ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41的制備及其在豇豆農藥固相微萃取中的應用

崔瑞霞，向孝哲，孫鑫，張小帆，李秀娟

華中農業(yè)大學食品科學技術學院/環(huán)境食品學教育部重點實驗室/果蔬加工與品質調控湖北省重點實驗室，武漢430070

豇豆（Vigna unguiculata（?.）Walp.）含有豐富的高品質植物蛋白、膳食纖維、維生素、礦物質等多種營養(yǎng)物質［1］，深受消費者喜愛。豇豆是一種花果同期的作物，在生長過程中極易受到雜草、昆蟲和病毒的侵害，為了提高品質和產量，不得不使用農藥。若農藥使用不當，會導致豇豆中農藥殘留甚至含量超標，對人體造成危害。由于農藥的種類多樣，相對分子質量、分子結構和極性均差異較大，對果蔬農藥殘留檢測造成極大阻礙。固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）是目前常用的果蔬農藥殘留檢測的前處理技術［2］，具有操作簡單、無溶劑、快速、靈敏等優(yōu)點。但目前用于農藥殘留檢測的SPME 涂層大多對非極性、弱極性和中極性農藥的萃取效果較好，對于強極性農藥，涂層的萃取能力還遠遠不夠。

親水親脂平衡（hydrophilic-lipophilic balance，H?B）顆粒是一種具有高表面積特征的介孔聚合物，是由二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB）和N-乙烯基吡咯烷酮（N-vinylpyrrolidone，NVP）聚合而成，其中DVB作為疏水交聯(lián)單體可以形成具有高內表面積的骨架吸附非極性化合物，NVP 作為親水單體可以增強與極性分析物的相互作用［3］。H?B 顆粒的親水親脂特性，使其作為一種新型吸附劑被廣泛使用，越來越多的研究也通過將H?B 顆粒粘合在SPME 萃取頭表面，用于從基質中同時萃取非極性和極性化合物，從而實現(xiàn)多組分的測定［4］。研究表明，增大聚合物DVB-co-NVP 中NVP 的比例可以增強聚合物對極性物質的吸附能力［5］，為了進一步增加H?B 顆粒的極性，有必要引入極性更強的功能單體。筆者所在實驗室前期工作也表明，引入甲基丙烯酸可以增加H?B材料對極性物質的萃取效果［6］。

MCM-41 是一類新型介孔硅材料，具有較強的熱穩(wěn)定性、較大的比表面積（700～1 500 m2/g）、六方單維蜂窩狀的孔道結構、均一且可調的孔徑（1.5～20 nm）和大孔隙（＞0.6 cm3/g）等特點［7］，常被作為吸附劑使用［8］。因此，推測在使用極性單體與DVB-co-NVP聚合的同時引入MCM-41介孔硅可能會在增強聚合物極性的同時增大聚合物的比表面積，從而增強對極性和非極性目標物的同時萃取能力。

滅多威、克百威和滅蠅胺在豇豆農藥殘留檢測中經常出現(xiàn)檢出或超標現(xiàn)象［9-10］。滅蠅胺（logP=-0.04）和滅多威（logP=0.60）的極性較強，使用SPME 方法檢測的文獻很少。因此，本研究以DVB、NVP 和4-丙烯酰嗎啉（ACMO）為功能單體，在MCM-41 介孔硅微球表面聚合，得到ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 新材料；將該材料作為SPME 涂層材料，制備萃取頭，利用直接固相微萃取法（direct immersion-SPME，DI-SPME）結合氣相色譜-氮磷檢測器（gas chromatography-nitrogen phosphorus detector，GC-NPD）建立豇豆中3 種農藥殘留的分析方法，以滿足豇豆中常見極性農藥的檢測需求，旨在為豇豆中多農藥殘留的準確跟蹤定量分析提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆購買于湖北省武漢市洪山區(qū)獅子山街道農貿市場。甲醇、無水乙醇、甲苯、乙腈、無水硫酸鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；商用聚二甲基硅氧烷（PDMS）膠購自美國道康寧公司；DVB 為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-VP、4-丙烯酰嗎啉（ACMO）均為分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司；偶氮二異丁腈［2，2'-azobis（2-methylpropionitrile），AIBN］購自天津市光復精細化工研究所；waters Oasis H?B 固相萃取小柱（3cc/60 mg，30 μm）購自杭州倍嘉儀器儀表商行。滅多威（methomyl，99.0%）、克百威（carbofuran，98.6%）、滅蠅胺（cyromazine，98.1%）購自上海農藥所。試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

SP-7820 型氣相色譜儀（配置氮磷檢測器，NPD），山東魯南瑞虹化工有限公司；N2000 色譜數據工作站，浙江大學智達信息工程有限公司；OV-1701 毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.33 μm），蘭州中科安泰分析科技有限公司；CT-1 A 型氮氫空氣發(fā)生器，武漢科林普豐儀器有限公司；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，武漢德力祥儀器設備有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SU-8010 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，天美科學儀器有限公司；IS50 型傅立葉紅外光譜儀，蘇州奧普斯等離子體科技有限公司；TG209C 型熱分析儀，德國耐馳儀器制造有限公司；ASAP 2460 型比表面與孔隙度分析儀，中國Agilent Technologies 公司。商用聚丙烯酸酯萃取頭（PA，85 μm），美國Supelco 公司。實驗室自制Oasis H?B 萃取頭（85 μm）參考文獻［6］制備。不銹鋼絲（直徑150 μm），深圳寶芳金屬材料店。

氣相色譜條件。以高純氮氣為載氣，柱頭壓0.055 MPa，空氣0.035 MPa，氫氣0.030 MPa，尾吹氣0.045 MPa，不分流。銣珠電流2.29 A。柱爐程序升溫：初始溫度160 ℃，以2 ℃/min 升溫至170 ℃，以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min。進樣口溫度280 ℃，NPD檢測器溫度290 ℃。

1.3 涂層材料的制備

1）MCM-41 微球的制備。采用水熱法合成MCM-41微球，具體步驟參考文獻［11］。

2）ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 材 料 的制備。向三口燒瓶中加入45 m?乙腈和15 m?甲苯（V∶V=3∶1）混合并用氮氣吹掃30 min。將DVB、N-VP 和ACMO 按物質的量為3∶1∶0.83 的比例加入到混合溶劑中，再加入15.00 mg AIBN作為引發(fā)劑同時加入0.60 g MCM-41 微球。置于70 ℃油浴鍋中通過熱引發(fā)進行自由基聚合反應，并在600 r/min 的條件下持續(xù)攪拌反應24 h。反應結束后抽濾，收集反應混合物。將該混合物用大量蒸餾水和乙醇洗滌后，在80 ℃下真空干燥24 h，即得ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41材料。

1.4 萃取頭的制備

不銹鋼絲處理具體步驟參考文獻［12］。使用商用PDMS 膠作為粘合劑，采用直接粘合法［6］制備ACMO-co-DVB-co-NVP（85 μm）、MCM-41（85 μm）和ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41（85 μm）萃取頭。將涂覆完成的萃取頭置于干燥器中干燥12 h，安裝在SPME 裝置中，首次使用前在氮氣保護下于GC進樣口老化2 h，老化溫度為280 ℃。

1.5 溶液的配制

用甲醇分別配制滅多威、克百威、滅蠅胺農藥母液，質量濃度為20.00 mg/?，在-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用甲醇稀釋母液制?.00 mg/g 的混合標準溶液1 用于不同萃取頭萃取能力比較試驗以及10.00 mg/g 的混合標準溶液2 用于萃取條件的優(yōu)化試驗。另外配制一系列濃度的混標用于線性范圍和加標回收率測定。

1.6 SPME操作

試驗前分別采用單一的農藥標準品和混合標準品對分析物進行定性；試驗過程中通過直接進樣混合標準品和水中DI-SPME/GC-NPD 確認分析物以及檢查儀器的穩(wěn)定性。

1）水中DI-SPME 操作。取10 μ?農藥混標1 加入裝有9 m?超純水的10 m?萃取瓶中，加入磁力攪拌子并封蓋，將SPME 裝置的不銹鋼管直接插入加標樣品中，推出萃取頭，在溫度為40 ℃、轉速為600 r/min的條件下萃取30 min，萃取完成后，將萃取頭抽回不銹鋼管內，用無塵紙小心拭去萃取頭與鋼管連接處的水滴，于280 ℃GC 進樣口解吸10 min。所有試驗平行操作3次，結果取平均值。

2）豇豆勻漿DI-SPME 操作。按照豇豆∶超純水=1∶1 的質量比例打漿后裝入錐形瓶，按每2 g 豇豆勻漿添加10 μ?農藥混標的比例加標，于搖床振蕩40 min 混勻，在4 ℃冰箱中放置12 h 后使用。取10 g豇豆勻漿于10 m?萃取瓶中，添加質量分數12.5%的無水Na2SO4，加入磁力攪拌子并封蓋，將SPME裝置的不銹鋼管直接插入加標樣品中，推出萃取頭，在溫度為90 ℃、轉速為1 200 r/min 的條件下萃取60 min。解吸前的快速漂洗和解吸后的清洗能夠有效去除萃取頭表面吸附的雜質而不會造成分析物的明顯損失［13］。因此，萃取完成后，將萃取頭于甲醇∶超純水（V∶V=1∶9）中快速漂洗5 s，用無塵紙將萃取頭表面殘留的溶劑拭干，隨后在280 ℃的GC 進樣口解吸10 min，解吸后使用甲醇∶丙酮（V∶V=1∶1）混合溶劑清洗1 min，使用無塵紙小心擦拭涂層表面，然后在280 ℃下老化5 min，即可進行下一次萃取。所有試驗均重復3次，結果取平均值。

1.7 數據處理

所得數據采用Excel 軟件進行分析，采用Origin軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 材料的表征

1）微觀形貌。圖1 為MCM-41 和ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41材料的掃描電鏡圖。從圖1可以看出，MCM-41 材料呈橢球狀或球狀，其粒徑在0.4 μm 左右，該微球表面光滑，無明顯團聚現(xiàn)象；ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 是一種球狀材料，粒徑也在0.4 μm 左右，但其表面不光滑，有明顯凸起，微粒之間存在一定的團聚現(xiàn)象，分散不均勻，且有不同粒徑的顆粒存在，說明MCM-41微球表面修飾有ACMO-co-DVB-co-NVP 聚合物，而且因為聚合物導致了微球團聚，這種團聚現(xiàn)象與文獻［14］一致。

2）結構組成。圖2 為MCM-41 和ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 材料的紅外光譜圖。其中468 cm-1、796 cm-1是Si-O-Si 基團的彎曲振動峰和對稱拉伸振動峰，955 cm-1為Si-OH 的不對稱拉伸振動峰，3 435 cm-1是O-H 的伸縮振動峰［15-16］。此外，由于Si-O-Si 基團的不對稱拉伸振動，在約1 090 cm-1處出現(xiàn)了1 個強峰，該峰與聚合物上ACMO 鏈中C-O-C 基團的吸收帶重疊［17］。在ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 材料的譜圖中，2 857 cm-1、2 929 cm-1處為共聚物中C-H 的拉伸振動峰，1 509 cm-1處為DVB 芳環(huán)中C=C 彎曲振動峰，1 445 cm-1處為NVP 鏈上C-N 伸縮振動峰［18-19］，1 650 cm-1附近為NVP 和ACMO 結構中羰基的特征峰。由此，我們認為ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41材料成功聚合。

3）熱穩(wěn)定性。由圖3 可知，該材料在350 ℃左右開始分解，可以滿足GC分析檢測的需求。

4）N2-物理吸附脫附分析。由N2-物理吸附脫附測得，ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 材料的比表面積為605.26 m2/g，孔徑為2.58 nm。

2.2 萃取能力比較

為評價ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 萃取頭的萃取能力，采用水中DI-SPME 方法，選擇自制Oasis H?B 萃取頭、ACMO-co-DVB-co-NVP 萃取頭、MCM-41 萃取頭和商用PA 萃取頭與該萃取頭進行比較。以自制ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 萃取頭對分析物的萃取峰面積為100%，另外4 種萃取頭的萃取峰面積進行相應計算（表1）。由表1可知，ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 對3 種農藥的萃取效果比單獨使用MCM-41 和ACMO-co-DVB-co-NVP 都好，表明兩者的結合可以增大材料的吸附性能；與Oasis H?B 相比，ACMO-co-DVBco-NVP 對滅蠅胺和克百威的萃取量增加，而對滅多威的萃取效果不好，說明ACMO 可能增強對含有雙鍵共軛體系化合物的萃取能力，而且對極性更強的滅蠅胺增強效果極為顯著；PA 萃取頭是最適合萃取極性物質的商用涂層，對3種農藥的萃取效果依然很好，但是沒有ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 萃取頭好。

表1 5種萃取頭的峰面積比較Table 1 Comparison of peak areas of the five fibers

還比較了ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取頭和自制Oasis H?B萃取頭的萃取覆蓋能力，選取不同極性的分析物包括樂果（logP=1.32）、避蚊胺（logP=1.96）、甲苯（logP=2.68）、鄰苯二甲酸二乙酯（logP=2.7）、多效唑（logP=2.99）、對二甲苯（logP=3.14）、鄰苯二甲酸二戊酯（logP=5.89）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（logP=8.71）等，結果表明ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 萃取頭對這些物質的萃取效果優(yōu)于Oasis H?B 萃取頭，萃取量為Oasis H?B 萃取頭萃取量的1.12～1.57 倍。由此可見，ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 萃取頭初步展現(xiàn)了寬的分析物覆蓋能力和對極性物質的高萃取能力。

2.3 萃取條件優(yōu)化

1）攪拌速度。從圖4（DI-SPME 條件：萃取時間，40 min；萃取溫度，40 ℃；不加鹽）可以看出，隨著攪拌速度的增加，3 種農藥的萃取峰面積整體上呈增大趨勢，在攪拌速率為1 200 r/min 時的萃取峰面積最大。可能是攪拌速度增加加快了分子的運動，使萃取頭在相同時間內可以接觸更多的目標物，從而增加萃取頭對農藥的萃取量。

2）萃取溫度。由圖5（DI-SPME 條件：萃取時間，40 min；攪拌速度，1 200 r/min；不加鹽）可知，隨著溫度的升高，3 種農藥的萃取量均呈先增加后減少的趨勢，滅多威和滅蠅胺的萃取量在90 ℃時達到最大值，克百威的最佳萃取溫度為80 ℃?？赡苁禽腿囟壬呒涌炝四繕宋锏臄U散速率，有利于提高萃取能力和縮短萃取時間；但溫度太高會減小目標物在涂層與基質之間的分配系數，降低萃取頭的萃取效果。綜合考慮，后續(xù)試驗選擇90 ℃萃取。

3）萃取時間?？疾炝?0～70 min內，萃取時間對基質中目標物萃取量的影響。從圖6（DI-SPME 條件：萃取溫度，90 ℃；攪拌速度，1 200 r/min；不加鹽）可以看出，在萃取時間為30～60 min 內3 種目標物萃取量逐漸增加；在60～70 min 內，隨著萃取時間的增加，目標物的萃取量逐漸減少，可能是萃取時間太長導致前期被萃取頭吸附的目標物又重新進入基質中，從而使萃取量減少。后續(xù)試驗選擇60 min 作為最優(yōu)萃取時間。

4）離子強度。如圖7（DI-SPME 條件：萃取時間，60 min；萃取溫度，90 ℃；攪拌速度，1 200 r/min）所示，隨著Na2SO4的增大，滅多威和克百威的萃取量逐漸增加；滅蠅胺的萃取量呈先增加后降低的趨勢，在Na2SO4為12.5%時達到最大。加鹽除了會使分析物發(fā)生鹽析作用外，鹽離子與分析物之間還會發(fā)生靜電相互作用，當鹽析作用大于靜電作用時，物質的溶解度降低，會使萃取量增大；當靜電作用大于鹽析作用時，會增大物質的溶解度，從而降低萃取量。為了提高靈敏度，選擇添加質量分數為12.5%的無水Na2SO4進行后續(xù)試驗。

2.4 方法的建立與評價

采用外標法定量，以甲醇配制不同質量濃度的系列農藥標準溶液，在優(yōu)化的條件下，以加標濃度為橫坐標、峰面積平均值為縱坐標，分別制作3 種農藥的定量標準曲線。如表2 所示，3 種農藥在各自線性范圍內的線性關系良好，決定系數均大于0.995 7，檢出限（?OD）1.71～18.79 μg/kg，均低于豇豆中農藥最大殘留限量標準（GB 2763—2021），定量限（?OQ）為5.71～62.63 μg/kg。通過加標回收率來驗證方法的準確性，結果如表3 所示，3 種農藥的加標回收率為84.4%～116.1%，相對標準偏差為2.2%～7.5%，說明該方法具有較好的準確性和精密度。

表2 3種農藥的線性關系、檢出限、定量限和相對標準偏差（n=5）Table 2 Linear ranges，limits of detection，limits of quantification and RSDs of 3 pesticides（n=5）

表3 3種農藥在豇豆勻漿中的加標回收率和相對標準偏差（n=3）Table 3 Recoveries and RSDs of 3 pesticides in cowpea pulp（n=3）

2.5 實際樣品分析

采用建立的DI-SPME/GC-NPD 方法隨機檢測從農貿市場購買的豇豆中3 種農藥的含量。結果顯示，該豇豆中滅多威、克百威和滅蠅胺均未檢出。該萃取頭性質穩(wěn)定，在豇豆基質中使用60次以上萃取能力沒有顯著變化。圖8為空白豇豆樣品和加標豇豆樣品的色譜圖（出峰順序和加標濃度為：1，滅多威，5.00 μg/g；2，克百威，0.10 μg/g；3，滅蠅胺，5.00 μg/g）。

將本研究所建立的分析方法與已報道的測定農藥的一些研究方法進行比較。如表4所示，該方法的?OD 低于分散固相萃?。╠ispersive solid-phase extraction，DSPE）、QuEChERS、快速極性農藥萃?。╭uick polar pesticides extraction，QuPPe）等方法所測的?OD，且本試驗前期無需復雜程序、無需大量溶劑，更加簡便快捷，可以應用于豇豆中農藥殘留的檢測。

表4 本方法與其他方法的對比Table 4 Comparison of this method with other methods

3 討論

本研究合成了ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41新材料，使用直接粘合法制備了SPME涂層。該涂層性能穩(wěn)定，在豇豆勻漿中使用60次后萃取能力無明顯變化。通過不同萃取頭萃取能力比較的結果表明，該萃取頭對極性不同的分析物具有較好的萃取覆蓋能力，而且對極性物質的萃取能力比H?B涂層更強?？赡茉蚴峭繉又蠱CM-41 的引入增加了材料的比表面積從而增大了萃取量，ACMO 增強了涂層的極性從而增強了對極性物質的吸附能力。該涂層可以擴大SPME 方法的應用范圍，在多組分和非目標物分析方面有很好的應用前景。后期還需要增加更多的極性和結構不同的物質對其萃取性能進行評價。

本研究應用ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 萃取頭，采用DI-SPME 法與GC-NPD 聯(lián)用，建立了豇豆中滅多威、克百威和滅蠅胺3種農藥的檢測方法。目前果蔬農藥殘留檢測的前處理技術主要有固相微萃取、固相萃取、QuEChERS 技術等。SPME 的萃取原理是萃取頭涂層對分析物的吸附作用。但由于萃取頭材料性質的影響，限制了SPME 技術在檢測極性農藥方面的應用。用于萃取弱極性和中等極性農藥的涂層很多，但是能萃取滅蠅胺、滅多威等強極性農藥的涂層很少。為了萃取這些強極性的農藥，同時也能用于其他農藥的分析，本研究制備了ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 萃取頭。本研究建立的方法應用所制備萃取頭檢測滅多威和滅蠅胺的檢出限低于國家標準最大殘留限量，可以滿足豇豆樣品分析檢測的需要?？税偻臉O性較滅多威和滅蠅胺弱，SPME 方法在其檢測方面應用較多，本研究建立的方法對克百威的檢出限雖低于國家標準最大殘留限量，但高于某些文獻的檢出限［24］，因而后續(xù)還可以對該方法進行改進。但與DSPE、QuECh-ERS、QuPPe 等方法相比［20-23］，本方法具有試驗前期無需復雜程序、較低的檢出限、無需大量溶劑等特點，同時SPME 裝置小巧、便于攜帶，若進行原位/活體采樣可以做到基本不干擾機體正常生長代謝，可以為豇豆中多農藥殘留的快速、準確跟蹤定量分析提供新思路和新方法。