isomerase 查爾酮異構(gòu)酶;(6) F3H: Flavanone 3-hydroxylase 黃烷酮3-羥化酶;(7) F3’H: Flavonoid 3' - hydroxylase類黃酮3’- 羥化酶;(8) DFR: Dihydroflavonol reductase 二氫黃酮醇還原酶;(9) ANS: Anthocyanidin synthase花青素合酶;(10) UFGT: UDP- flavonoid glycosyltrferase類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶

圖1所示為三種主要花青苷的合成途徑，可以看出，花青苷合成存在兩個主要步驟，第一步是花青苷由苯丙氨酸開始，在苯丙氨酸裂解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸-輔酶A連接酶(4CL)和查爾酮合成酶(CHS)催化下，經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)生成查爾酮，查爾酮是第一個具有黃酮結(jié)構(gòu)的化合物。第二步反應(yīng)是從查爾酮通過查爾酮異構(gòu)酶催化為柚皮素開始，再合成二氫黃酮類化合物，通過三種不同結(jié)構(gòu)的二氫黃酮合成三種主要的花青苷，這步反應(yīng)屬于植物類黃酮代謝途徑中的一部分，因此存在較為復(fù)雜的代謝關(guān)系。

1.1 合成途徑中的調(diào)控作用

通過分子生物學(xué)研究，在合成通路上，主要發(fā)現(xiàn)查爾酮合成酶基因(CHS)，二氫黃酮還原酶基因(DFR)，類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因(UFGT)這三個酶合成基因在花青苷代謝途徑中起到了重要的調(diào)控作用。

1.1.1CHS基因的調(diào)控作用

查爾酮合成酶基因，簡稱CHS，該基因的功能是合成查爾酮。查爾酮是植物體內(nèi)黃酮類化合物過程中最為關(guān)鍵的前體物質(zhì)，在PAL途徑未發(fā)現(xiàn)前，人們一直認為查爾酮是花青苷合成的起始[3, 4]。因此CHS基因表達活性與植物能否產(chǎn)生花青苷存在非常重要的關(guān)系。自從基因沉默現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)后，在研究CHS上取得了進展，早在1990年，研究人員就發(fā)現(xiàn)當(dāng)反義CHS基因會干擾矮牽牛[Petuniahybrida(J.D.Hooker)Vilmorin.]花青苷的積累，使原本紅色花的矮牽牛花色變?yōu)榘咨?，花瓣中花青苷積累明顯減少[5, 6]。在對山楂(CrataeguspinnatifidaBunge.)紅色花瓣形成相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)在山楂花瓣顏色由白加深至紅色的過程中，CHS基因表達水平不斷上升[10]。這一系列實驗表明，CHS基因可能參與了植物組織花青苷積累的調(diào)控。

1.1.2DFR基因的調(diào)控作用

二氫黃酮醇還原酶基因，簡稱DFR。在花青苷形成過程中，由圖1可以看出，DFR催化二氫山奈酚，二氫楊梅素和二氫槲皮素這三種二氫黃酮形成三種無色花青素，由此可以看出DFR基因的表達與花青苷合成直接相關(guān)。DFR基因早在1992年就已被克隆，隨后不同植物的DFR基因在模式植物中進行了表達，實驗結(jié)果顯示了幾乎所有的轉(zhuǎn)基因植物的花色存在由白色向紅色的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，將紫土豆(SolanumtuberosumL.)中克隆得到的DFR基因轉(zhuǎn)入其它正常品種的土豆中進行過量表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因可以使正常土豆也變成紅色[11]，這說明了DFR基因與花青苷合成有很大關(guān)聯(lián)[12-14]。在對金花茶(CamellianitidissimaChi.)的研究中，發(fā)現(xiàn)DFR基因表達量明顯偏低，使得原本開紅花的山茶轉(zhuǎn)變?yōu)殚_黃花的山茶[15]。與金花茶相似，在黃色洋蔥(AlliumcepaL.)的DFR基因啟動子區(qū)域發(fā)生點突變，由于無法合成花青苷上游產(chǎn)物，此時洋蔥表皮轉(zhuǎn)變成了黃色[16]。在對蕪菁(BrassicarapaL.)低溫處理后，同樣發(fā)現(xiàn)DFR基因表達量上調(diào)，并促進植物組織積累花青苷，這說明溫度對花青苷積累調(diào)控可能是通過DFR基因?qū)崿F(xiàn)的[17]。若對DFR進行表達干擾，轉(zhuǎn)基因植物花色會變?yōu)榘咨玔12, 18-20]，通過上述研究充分表明DFR基因參與了調(diào)控植物花青苷的合成。

1.1.3UFGT基因的調(diào)控作用

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因，簡稱UFGT。通過合成途徑可以明顯看出該途徑位于花青苷合成途徑的末端，這就使植物花青苷含量與UFGT酶和基因表達水平活呈顯著正相關(guān)。在蘋果(MalusdomesticaL.)果皮花青苷合成過程中發(fā)現(xiàn)CHS酶并沒起到效果，但是UFGT酶的酶活性與花青苷的合成有顯著的正相關(guān)關(guān)系[21]。紅葡萄和白葡萄的性狀差異的主要原因是UFGT基因在紅葡萄中大量表達[22, 23]。與前面結(jié)果相同，甜橙(Citrus)(紅心橙)的CHS，DFR，ANS這三個基因表達與甜橙的花青苷積累并不相關(guān)，UFGT的表達量與甜橙花青苷積累呈正相關(guān)[24]。荔枝(LitchichinensisSonn.)由綠變紅過程中UFGT表達量測定結(jié)果顯示，在荔枝果實顏色加深伴隨著UFGT表達水平上調(diào)，在果實3個生長階段的表達量分別是綠色小于黃色時期，而紅色時期的表達量最高[25]。桃樹(AmygdaluspersicaL.)的紅花和白花中ANS，CHS，DFR等基因都有表達，但UFGT基因在白色花朵中幾乎沒有表達，在紅色花朵中的表達量卻很高[26]。除了使果實和花色變紅，UFGT基因表達水平還與紫馬鈴薯的塊莖花色苷積累有正相關(guān)[27]。綜上所述，植物花青苷合成途徑過程中，對顯色調(diào)控最關(guān)鍵的基因就是UFGT。從分子調(diào)控角度看，UFGT過量表達的結(jié)果使植物呈現(xiàn)較深的顏色，如深紅色或深紫色，而DFR或ANS過量表達只是使顏色加深至粉紅色或淡紫色。

1.1.4 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用

MYB蛋白是植物次生代謝中最主要的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這種蛋白通常需要和bHLH，PAP2和WD40等蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，共同作用于花青苷的合成。早在1997年，就有學(xué)者提出與玉米(ZeamaysL.)花青苷啟動蛋白C1與MYB基因有關(guān)[28]。近期，科研人員發(fā)現(xiàn)類MYB蛋白也同樣具有相似的調(diào)控作用，在甜菜根中，一類Y基因編碼的蛋白類似MYB蛋白，激活了過去普遍認為由MYB蛋白激活的甜菜(Beta)紅色素(非花青苷)合成通道[29]。目前MYB基因在大量植物中被發(fā)現(xiàn)，而其基因序列也相對保守，通過擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.]MYB基因序列設(shè)計引物，在豆類植物中發(fā)現(xiàn)了244個同源性序列[30]。由于其特殊的功能，使其成為近年來花青苷調(diào)控研究中最熱門的一個調(diào)控基因。云南紅梨(PyruspyrifoliaL.)在成熟過程中，隨著顏色加深，MYB基因表達量和花青苷含量的積累呈現(xiàn)相關(guān)性[31]。獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)開花過程中，隨著花色加深，科研人員同樣發(fā)現(xiàn)MYB基因表達水平會上調(diào)[32]。另外，科研人員將擬南芥中MYB基因和GLABRA3基因同時轉(zhuǎn)進土豆中，發(fā)現(xiàn)土豆的花青苷合成基因的表達量明顯上調(diào)[33]。在花青苷合成途徑中，盡管MYB基因表達產(chǎn)物并不在關(guān)鍵產(chǎn)物間起催化作用，但是其表達量高低卻對花青苷含量有著顯著影響。目前在擬南芥花青苷調(diào)控體系和玉米花青苷合成調(diào)控體系中，均發(fā)現(xiàn)MYB基因?qū)ㄇ嘬蘸铣捎兄匾挠绊?，但是擬南芥的MYB基因只對查爾酮合成到二氫黃酮類化合物起調(diào)控作用，玉米的MYB基因則對查爾酮到花青苷合成中所有的結(jié)構(gòu)基因起調(diào)控作用[34]，在煙草中過量表達淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)的MYB基因后花色變紅，同時通過對花青苷基因表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)CHS，CHI和ANS基因表達水平明顯上升。同樣的結(jié)果也在紅小麥(TriticumaestivumL.)[35]、楊樹(PopulusL.)[36]的研究中得到證實，這說明MYB基因可以同時對多個與花青苷合成有關(guān)的基因進行調(diào)控。近年來對MYB基因的實驗工作大多屬于驗證性實驗，而將MYB基因研究結(jié)合整個花青苷調(diào)控的工作還不多，亟待深入開展。

除了MYB，bHLH、WD40和DELLA蛋白和基因也同樣對花青苷積累起到正向調(diào)控作用，研究人員發(fā)現(xiàn)蘋果果實在變紅過程中，尤其存在外界環(huán)境因素干擾時，WD40和bHLH蛋白的調(diào)控是起到?jīng)Q定性作用。在牽牛花花青苷積累過程中，同樣發(fā)現(xiàn)bHLH的基因起到重要的調(diào)控作用。最近研究發(fā)現(xiàn)DELLA蛋白可以調(diào)控MYB基因表達，進而影響MYB-bHLH-WD40蛋白復(fù)合體的生物學(xué)功能。

2 植物花青苷降解途徑

植物花青苷降解調(diào)控是花青苷代謝調(diào)控的另一個主要途徑。根據(jù)化學(xué)方法，研究發(fā)現(xiàn)花青苷在pH值處在1以下和10以上時會發(fā)生酸水解和堿水解[37, 38]，但目前在已知的植物體內(nèi)并不存在如此極端的酸堿條件，從目前已有的報道看，植物細胞中花青苷是通過哪些途徑進行降解的機理尚未明確。過去，普遍觀點認為花青苷在植物組織中屬于緩慢的自然分解，植物體內(nèi)并無專門的代謝通路，如花瓣可以保持較長時間不褪色，或顏色逐漸變淡。但是山茶(CamelliajaponicaL.)，桂花(OsmanthusSp.)和樟樹(CinnamomumbodinieriLevl.)等植物葉片生長初期呈明顯的紅色，隨著葉片生長，顏色會迅速褪去成綠色，葉片花青苷的含量變化這顯然不能用自然緩慢降解的理論加以解釋。

植物光合作用是植物最重要的生理代謝途徑，很多研究表明光照既可促進花青苷合成，同樣也會促進花青苷的降解。通過對植物進行觀察，發(fā)現(xiàn)弱光和強光都會促進葉片花青苷的積累，而在一定范圍內(nèi)的光線會促進葉片中花青苷加速分解。根據(jù)這一現(xiàn)象，科研人員進而發(fā)現(xiàn)植物組織中的過氧化物酶水平高低與花青苷積累存在一定負相關(guān)，當(dāng)過氧化氫酶(CAT)活性水平增加，植物花青苷會迅速降解，而酶活性受抑制后，花青苷降解速度明顯減慢，并推斷過氧化氫酶可能是植物花青苷降解反應(yīng)重要的調(diào)控酶。通過蘋果和梨的果皮變化可以看出，青皮顏色褪去后，果皮的光合作用強度降低，此時紅色的花青苷開始積累；而植物初生葉呈紅色，隨葉片光合成作用強度增加花青苷則迅速分解[39-42]。這可以看出，隨著植物光合作用強度增加，過氧化物酶活性水平上升，花青苷確實存在加速降解的現(xiàn)象。但是，過氧化物酶是通過什么途徑加速花青苷分解的機理尚未找到，由于過氧化物酶能快速促進花青苷分解，花青苷分解的過程也不明確，而過氧化物酶是否直接作用于花青苷使其降解也并不清楚，這需要今后從化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子水平上對花青苷的代謝機制做進一步的研究。

3 展望

植物花青苷合成途徑目前已經(jīng)了解得較為詳細，合成途徑中的基因功能也通過轉(zhuǎn)化煙草或擬南芥的方式進行了相對深入的驗證，同時也發(fā)現(xiàn)MYB等調(diào)控基因參與了花青苷的合成。但是從植物生理以及其所在的環(huán)境因素的角度上分析，可以看出目前植物的花青苷合成與其生理活動之間的關(guān)系目前尚未能進行合理的解釋。從植物生物學(xué)活動上看，花青苷積累明顯與植物抗逆之間存在不可分割的關(guān)系。可見，今后花青苷合成及調(diào)控研究將從目前的基因功能驗證轉(zhuǎn)向更深入的調(diào)控途徑研究?；ㄇ嘬蘸铣赏緩綄儆陬慄S酮代謝途徑，而類黃酮代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑，與植物發(fā)揮正常的生理功能以及更好的適應(yīng)自然環(huán)境有著密不可分的聯(lián)系。結(jié)合目前已知的花青苷合成途徑，可以看出花青苷相關(guān)的合成基因和調(diào)控基因在過量表達后，均會造成轉(zhuǎn)基因植物組織中花青苷的積累。另外，不同的基因所受到非生物因素的調(diào)控卻又是不同的，目前研究也發(fā)現(xiàn)MYB基因與植物抗寒性有關(guān)，而DELLA蛋白與植物在強光下的生理作用有關(guān)，這些環(huán)境因素是否通過調(diào)控基因間接影響到花青苷合成基因的表達還有待進一步研究。

花青苷在植物體內(nèi)同時存在一個降解的調(diào)控，目前研究初步認為該調(diào)控與光合作用產(chǎn)生的過氧化物酶活性存在負相關(guān)，這又提出了植物花青苷積累調(diào)控的新問題：植物花青苷含量是否由一個動態(tài)平衡調(diào)控？外界自然因素是否也作用于花青苷降解途徑進行反向調(diào)控植物花青苷的積累？結(jié)合植物不同的器官組織顏色變化，植物花青苷降解過程是否存在多個通路的調(diào)節(jié)？在這些通路中，又有哪些基因參與了調(diào)控？

這些思路將有助于我們深入的理解植物合成花青苷的生物學(xué)功能，為今后保護和開發(fā)植物資源提供有用的理論參考。