多真菌毒素同步快檢試紙陣列裝置的研制與應(yīng)用

徐正華，楊晗婕，吳思超，張毅

1.中華人民共和國黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣州 510770；2.江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室/江南大學食品學院，無錫214122

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是絲狀真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，可在生物體內(nèi)積累。這些真菌毒素的主要毒性包括致癌性、雌激素和生殖毒性、致突變性和肝腎毒性物質(zhì)、致畸性和免疫抑制，對人類和動物健康構(gòu)成嚴重危害［1］。真菌毒素分布廣泛，主要污染小麥、玉米、飼料等農(nóng)產(chǎn)品［2-3］。根據(jù)糧農(nóng)組織的統(tǒng)計，每年全球25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素的污染，其中多達91.4%的樣本受到了聯(lián)合污染［4］，造成數(shù)千億美元的經(jīng)濟損失。我國食品安全國家標準GB2761—2017《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量指標分別為0.5～20、60、2～10、1 000 g/kg。各種真菌在生長或產(chǎn)生毒素時具有相同的生態(tài)條件［5］，大多數(shù)真菌可產(chǎn)生多種真菌毒素，一種真菌可污染多種農(nóng)產(chǎn)品和食品，再加上飲食多樣化，食品通常會受到真菌毒素共存的污染［6］。真菌毒素的共同污染可能導致拮抗、累積或協(xié)同效應(yīng)，對人類構(gòu)成更大的威脅［7］。因此，迫切需要開發(fā)真菌毒素的多重檢測方法。

目前，霉菌毒素復合檢測方法主要有儀器分析法和免疫分析法。儀器檢測方法，如高效液相色譜法（HP?C）［8］、液相色譜熒光法（?C-F?）［9］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（?C-MS/MS）［10］，準確可靠，但依賴昂貴的設(shè)備、復雜的樣品預(yù)處理步驟和專業(yè)培訓人員，這大大限制了真菌毒素現(xiàn)場檢測的應(yīng)用。免疫分析法因其靈敏度高、成本低而被廣泛應(yīng)用于真菌毒素的檢測［11］。高通量免疫分析在檢測多種真菌毒素方面具有顯著優(yōu)勢，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗［12］、多重流動細胞免疫分析［13］和抗體微陣列免疫分析［14］。然而，由于對特殊儀器和熟練技術(shù)人員的需求，這些方法無法得到廣泛應(yīng)用。

側(cè)流免疫層析分析法（?FIA）作為一種新興的檢測技術(shù)，具有速度快、檢測限低（?OD）、特異性好、成本低和耗樣少等優(yōu)點［15-16］。盡管標準?FIA 具有優(yōu)良的特性，但1 次只能檢測1 個目標分析物，食品安全、環(huán)境控制、臨床診斷和法醫(yī)監(jiān)測等領(lǐng)域，均需要具有多路復用能力的試紙，以提高測試效率，同時降低成本［17］。已有研究者開發(fā)了單條試紙上固定多條檢測線的檢測方法（迄今為止最多5種分析物）［18-19］，此方法中前端分析物的含量會對后端顯色產(chǎn)生顯著影響因而難以定量，多色編碼能在一定程度上克服信號元的非特異性吸附帶來的干擾，但受試紙長度所限、多條檢測條帶彼此間距離很近，不利于裸眼準確區(qū)分和辨別。多個分析物實際以先后順序得以檢測，沒有做到真正的“同步”檢測。僅有的1條質(zhì)控線也無法保障多條通路的有效性，可能會導致假陽性或結(jié)果偏差。?u 等［20］開發(fā)了基于適配體的?FIA，用于食品樣品中快速定性篩選多種病原體，3 條獨立的通道可同時初步檢測鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌。但此工作在定量檢測方向還有待進一步探索。綜上，對于多類復雜基質(zhì)中多目標物的同步快速檢測，開發(fā)實用、便攜、價廉的，又能真正實現(xiàn)時間同步、且又互不影響的陣列試紙裝置具有重要的創(chuàng)新意義和成果延伸意義。

3D 打印技術(shù)簡化了產(chǎn)品的制造程序，減少了產(chǎn)品的制造時間和耗材用量，可制造復雜結(jié)構(gòu)零件并且無需組裝，可實現(xiàn)精確實體復制以及個性化定制［21］，從而提高了生產(chǎn)效率，成本低廉。它對于小批量單件、特殊復雜零件能直接快速生產(chǎn)。已經(jīng)有研究人員借助3D打印技術(shù)輔助側(cè)流免疫層析試紙條的檢測［22］，不僅能簡便、低成本地制造模具，而且可以實現(xiàn)新產(chǎn)品開發(fā)過程中的設(shè)計和功能的驗證，簡化了復雜系統(tǒng)在有限空間里的可制造性和可裝配性檢驗。

本研究以北京華安麥科生物技術(shù)有限公司的4種毒素快檢試紙的尺寸為參考，設(shè)計基于快檢試紙條的陣列裝置。利用3D打印技術(shù)構(gòu)建適配于試紙的陣列裝置，可實現(xiàn)多真菌毒素平行同步快速檢測，為口岸糧食篩查和快速通關(guān)提供切實可行的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaOH、乙腈、無水乙醇等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；去離子水，杭州娃哈哈集團有限公司；聚乳酸（直徑1.75 mm），珠海京天樂購科技有限公司；黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A 以及玉米赤霉烯酮快速檢測試紙條均為北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。真菌毒素標準品包括黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮，青島普瑞邦生物工程有限公司。玉米、玉米面、麥仁、花生、燕麥、薏仁、小麥、大米糧食樣品采購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

Vortex 2 渦旋混勻儀，德國IKA 公司；5804R 離心機，德國艾本德股份公司；ST3100 實驗室pH 計，美國奧豪斯儀器有限公司；Z603S 工業(yè)高精度3D 打印機，深圳市極光爾沃科技股份有限公司；榮耀30智能手機，中國華為技術(shù)有限公司；MZ-4000 樣本前處理一體機，山東美正生物科技有限公司；KJ-120 快速檢測工具箱，山東美正生物科技有限公司。

1.3 試紙陣列裝置的設(shè)計與打印

3D 建模由AutoCAD 2018 軟件完成；3D 打印由極光爾沃Z603S 工業(yè)高精度3D 打印機結(jié)合控制軟件Cura-15.02.1 完成，其主要參數(shù)設(shè)置為：填充密度為20%、打印速度為30 mm/s、噴頭溫度為200 ℃、熱床溫度為50 ℃，其他參數(shù)保持初始設(shè)定。

1.4 臥式陣列裝置的設(shè)計與條件優(yōu)化

設(shè)計了一種臥式同步快檢側(cè)流層析試紙陣列裝置，陣列裝置由兩部分組成，試紙陣列板a與寬度、承重均合適的樣液盒b 相匹配（圖1 A）。如圖1 B 裝置的三視圖所示，試紙陣列板a 設(shè)有至少1 條穩(wěn)固槽道，槽道寬度略寬于試紙條，穩(wěn)固槽道前端封閉，末端開口，用于插入試紙條，試紙條的吸水墊插入并固定在穩(wěn)固槽道前端，試紙條的樣品墊懸掛在穩(wěn)固槽道外；樣液盒b 四周封閉且上部開口，內(nèi)部沿長度方向具有由高至低的坡道，坡道的底部用于存放樣品液，坡道底部上方設(shè)有長方體擋塊，用于穩(wěn)固插入試紙條的樣品墊端。

當臥式試紙陣列裝置處于測試工作狀態(tài)時（圖1 A-C），多條試紙條的吸水墊固定在陣列板穩(wěn)固槽道前端，移動試紙陣列板，多條試紙條的樣品墊沿所述坡道下滑，對應(yīng)插入所述樣液盒底部的樣品液中，實現(xiàn)試紙陣列中所有試紙條完全同步上樣。

在使用裝置時發(fā)現(xiàn)，4 種樣液混合后，金標探針的稀釋倍數(shù)增大，不符合單條試紙線性規(guī)律的應(yīng)用要求，如增加金標探針的用量，經(jīng)濟成本過大；同時AFB1、ZEN、OTA、DON 等4 種毒素試紙所需最適緩沖體系的pH值區(qū)間分別為8、7～8、8～9、6～7，當4種緩沖液混合，緩沖體系的差異將干擾試紙的層析效果。為解決以上應(yīng)用中存在的問題，對臥式同步快檢側(cè)流層析試紙陣列裝置的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。根據(jù)目前使用需求，槽道設(shè)置為4 條，在樣液盒b 內(nèi)添加隔板，形成4 個均勻的隔檔，使4 種緩沖體系保持獨立狀態(tài)，隔檔與槽道一一對應(yīng)，供試紙插入。具體尺寸如圖1 C所示。打印成品圖以及應(yīng)用情況如圖1 D所示，成本核算如表1所示。

表1 試紙陣列裝置3D打印的成本核算Table 1 Cost accounting of 3D printing of strip array device

1.5 立式陣列裝置的設(shè)計與條件優(yōu)化

設(shè)計了一種立式同步快檢側(cè)流層析試紙陣列盒（圖2A），包括陣列檢測盒和推手。如圖2B 所示，陣列檢測盒的下部為封閉的樣液儲蓄盒，用于存放樣品液；陣列檢測盒的上部具有與樣液儲蓄盒連通的進樣口及至少1條穩(wěn)固槽道；陣列檢測盒的上部兩外側(cè)具有滑道；推手包括主橫桿和兩側(cè)的豎桿，主橫桿內(nèi)側(cè)具有夾道，用于固定試紙條吸水墊端；豎桿的內(nèi)側(cè)具有與滑道匹配的楔形滑柱，滑柱可沿滑道滑動。當滑柱沿滑道滑動至底部時，滑柱與錐形結(jié)構(gòu)以楔形吻合的方式固定。

為解決本文“1.4”中提出的問題，對立式同步快檢側(cè)流層析試紙陣列盒的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。根據(jù)目前使用需求，槽道設(shè)置為4 條，除去樣液儲蓄盒左側(cè)的加樣通道，將槽道對應(yīng)的樣液儲蓄盒分成4個儲蓄分盒，達到4種緩沖體系加入后互不干擾的狀態(tài)。具體尺寸如圖2 C 所示。打印成品圖以及應(yīng)用情況如圖2 D所示，成本核算如表1所示。

當立式試紙陣列裝置處于測試工作狀態(tài)時（圖2 A-C），多條試紙條的吸水墊端固定在推手的夾道內(nèi)。加樣時所有試紙均不接觸樣液，加樣完成后，借助推手將所有試紙的樣品墊端一起推入樣液儲蓄盒，實現(xiàn)試紙陣列中所有試紙條完全同步上樣。

1.6 4種毒素試紙的性能驗證

預(yù)先用乙腈配制0.1 mg/m?AFB1、ZEN、OTA、DON 標品溶液，用PBS（10 mmol/?，pH 7.4）進行稀釋。AFB1 的質(zhì)量濃度依次為0、0.1、0.5、1、2、3 ng/m?；ZEN 的質(zhì)量濃度依次為0、1、10、25、50、60、70、80、100 ng/m?；OTA 的質(zhì)量濃度依次為0、1、10、20、40、60、80、100、120、200、300 ng/m?；DON 的質(zhì)量濃度依次為0、10、50、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、15 000、18 000 ng/m?。

最佳試驗條件下，將金標抗體、200 μ?不同質(zhì)量濃度的毒素標品溶液與相應(yīng)試紙緩沖液的混合液（V標品液∶V稀釋液=1∶5），在室溫下孵育5 min，然后將試紙條插入進行層析，靜等25 min 目測讀取試驗結(jié)果，并利用智能手機采集結(jié)果圖像，采用Image J 軟件（http：//cnij.imjoy.io/）對圖像結(jié)果進行灰度分析。以公式?OD=`x+3s（`x為對11個空白樣品的測試均值，s為測試的標準偏差）計算得到方法的檢測限。以T區(qū)消線的毒素濃度作為試紙最高檢出限的判定標準。

1.7 4種毒素試紙的特異性驗證

評定4 種試紙條在4 種毒素間的特異性。分別配制質(zhì)量濃度為5、120、400、6 400 ng/m?的AFB1溶液、ZEN 溶液、OTA 溶液和DON 溶液待用。用AFB1試紙緩沖液、ZEN 試紙緩沖液、OTA 試紙緩沖液、DON 試紙緩沖液對4 種毒素溶液分別進行稀釋混合5 min（V毒素溶液∶V稀釋液=1∶5）。取混合液200 μ?，用試紙條進行特異性試驗，25 min 后目測讀取試驗結(jié)果，并利用智能手機采集結(jié)果圖像，采用Image J軟件對圖像結(jié)果進行灰度分析。

1.8 實際樣品的檢測

1）選取玉米、玉米面、麥仁、花生、燕麥、薏仁、小麥、大米8 種糧食樣品，利用試紙及陣列裝置進行4種毒素的檢測分析。糧食樣品前處理：稱取5.0 g 糧食樣品均質(zhì)，過孔徑0.85 nm 篩網(wǎng)，加入12 m?50%乙醇-水溶液，充分振蕩混合（150 r/min，3 min），離心（4 000 r/min，5 min），除去沉淀，吸取上清液待用。用AFB1試紙緩沖液、ZEN試紙緩沖液、OTA試紙緩沖液、DON試紙緩沖液對上清液進行稀釋混合5 min（V上清液∶V稀釋液=1∶5）。取混合液200 μ?，用試紙條進行實際樣品檢測試驗，25 min 后目測讀取試驗結(jié)果，并利用智能手機采集結(jié)果圖像，采用Image J 軟件對圖像結(jié)果進行灰度分析。

2）玉米、玉米面、麥仁樣品的加標檢測。AFB1的加標質(zhì)量濃度分別為0、0.1、1 ng/m?；ZEN 的加標質(zhì)量濃度分別為0、1、10 ng/m?；OTA 的加標質(zhì)量濃度分別為0、10、100 ng/m?；DON 的加標質(zhì)量濃度分別為0、10、100 ng/m?。分別用AFB1 試紙緩沖液、ZEN 試紙緩沖液、OTA 試紙緩沖液、DON 試紙緩沖液對加標糧食上清液進行稀釋混合5 min（V上清液/V稀釋液=1∶5）。取混合液200 μ?，用試紙條進行實際樣品加標檢測實驗，25 min 后目測讀取試驗結(jié)果，并利用智能手機采集結(jié)果圖像，采用Image J 軟件對圖像結(jié)果進行灰度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陣列裝置的使用效果

首先由7 名獨立評價員在相同試驗環(huán)境以及規(guī)定時間內(nèi)，分別使用臥式、立式2種陣列裝置，對同一批次的試驗樣品（均為陰性樣品），進行完整的檢測操作，并對裝置的使用效果進行描述性檢驗評價。由2 種裝置的特征可知，臥式陣列裝置具有易操作、靈活性強、重復利用性高、暴露性高、易受污染等特點，因其良好的操作性以及重復利用性，更適用于實驗室環(huán)境的檢測；立式陣列裝置具有操作性欠佳、體積小、輕便、密閉性好、重復利用性低等特點，因其輕便以及密閉性佳更適用于現(xiàn)場檢測。其次從簡單描述檢驗結(jié)果中選取易操作性、靈活性、重復利用性、便攜性以及現(xiàn)場適用性等5種特征進行定量評價，與普通膠體金試紙檢測方法的特征進行比較，討論制定統(tǒng)一標尺，特征強度指標為1～9 分（由弱至強），由7 名評價員獨立進行評定，試驗結(jié)果如圖3 所示。評定結(jié)果與簡單描述檢驗相符，可知，臥式陣列裝置具有突出的可重復利用性能，立式陣列裝置便攜性強，更適合于現(xiàn)場檢測。由于檢測方法的性能以及特異性驗證在實驗室環(huán)境中進行，同時考慮到重復利用性能以及靈活性，故選擇臥式陣列裝置進行后續(xù)試驗。

2.2 4種毒素免疫層析試紙的分析性能

為便于操作，將4種毒素試紙采用統(tǒng)一的測試條件，測定了一系列不同質(zhì)量濃度毒素標準溶液，確定4 種試紙的最高檢出限值、檢測限、線性范圍。AFB1、ZEN、OTA、DON 試紙結(jié)果如圖4 所示，隨著毒素濃度不斷增大，T 區(qū)顯色逐漸變淺甚至消失，當AFB1、ZEN、OTA、DON 質(zhì)量濃度分別高達3、100、300、18 000 ng/m?時，T 區(qū)顏色消失。因此，此時質(zhì)量濃度為各毒素試紙的最高檢出限值。AFB1、ZEN、OTA、DON 試紙的檢測限分別為0.031、0.19、0.78、0.22 ng/m?，線性范圍分別為0.1～3、1～100、1～300、10～18 000 ng/m?。

2.3 4種毒素免疫層析試紙?zhí)禺愋?/h3>

分別以5、120、400、6 400 ng/m?的AFB1 溶液、ZEN 溶液、OTA 溶液和DON 溶液進行特異性試驗，以驗證本方法對毒素的選擇性。非特定毒素不能被抗體特異性識別并結(jié)合，因而不能與固定在T 區(qū)的毒素包被原競爭結(jié)合金納米標記抗體，抗體被毒素包被原捕獲，T區(qū)顯色；反之，目標物與抗體結(jié)合的親和力越高，結(jié)合在T 區(qū)的抗體越少，顯色越淺。試驗結(jié)果如圖5 所示，非特定毒素試紙的T 區(qū)均顯色較深，特異性識別結(jié)果好。綜上所述，4 種毒素試紙具有良好的選擇性，可以實現(xiàn)對樣品中毒素的特異性準確檢測。

2.4 實際樣品檢測

1）糧食樣品檢測。在當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場購買糧食樣品后，在現(xiàn)場利用MZ-4000 樣本前處理一體機以及KJ-120 快速檢測工具箱進行樣品前處理，然后采用所構(gòu)建的臥式同步快檢側(cè)流層析試紙陣列裝置以及4 種毒素試紙檢測了玉米、玉米面、麥仁、花生、燕麥、薏仁、小麥、大米等8類糧食樣品的毒素污染情況，檢測結(jié)果如表2 所示。結(jié)果顯示，8 種糧食樣品均受到了輕微的AFB1 毒素污染，其中玉米面的污染量最大，為0.045 ng/m?；除去麥仁和大米，其他糧食樣品均受到了不同程度ZEN毒素的污染，玉米和小麥污染情況相對嚴重，但污染量級均小于國家標準；花生、燕麥、薏仁、小麥、大米受到了OTA 毒素（＜1 ng/m?）的污染；玉米和大米受到輕微污染外，小麥樣品受到了DON 毒素的嚴重污染，量級超過國家限量，分析原因為存儲不當，在潮熱的環(huán)境中敞口放置過久導致霉菌繁殖產(chǎn)生大量毒素。

表2 谷物中4種毒素的檢測結(jié)果Table 2 Test results for four toxins in grain ng/m?

2）加標糧食樣品的檢測。對最易同時受到4 種毒素污染的玉米、玉米面、麥仁樣品進行加標回收試驗，以驗證本方法的準確性和實際樣品檢測能力。樣品中分別加入不同質(zhì)量濃度（0、0.1、1 ng/m?）的AFB1、（0、1、10、100 ng/m?）的ZEN、（0、1、10、100 ng/m?）的OTA、（0、10、100、1 000 ng/m?）的DON。測定4 種毒素含量，試驗結(jié)果如表3 所示。玉米、玉米面和麥仁樣品的回收率分別為77.3%～107.3%、76.1%～112.4%和74.4%～96.3%。結(jié)果表明，陣列裝置以及試紙可以應(yīng)用于玉米、玉米面、麥仁樣品中4種毒素的檢測。

表3 4種毒素試紙對3種加標糧食樣品的檢測結(jié)果Table 3 Results of detection for three kinds of spiked grain samples by four kinds of toxin test strip

3 討論

傳統(tǒng)的真菌毒素膠體金試紙可通過肉眼觀察檢測區(qū)的信號對目標物進行定性分析，在定量檢測方面仍待完善。為提高其檢測通量，研究人員開發(fā)了具有多條檢測線的快檢試紙，多條通路間的干擾難以避免，時間上同步的檢測效果仍未實現(xiàn)。利用3D打印技術(shù)設(shè)計并構(gòu)建小型陣列裝置，將多條不同目標物的試紙集成為一體，對樣品同時層析進行檢測，可避免上述問題，達到高通量同步快速檢測的目的，有助于同時監(jiān)測多種真菌毒素的污染狀況，保障糧食品質(zhì)，提高口岸糧食篩查的效率。

本研究開發(fā)新型陣列裝置用于準確、快速、現(xiàn)場檢測糧食谷物中的AFB1、ZEN、OTA、DON，實現(xiàn)一步同時側(cè)流層析檢測。設(shè)計目標有以下幾點：（1）設(shè)計并構(gòu)建裝置，達到多條側(cè)流層析試紙同時進行層析的效果，裝置便攜且易于推廣；（2）裝置由尺寸匹配的兩部分組成，兩部分可以組合或連接的方式搭配進行使用；（3）裝置的一部分以多條槽道及夾層的形式用于固定試紙的吸水墊端；（4）裝置的第二部分用于收集并儲存樣液；（5）裝置操作簡便，可工廠化批量生產(chǎn)。利用裝置對8 類糧食樣品進行定量檢測與毒素污染情況分析，加標實際樣品的回收率結(jié)果良好，應(yīng)用場景范圍覆蓋常見且易受真菌毒素污染的谷物食品。真正實現(xiàn)了時間同步、平行又互不影響的陣列試紙，保障檢測質(zhì)量的同時提高了效率。研究過程中發(fā)現(xiàn)由于不同毒素試紙所需緩沖體系的pH 值存在較大差異，目前尚未找到一種同時適合4種毒素檢測環(huán)境的緩沖體系以進一步簡化操作流程，有待進一步探究。本研究中設(shè)計的陣列裝置通過真空塑封，與不同試紙組合，可發(fā)展為一次性產(chǎn)業(yè)化商品，為廣闊的市場提供方案支持。同時，此方法可拓展應(yīng)用于其他種類分析物的同步快檢。