荸薺種楊梅的疏果和落果功能性成分研究

劉 清，倪 穗

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

楊梅(MyricarubraSieb.et Zucc)是楊梅科(Myricaceae)楊梅屬(Myrica)的常綠喬木[1]。它是我國南方著名的特產(chǎn)類水果。吳耕民先生稱其果為“中國特產(chǎn)的初夏江南珍果”[2]。我國是楊梅的主產(chǎn)國，楊梅的種植面積占世界總栽種面積的 98.5% 以上，主要分布在浙江、江蘇、福建、廣東等南方的省份。荸薺種楊梅因果實成熟時色澤呈紫黑色像荸薺而得名。營養(yǎng)豐富、具生津止渴、利消化的作用,具有較高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值[3-7]。

楊梅的結(jié)實率非常強(qiáng)，為了保證楊梅品質(zhì)，在楊梅掛果的前期會進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖韫?，一般會疏掉結(jié)果量的 40%～60%，使每個枝條上保持2到3個果實，這個疏果措施對楊梅果實單果重的提高作用很大。同時，楊梅在果實成熟前(一般采前約20天內(nèi))和成熟時通常會出現(xiàn)大量的落果，這是因為在果實轉(zhuǎn)色后趨向生理完熟過程中，核果肉柱內(nèi)的乙烯含量持續(xù)增加，果實呼吸作用增強(qiáng)，果柄與果枝的接合部產(chǎn)生離層內(nèi)源激素脫落酸不平衡,在不受外力，或生產(chǎn)農(nóng)事輕輕搖晃,或自然風(fēng)雨作用下而形成落果，落果率一般5%-50%[8]。

近年來，國內(nèi)對楊梅的研究重點(diǎn)在于如何保鮮，延長楊梅的貯藏期，也有對楊梅進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)[9-12]。而對疏果的研究在于如何合理進(jìn)行疏果，減少人工成本費(fèi)用；對落果的研究在于如何防控落果，減少落果率。鮮有對楊梅疏果和落果的開發(fā)利用研究。而楊梅疏果和落果的量較大，不加以利用是對資源的大量浪費(fèi)，而且疏果落果腐爛后會引起病害和污染環(huán)境。因此，本文針對楊梅的疏果和落果進(jìn)行開發(fā)利用，旨在變廢為寶解決楊梅疏果和落果的資源浪費(fèi)和污染環(huán)境的問題及增加果農(nóng)的收入。

1 實驗材料

1.1 實驗材料

取自慈溪市橫河疏果期、落果期的荸薺種楊梅果，將新鮮的楊梅去核，分別進(jìn)行真空冷凍干燥48 h，置于-18℃貯藏備用。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、標(biāo)準(zhǔn)品檸檬酸、標(biāo)準(zhǔn)品蘋果酸、標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸(生化試劑，中國藥品生物制品檢定所出品)、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸(分析純)、2N福林試劑(Folin reagent)、碳酸鈉、磷酸二氫鉀(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)。

主要儀器：RF-5301PC型可見分光光度計(日本島津公司)；組織勻漿機(jī)(飛利浦公司)；FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；FW80高速萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；Anke TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Waters2695型高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測器；Empower色譜工作站；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)； PH計(上海埃依琪實業(yè)有限公司)。

2 實驗方法

2.1 黃酮類化合物測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將蘆丁于120℃下干燥至恒重，精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 0.02 g，用 95%乙醇溶解，并定容于100 m L容量瓶中。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 m L，置于 25 mL容量瓶中，加入2.5 ml蒸餾水，1.25 mL 5%的NaNO2，搖勻后靜置6 min；加入1.25 mL 10%的Al(NO3)3，再搖勻靜置6 min后，加入6.25 mL 5%的NaOH；然后加水至25 mL，搖勻靜置15 min，在510 nm波長下測定不同濃度的蘆丁的吸光度。

2.1.2 樣品處理與測定

稱取1.0 g 干燥的楊梅粉放于50 mL的離心管中，按料液比1∶10(g/m L)加入濃度為70%的乙醇，常溫下超聲萃取30 min，頻率為350 Hz，然后3000 r/min離心10 min，分離上清液和沉淀，重復(fù)提取2次，合并上清液定容到10 ml得到供試品。

準(zhǔn)確吸取0.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，加入2.5 ml蒸餾水，1.25 mL 5%的NaNO2，搖勻后靜置6 min；加入1.25 mL 10%的Al(NO3)3，再搖勻靜置 6 min 后，加入 6.25 mL 5%的NaOH；然后加水至 25 mL，搖勻靜置 15 min，在 510 nm波長下測定不同濃度的蘆丁的吸光度在 510 nm波長下測定不同濃度的蘆丁的吸光度，三組平行實驗。

2.2 總酚的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.2 g沒食子酸，用蒸餾水定容至100 mL，從中吸取5 mL，用蒸餾水定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。分別準(zhǔn)確吸取沒食子酸溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、2.0 mL放置在50.0 mL的容量瓶中，然后加入4 mL蒸餾水，搖勻，加入0.5 mL福林酚溶液，搖勻，靜置1 min，加入1.5 mLNa2CO3(200 g/L)，然后用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，放在暗處反應(yīng)兩小時，用試劑作空白參照試驗，在765 nm下測其吸光度。

2.2.2 樣品處理與測定

稱取1.0 g干燥的楊梅粉放于50 mL的離心管中，按料液比1∶20(g/m L)加入乙醇，常溫下超聲萃取1 h，頻率為350 Hz，然后3000 r/min離心10 min，分離上清液和沉淀，重復(fù)提取2次，合并上清液定容到20 ml得到供試品。

準(zhǔn)確吸取0.2 mL楊梅多酚萃取液，加4 mL蒸餾水和0.5 mL福林-酚試劑混勻，放置3 min，然后加1.5 mL 20%的Na2CO3，用蒸餾水定容到50 ml，混勻，在暗處放2 h，測定765 nm處吸光度值。設(shè)置3個平行實驗，取其平均值。

2.3 總酸的測定

2.3.1 溶液的配制

0.1000 mol.L-1NaOH溶液:稱取4.000 g NaOH,加水溶解,定容至1 L。

麝香草酚酞指示劑:稱取麝香草酚酞1 g,溶于適量乙醇中再稀釋至100 ml。

酚酞指示劑:稱取酚酞1 g,溶于適量乙醇中再稀釋至100 ml。

2.3.2 滴定NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取約0.6 g在105一110℃干燥至恒量的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀,加80 ml新煮沸過的冷水,使之盡量溶解,加2滴酚酞指示液,用已標(biāo)定的NaOH溶液滴定至溶液呈粉紅色5 min不褪色。

NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度按下式計算:c3=m/(V1一V2)*0.2042

c3-NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實際濃度(mol/L)； m-基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量(g)；Vl-NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的用量(ml)；V2-空白實驗中NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用量(ml)；0.2042-與1.0 ml氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(NaOH)=lmol/L]相當(dāng)于基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量(g)

2.3.3 樣品制備與測定

楊梅汁用活性炭除色后準(zhǔn)確吸取樣品10 ml于50 ml錐形瓶中,加入1%麝香草酚酞指示劑3滴,用NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至顯藍(lán)色。

總酸度以檸檬酸計算，g/100mL=V*c3*0.07*100/W

V-消耗NaOH溶液的毫升數(shù)(ml)；N-NaOH溶液當(dāng)量濃度(mol/L)；W-樣液體積(ml)；0.070-1 mol氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1毫升相當(dāng)于檸檬酸(含1分子水)克數(shù)

無水檸檬酸的換算系數(shù)為0.064,醋酸(0.060),酒石酸(0.075),乳酸(0.09),蘋果酸(0.067)。

2.4 檸檬酸、蘋果酸測定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘋果酸 513.0 mg、檸檬酸 494.9 mg置于10 m L 棕色容量瓶中，用流動相溶液溶解并定容至刻度，得到蘋果酸濃度為0.513 mg/L、檸檬酸濃度0.4949 mg/L。

分別取0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL用流動相定容到10 mL。分別配制濃度為0.513、2.565、5.13、10.26、20.52、30.78、41.04、51.3 ug/L的蘋果酸(標(biāo)準(zhǔn)品純度98%)和濃度為 0.4949、2.4745、4.949、9.898、19.796、29.694、39.592、49.49 ug/L的檸檬酸(標(biāo)準(zhǔn)品純度99.5%)的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以液相色譜分析條件進(jìn)樣分析，根據(jù)濃度與峰面積的對應(yīng)關(guān)系分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 樣品處理與測定

楊梅去核、攪碎、勻漿。稱取12.5 g 于25 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容， 旋渦振蕩 2 min，超聲提取30 min，過濾。取一定量的濾液以10000 r/min高速 離心10 min，分離沉淀蛋白質(zhì)、果膠等干擾物質(zhì)，取上清用0.45 μm 孔徑的濾膜過濾2次，濾液供上機(jī)分析，分析時進(jìn)樣10 μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 回歸方程和相關(guān)系數(shù)

黃酮類化合物、總酚用分光光度法進(jìn)行檢測，有機(jī)酸種類及含量采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，其線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)和線性范圍如表1所示。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

由表1可知,黃酮類化合物、總酚和檸檬酸、蘋果酸在各自的濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。

3.2 荸薺種楊梅主要功能性成分的含量

通過分光光度法檢測黃酮類化合物、總酚；高效液相色譜法檢測檸檬酸、蘋果酸等；酸堿滴定法檢測總酸等功能性成分，其結(jié)果如表2所示。

表2 荸薺種楊梅的疏果和落果主要功能性成分含量

注：肩標(biāo)不同字母表示在p=0.05水平下差異顯著。

荸薺種楊梅的疏果和落果的主要功能性成分含量如表2所示，從表中可以看出，疏果和落果中功能性成分的含量不同。 疏果的黃酮類化合物含量56.15 mg/g與落果的黃酮類化合物含量39.88 mg/g存在顯著差異；疏果的總酚含量28.16 mg/g與落果的總酚含量19.33 mg/g存在顯著差異；疏果的檸檬酸含量35.888 mg/g與落果的檸檬酸含量8.76 mg/g存在顯著差異；疏果的蘋果酸含量1.378 mg/g與落果的蘋果酸含量0.939 mg/g存在顯著差異；總酸含量3.5%高于落果1.1%。

4 討論

楊梅生長發(fā)育時期分為：幼果期、硬果期、破色期、紅熟期、暗紅期[13]。疏果屬于楊梅的幼果期，落果屬于楊梅的暗紅期。梁森苗[14]等的研究了荸薺種果實發(fā)育過程中主要營養(yǎng)成分的形成規(guī)律。表明荸薺種的總酸、檸檬酸、蘋果酸含量在發(fā)育生長過程中均呈現(xiàn)出先緩慢上升后迅速下降趨勢，但幼果期的總酸含量高于成熟期，且在成熟期總酸含量達(dá)到最低點(diǎn)；而黃酮類化合物變化趨勢總體呈現(xiàn)倒V型，幼果期的含量達(dá)到最大；總酚含量在幼果期最高，破色期是總酚含量下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，紅熟期之后略有升高直到暗紅期保持穩(wěn)定。

本文對荸薺種楊梅的總酸、檸檬酸、蘋果酸研究與前期對其他品種的研究結(jié)果相似[15-16]。疏果的檸檬酸、蘋果酸含量均高于落果，而楊梅中總酸是以檸檬酸含量計算，其含量主要受到檸檬酸的影響，所以其規(guī)律與檸檬酸基本一致，及疏果總酸含量高于落果含量?？傻味ㄋ岷俊⒖偡宇惡颗c感官評價中的酸味、澀味強(qiáng)度有一定的關(guān)聯(lián)，總酚化合物中的單寧是造成澀味的主要成分物質(zhì)。幼果期楊梅口感酸澀，疏果總酸、總酚含量最高，隨著楊梅果實的成熟，總酸、總酚含量逐漸降低，楊梅的糖類物質(zhì)積累，糖酸比變大，口感變?yōu)樗崽?。黃酮類化合物含量與程海燕[17]等的超聲波提取荸薺種黃酮類化合物的最佳工藝條件：乙醇濃度為70%，提取時間為30 min，料液比為1∶10，提取溶劑PH=3下的含量差異較大。表明不同產(chǎn)地、不同提取工藝對黃酮類化合物的得率的有顯著性的差異，以后可對此進(jìn)行進(jìn)一步的探究驗證。本文落果中總酚含量(19.33±0.02 mg/g)與解紅霞[18]研究的不同干燥方式中冷凍干燥楊梅的總多酚含量(24.49±6.00 mg/g)差異不大，表明冷凍干燥對楊梅的營養(yǎng)物質(zhì)損失率較小。落果中總酸含量1.1%與潘向榮[19]研究楊梅總酸度的結(jié)果差異性不大。表明采用常規(guī)的酸堿滴定法對楊梅總酸度的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確。 落果中檸檬酸和蘋果酸含量與劉文靜[20]采用反相高效液相色譜法測定不同品種楊梅的含量差異很大，分析其原因可能是由于品種不同、測定采用的方法不同導(dǎo)致其含量差異較大，但有機(jī)酸是以檸檬酸和蘋果酸為主。

黃酮類化合物、總酚等有多種重要的生理功能，可以用作抗氧化劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、抑菌劑。本文測定了荸薺種楊梅的疏果和落果的主要功能性成分含量，幼果期的楊梅主要功能性成分的含量均高于成熟期。采用分光光度法測定疏果黃酮類化合物(56.15±0.03mg/g)、總酚含量(28.16±0.01 mg/g)高于落果黃酮類化合物(39.88±0.02 mg/g)、總酚含量(19.33±0.02 mg/g)；采用酸堿滴定法測定疏果總酸含量(3.5%)高于落果含量(1.1%)；采用高效液相色譜法測定疏果檸檬酸(35.888±0.06 mg/g)、蘋果酸含量(1.378±0.02)高于落果檸檬酸(8.76±0.04 mg/g)、蘋果酸含量(0.939±0.01 mg/g)。本文研究結(jié)果為楊梅疏果和落果的綜合開發(fā)利用提供一些有益的參考。